CN101455847A - Esat6和cfp10蛋白在制备用于鉴定诊断结核病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及ESAT6和CFP10蛋白在制备用于鉴定诊断结核病的药物中的应用，其特征在于，所述用于鉴定诊断结核病的药物由稀释液及溶于其中的结核变态反应原构成，所述的结核变态反应原采用ESAT6和CFP10混合蛋白。本发明将ESAT6和CFP10蛋白作为结核皮肤变态反应原，用于皮肤试验诊断结核菌感染和活动性结核病。其检测结核菌感染的特异度显著高于PPD皮试法和38kDa蛋白皮试法；灵敏度高于单独应用ESAT6蛋白进行皮试，而且ESAT6和CFP10抗原为基因工程重组蛋白，制备简便、价廉，检测费用较低。

Description

ESAT6和CFP10蛋白在制备用于鉴定诊断结核病的药物中的应用

技术领域

本发明属医学免疫学诊断技术领域，特别涉及结核分枝杆菌ESAT6和CFP10蛋白作为皮肤变态反应原在在制备用于鉴定诊断结核病的药物中的应用。

背景技术

在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核菌耐药问题和非结核分枝杆菌病的发病率逐年上升使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800～1000万，每年死亡人数约300万。1993年世界卫生组织(WHO)史无前例地宣布“全球结核病紧急状态”，1998年又重申遏制结核病的行动刻不容缓。

中国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查初步结果表明，中国有5.5亿人感染了结核菌；现有肺结核病人451万，其中传染性肺结核病人196万；每年死亡人数约13万，结核病死亡在中国各种死亡原因中居第9位，在传染病中居第一位；分离出的分枝杆菌中，结核分枝杆菌占86.4％，牛分枝杆菌占2.5％，非结核分枝杆菌占11.1％，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。因此，结核病的早期诊断、鉴别诊断和流行病学调查对结核病的早期、有效化疗和控制结核菌传播都有极其重要的意义。

旧结核菌素、纯蛋白衍化物(PPD)是结核分枝杆菌培养滤液蛋白，其作用于人体会激发已致敏机体产生细胞免疫反应，激活T淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞，释放大量细胞因子，并使这些细胞增殖、聚集，包裹抗原形成结节，这就是迟发型变态(DTH)反应，其反应强度与细胞免疫呈平行关系。旧结核菌素不易标准化和易发生非特异性反应，目前已经很少使用。PPD皮肤试验已成为目前临床上最常用且最简便的一种结核菌感染诊断方法，反应越强，表示结核感染可能性越大，中国一直使用硬结≥5mm为阳性，≥20mm或有水泡、坏死、淋巴结炎等为强阳性，3岁以下儿童≥15mm为强阳性的标准。但由于PPD中含有许多分枝杆菌(包括致病性分枝杆菌、环境中非致病性分枝杆菌和卡介苗)共同的抗原，PPD皮试阳性并不能鉴别是因为结核分枝杆菌复合群感染，还是接触环境中非结核分枝杆菌或卡介苗接种后造成的致敏。因此，PPD皮试诊断结核菌感染的特异性差，用该方法进行结核病流行病学抽样调查获得的结核菌感染率是不准确的，并不能真正反映人群中结核菌感染的实际状况。目前许多学者都在研究新的抗原作为皮肤变态反应原，以期建立新的结核皮肤诊断试剂。如研究应用38kDa蛋白(又称为Phos蛋白、抗原78、Pab蛋白、抗原5)或6kDa早期分泌抗原靶(6 kDa earlysecretory antigenic target，简称ESAT6)作为皮肤试验的抗原。

38kDa蛋白是脂蛋白，既存在于分枝杆菌细胞内，又分泌于细胞外，是结核分枝杆菌培养滤液中的主要成分之一，其编码序列与大肠杆菌磷酸结合蛋白Phos有51％的同源性。目前的研究已表明天然的38kDa蛋白和重组的38kDa蛋白的免疫原性一致，均可诱导结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌致敏的豚鼠产生DTH反应，缺乏种特异性；38kDa蛋白(抗原5)也可诱导PPD皮试阳性的人体产生典型的DTH反应，但似乎其特异性和敏感性均不如PPD；进一步研究发现38kDa蛋白抗原C末端附近存在一个免疫原性强的T细胞抗原决定簇，其合成多肽38.G(350-369位氨基酸)是结核分枝杆菌复合群特异的，可诱导结核分枝杆菌、BCG致敏小鼠和PPD皮试阳性的健康人产生DTH反应。与PPD相比，合成多肽38.G特异性有所改善，能鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌感染，但依然不能鉴别结核分枝杆菌感染和BCG接种。因此，38kDa蛋白并不是结核病特异的皮肤诊断试剂。

ESAT6蛋白是一种低分子量(6kDa)早期分泌性蛋白，理论上推导的分子量为9,904Da，等电点为pI4.5。但经双向凝胶电泳和免疫印迹转移分析发现该蛋白有两个等电点：pI4和pI4.5，这可能与蛋白质的修饰有关，如酰胺侧链的脱酰胺作用、氧化作用或磷酸化作用。在未变性条件下，凝胶过滤和SDS-PAGE显示其分子量为24kDa，可能是该蛋白的自然构型为多聚体所致；在变性条件下，SDS-PAGE显示其分子量为6kDa；而质谱分析其分子量为9,890±10Da，未发现多聚体形式，说明所形成的多聚体之间的联系可能是非常弱的。它由结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和少数致病性分枝杆菌基因组的RD1区域编码，但所有卡介苗菌株及绝大部分环境分枝杆菌基因组均丢失该区域，不表达ESAT6蛋白。ESAT6蛋白含有多个T淋巴细胞抗原表位，该蛋白或其多肽可作为T细胞刺激抗原，可用作皮肤试验抗原用于诊断结核菌感染、活动性结核病。本发明人曾于2005年3月18日向国家专利局提交过一份名称为“诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂”的发明专利申请，该专利申请于2005年10月19日公开。该试剂用于诊断结核菌感染、活动性结核病灵敏度低。

CFP10是一个由Rv3874基因编码的100个氨基酸的蛋白，其基因位于ESAT6基因的上游，与ESAT6编码基因均位于RD-1区，属于同一个lhp-exe操纵子，由同一个启动子调节转录，两者分布于相同的分枝杆菌中，其基因存在于结核分枝杆菌复合群和少数其他分枝杆菌(如胃、堪分枝杆菌)中，但在BCG所有菌株中均未发现其基因。CFP10计算分子量10,794kDa，SDS-PAGE电泳分子量约10-11kDa。CFP10序列与ESAT6基因有约40％的同源性，其蛋白也属于ESAT6家族的成员之一，两者具有相同的免疫学特性。CFP10蛋白也含有多个T淋巴细胞抗原表位，该蛋白或其多肽均可作为T细胞刺激抗原。

ESAT6蛋白和CFP10蛋白所具有的T淋巴细胞抗原表位不同，不同遗传背景的结核感染者对这两种抗原的反应也不完全相同，一部分结核感染者对这两种抗原的刺激均产生反应，而部分结核感染者只对ESAT6蛋白或CFP10蛋白起反应。单独应用ESAT6蛋白作为刺激抗原，部分结核感染者由于对ESAT6蛋白不反应而造成漏诊。因此，提供一种高灵敏度的用于鉴定诊断结核病的药物就成为本技术领域急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为克服已有技术的不足之处，提供一种ESAT6和CFP10蛋白在制备用于鉴定诊断结核病的药物中的应用，可用于鉴别卡介苗接种者、特异地检测结核菌感染的皮肤诊断变态反应原，用于人类或动物结核菌感染的检测及其使用方法、剂量和判断标准。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

ESAT6和CFP10蛋白在制备用于鉴定诊断结核病的药物中的应用，其特征在于，所述用于鉴定诊断结核病的药物由稀释液及溶于其中的结核变态反应原构成，所述的结核变态反应原采用ESAT6和CFP10混合蛋白。

所述的ESAT6和CFP10蛋白可为天然的ESAT6和CFP10蛋白或通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白。

所述的用于鉴定诊断结核病的药物中的ESAT6和CFP10蛋白终浓度分别为6-15μg/ml。

本发明用于动物的用于鉴定诊断结核病的药物的具体使用方法包括以下步骤：

吸取用于鉴定诊断结核病的药物0.1ml，所述的用于鉴定诊断结核病的药物为每毫升稀释液中的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白浓度分别为6μg—15μg；注射于动物的皮内，如豚鼠的背部、猴子的上眼睑等，于注射后24小时测量、记录注射部位红肿的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应(即有无过敏、水泡等症状)。反应红肿平均直径≥5mm者为阳性反应，其中反应红肿平均直径≥5mm、<10mm者为弱阳性反应，反应红肿平均直径≥10mm、<20mm者为中等阳性反应，凡是反应红肿平均直径≥20mm均属强阳性反应。

本发明用于人体的上述用于鉴定诊断结核病的药物的具体使用方法包括以下步骤：

吸取用于鉴定诊断结核病的药物0.1ml，所述的用于鉴定诊断结核病的药物为每毫升稀释液中的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白浓度分别为6μg—15μg；皮内注射于人的前臂掌侧中央，于注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应(即有无过敏、水泡、淋巴结炎等症状)。反应硬结平均直径≥5mm者为阳性反应，其中反应硬结平均直径≥5mm、<10mm者为弱阳性反应，反应硬结平均直径≥10mm、<20mm者为中等阳性反应，凡是反应硬结平均直径≥20mm均属强阳性反应。

本发明的特点及技术效果：

本发明将ESAT6和CFP10蛋白作为结核皮肤变态反应原，用于皮肤试验诊断结核菌感染和活动性结核病。其检测结核菌感染的特异度显著高于PPD皮试法和38kDa蛋白皮试法；灵敏度高于单独应用ESAT6蛋白进行皮试，而且ESAT6和CFP10抗原为基因工程重组蛋白，制备简便、价廉，检测费用较低。

本发明人研究证明应用ESAT6和CFP10蛋白作为结核变态反应原制备成用于鉴定诊断结核病的药物，可引起结核感染的人体或动物产生免疫应答。该用于鉴定诊断结核病的药物可特异地诱导结核感染者产生迟发型变态反应，可鉴别是BCG接种、环境中非结核分枝杆菌感染后造成的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染，可用于结核菌感染检测、结核病临床诊断和鉴别诊断、机体免疫反应监测。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1是本发明实施例1中pET24b-ESAT6重组质粒的酶切鉴定结果。

图2是本发明实施例1中pET32a-CFP10重组质粒的酶切鉴定结果。

图3是本发明实施例1中重组质粒pET24b-ESAT6 DNA序列分析结果。

图4本发明实施例1中重组质粒pET32a-CFP10 DNA序列分析结果。

图5是本发明实施例1中SDS-PAGE鉴定重组ESAT6在大肠杆菌中的表达。

图6为本发明实施例1中SDS-PAGE鉴定重组CFP10在大肠杆菌中的表达。

图7为本发明实施例1中重组ESAT6蛋白的SDS-PAGE分析结果。

图8为本发明实施例1中不同的诱导温度下CFP10目的蛋白在可溶性蛋白中的含量分析。

图9为本发明实施例1中SDS-PAGE鉴定纯化的重组ESAT6蛋白。

图10为本发明实施例1中重组CFP10蛋白的亲和层析纯化。

图11为本发明对比例2中应用T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检测。

图12为本发明对比例3中应用T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检测。

具体实施方式

实施例1

一、用于鉴定诊断结核病的药物(诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂)的制备：

(一)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白作为结核变态反应原；

1、引物设计与合成

esat6引物设计：

P1(上游)：含限制性内切酶Nhe I位点

5′-GCTAGCAT G ACAGAGCAGCAGTGGAAT-3’

P2(下游)：含限制性内切酶Xho I位点

5’—CTCGAGTGCGAACATCCCAGTGACG-3’

扩增片段：299bp

cfp10引物设计：

P3(上游)：含限制性内切酶Kpn I位点

5’-CGAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAG ATGGCAGAGATGAAGACCGA-3’

P4(下游)：含限制性内切酶EcoR I位点

5’-CGGAATTCTCAGAAGCCCATTTGCGAGG-3’

扩增片段：300bp

2、PCR扩增esat6和cfp10基因

分别用P1、P2和P3、P4引物，在Taq pl μs I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增ESAT6和CFP10基因。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，68℃ 1min，循环30次；最后72℃延伸7min。于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定299bp(esat6)、300bp(cfp10)的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，具体方法如下：

向管中加入等体积的溶胶液(约0.4ml)，直至琼脂糖完全融化；向管中加入0.6ml琼脂糖DNA纯化树脂，充分混匀；将注射器插入微量离心柱拧紧，拔出注射器活塞，将树脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；从微量离心柱上拔掉注射器，拔出注射剂活塞，将注射器插入微量离心柱拧紧，将2ml I型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入150μl II型柱子清洗液，离心1200rpm 2-3min以清洗和干燥树脂；将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入40μl TE缓冲液，静置一分钟，12,000rpm离心20s；回收DNA洗脱液，定量，浓度约为50ng/μl。贮存于-20℃备用。

4、目的基因与pGEM-T载体连接：

参照Promega公司pGEM-T vector System-I产品说明，将50ng纯化后的PCR产物与克隆载体pGEM-T连接，目的基因片段与载体片断按摩尔比3:1混合，10μl反应体系如下：

2×连接缓冲液               5μl

pGEM-T载体                  1μl

PCR产物                     0.6μl

T₄DNA连接酶                 1μl

无菌水  补至                10μl

混匀后置于4℃冰箱反应12h，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.大肠杆菌DH5 α和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：

挑取大肠杆菌DH5 α(或BL21)单菌落接种于5ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度OD₆₀₀为0.6-0.8时，放入用冰预冷的大离心管中，于4℃、4000rpm、离心10min，弃上清；20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，冰浴30min；4℃、6000rpm、离心10min，弃上清；用4ml 0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，置4℃冰箱放置过夜；次晨加入1ml无菌甘油，吹打混合均匀，每100μl分装于一个1.5ml的离心管中，置-70℃保存备用。

6.连接产物的转化：

将目的基因片段与PGEM-T的连接产物各5μl分别加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG 4μl，混匀，取出200μl涂布于含有60μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

7.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落5个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，置37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。

(1)质粒小量提取试剂的配制

溶液I：50mmol/L葡萄糖

       25mmol/L Tris·CL(pH8.0)

       10mmol/L EDTA(pH8.0)

在10lbf/in²(6.895×10⁴Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4℃备用。

溶液II： 0.2mmol/L NaOH，1％ SDS 临用前配制

溶液III：5mol/L乙酸钾  60ml

         冰乙酸        11.5ml

         去离子水      28.5ml

         贮存于4℃，备用。

(2)小量提取质粒

分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12,000rpm离心1min，弃上清；细菌沉淀重悬于200μl溶液I中，冰浴10min；加400μl新配制的溶液II，冰浴5min；加300μl溶液III，冰浴10min；于4℃ 12,000rpm离心10min；上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-20℃放置2h沉淀DNA；于4℃ 12,000rpm离心10min，弃上清；用1ml 70％乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20μl TE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20μg/ml，于37℃水浴30min，消化RNA；取2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置—20℃储存备用。

8.鉴定重组质粒：

(1)PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以相应的引物P1、P2或P3、P4进行PCR扩增，扩增产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，阳性重组质粒命名为PGEM-ESAT6或PGEM-CFP10。

(2)酶切鉴定：取重组质粒PGEM-ESAT6 5μl，分别用限制性内切酶NheI和XhoI双酶切2h；取重组质粒PGEM-CFP10 5μl，分别用限制性内切酶KpnI和EcoRI双酶切2h；于1％琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准及扩增产物为对照，酶切后的片断与扩增片断一致。

(3)序列测定：直接挑选一个克隆送测序。测序结果与报道的基因组序列一致。

9.重组表达质粒的构建：

(1)ESAT6重组表达质粒的构建：用限制性内切酶Nhe I和XhoI双酶切pGEM-ESAT6重组质粒DNA和表达载体pET24b质粒DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳，切取291bp的ESAT6基因片段和5.27kb的pET24b质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，ESAT6基因片段与pET24b质粒DNA片段按2∶1的摩尔比混合，在T₄DNA连接酶催化下，于16℃连接过夜，次日取连接产物5μl转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，置37℃恒温箱孵育14h。挑选4个克隆分别转种于5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，用碱裂解法提取质粒。

(2)CFP10重组表达质粒的构建：用限制性内切酶Kpn I和EcoRI双酶切pGEM-CFP10重组质粒DNA和表达载体pET32a质粒DNA，于1％琼脂糖凝胶中电泳，切取300bp的CFP10基因片段和5.857kb的pET32a质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，CFP10基因片段与pET-32a质粒DNA片段按2∶1的摩尔比混合，在T4DNA连接酶催化下，于16℃连接过夜，次日取连接产物5μl转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，置37℃恒温箱孵育14h。挑选4个克隆分别转种于5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，用碱裂解法提取质粒。

10.重组表达质粒的鉴定

采用双酶切和DNA测序鉴定重组表达质粒；鉴定正确的阳性克隆命名为pET24b-ESAT6(见图1、3)及pET32a-CFP10(见图2、4)。

如图1所示，本发明实施例1中pET24b-ESAT6重组质粒的酶切鉴定结果。图1中的1为Lambda DNA-Hind III分子量标准：23.13，9.416，6.557，4.361，2.322，2.027，0.564，0.125kb；2为pET24b-ESAT6重组质粒；3为pET24b-ESAT6重组质粒限制性内切酶NheI和XhoI酶切后。

如图2所示，本发明实施例1中pET32a-CFP10重组质粒的酶切鉴定结果。图2中的1为300bp分子量标准；2为pET32a-CFP10重组质粒限制性内切酶Kpn I和EcoRI酶切后和效果。

如图3所示，是本发明实施例1中重组质粒pET24b-ESAT6 DNA序列分析结果。

如图4所示，是本发明实施例1中重组质粒pET32a-CFP10 DNA序列分析结果。

11、pET24b-ESAT6和pET32a-CFP10工程菌的诱导表达及鉴定

将pET24b-ESAT6和pET32a-CFP10质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆转种于5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，然后按1％转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养至OD600为0.6—0.8时，加入IPTG，诱导3—4hr。

将1×载样缓冲液150μl加入来自1ml菌液的沉淀样本，混悬后，置100℃沸水浴5min，于12000rpm离心10min，取上清液40μl进行SDS-PAGE，电泳条件为：积层胶恒流10mA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h；用脱色液脱色至条带清晰，观察是否有目的蛋白表达条带。

结果如图5和6所示。

图5是本发明实施例1中SDS-PAGE鉴定重组ESAT6在大肠杆菌中的表达。其中，1为蛋白质中等分子量标准(24，20，14.2kDa)；2为IPTG诱导前的表达；3-6分别为IPTG诱导后1，2，3，4小时的表达。

图6为本发明实施例1中SDS-PAGE鉴定重组CFP10在大肠杆菌中的表达。其中，1为蛋白质中等分子量标准(97.4，66.2，42.7，31.0，20.1，14.4)；2-4为含载体质粒pET32a的大肠杆菌BL21(λDE3)；5-10为含重组质粒pET32a-cfp10的大肠杆菌BL21(λDE3)；2，5，8为IPTG诱导1h；3，6，9为IPTG诱导2h；4，6，10为IPTG诱导4h。

从图5和6可以看出，工程菌IPTG诱导3-4h表达量最多。

将诱导菌超声破碎后的上清液和沉淀部分进行SDS-PAGE，所得结果见图7。图7为重组ESAT6蛋白的SDS-PAGE分析结果。其中，1-3为纯化的重组ESAT6蛋白；4，5分别为重组ESAT6表达菌超声破碎后的沉淀和上清液；6为重组ESAT6大肠杆菌IPTG诱导后的结果。从图7可以看出，pET24b-ESAT6工程菌的沉淀部分可见较明显的特异蛋白表达带，而上清液中只见极少量特异蛋白表达带，说明表达的重组ESAT6大多以细胞内不溶性包涵体的形式存在。

将不同的诱导温度下的CFP10目的蛋白在可溶性蛋白中的含量进行分析，结果见图8。其中，1为蛋白质中等分子量标准(97.4，66.2，42.7，31.0，20.1，14.4)；2为含载体质粒pET32a的大肠杆菌BL21(λDE3)；3为含重组质粒pET32a-cfp10的大肠杆菌BL21(λDE3)；4—6为重组CFP10表达菌超声破碎后的沉淀；7—10为重组CFP10表达菌超声破碎后的上清液；2，3，4，7为诱导温度37℃时的结果；5，8为诱导温度为32℃时的结果；6，9，10为诱导温度为30℃时的结果。从图8可以看出，pET32a-CFP10工程菌在30℃时，CFP10重组蛋白均出现在破碎的上清中，沉淀极少，说明该重组蛋白主要以可溶性形式表达，经过凝胶扫描分析该蛋白占总可溶性蛋白的50％以上。

12.ESAT6、CFP10重组蛋白的纯化

(1)采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书直接纯化ESAT6融合蛋白，SDS-PAGE电泳见图9。如图9所示，为SDS-PAGE鉴定纯化的重组ESAT6蛋白。其中，1为蛋白质中等分子量标准(24，20，14.2kDa)；2为纯化的重组ESAT6蛋白；3为重组ESAT6工程菌IPTG诱导前；4为重组ESAT6工程菌IPTG诱导后4小时。从图9可以看出，纯化的ESAT6融合蛋白呈一条带，未见其他杂蛋白，经过扫描分析纯度在95％以上。

(2)在5L的发酵罐中发酵培养了3L pET32a-CFP10工程菌进行诱导表达，发酵完成后收集细菌，进行超声破碎细菌离心收集上清进行亲和层析，采用咪唑进行梯度洗脱，目的蛋白得到了很好的纯化，经过凝胶电泳扫描分析纯度可以达到90％以上。将亲和层析的样品进行透析浓缩后进行肠激酶消化，然后再进行亲和层析，得到了比较纯的CFP10，最后经过凝胶过滤层析去除微量的肠激酶，得到了CFP10纯品，对于重组CFP10蛋白的亲和层析纯化所得结果见图10。其中，1，9为蛋白质中等分子量标准(97.4，66.2，42.7，31.0，20.1，14.4)；2为含载体质粒pET32a的大肠杆菌BL21(λDE3)；3为含重组质粒pET32a-cfp10的大肠杆菌BL21(λDE3)；4为重组CFP10表达菌超声破碎后的上清液；5-7为亲和层析后的重组CFP10样品；8为肠激酶消化、亲和层析后的重组CFP10样品；10为sephacryl S100凝胶过滤层析后的重组CFP10样品。从图10可以看出，经过扫描分析纯度在95％以上。

(二)稀释液的配制：

16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10μl聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.2，加双蒸馏水定容至2000ml。

(三)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白，使其终浓度分别为10μg/ml，除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

(四)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白，使其终浓度分别为20μg/ml，两者等体积混匀后，混合蛋白中ESAT6与CFP10蛋白的终浓度分别为10μg/ml，除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

二、动物模型的制备：

1.细菌培养：将结核分枝杆菌H37Rv接种在改良罗氏培养基上，于37℃培养4周，用生理盐水冲洗下培养基表面的结核分枝杆菌H37Rv菌落，吸入一支事先称好重量的新的无菌离心管中，于80℃灭活2个小时。于4000rpm离心10分钟，将上清液吸到一支新的无菌离心管中，称量并计算出菌体沉淀的重量；用吸出的上清液将菌体沉淀稀释为80mg/ml。

2.菌悬液制备：将80mg/ml的菌悬液超声破碎后，取2ml，加入等体积的福氏不完全佐剂，混匀，使其终浓度为40mg/ml。

3.动物准备：从中国预防医学科学院流行病学研究所购进有合格证的体重为250g左右的豚鼠12只，雌雄各半。放动物实验室喂养1周后，取PPD 0.1ml皮内注射，于24小时观察皮试反应，结果12只豚鼠24小时皮试反应均阴性，可用于进一步的试验。

4.动物免疫：将皮试反应阴性的豚鼠随机分为2组，雌雄各半。一组豚鼠于后肢腹股沟处，皮下注射市售卡介苗0.2ml 1次；另一组豚鼠于后肢腹股沟处，皮下注射40mg/ml的结核分枝杆菌混悬液0.2ml，每周免疫1次，共免疫5次。第5次免疫1周后，对两组豚鼠拔毛，取PPD 0.1ml皮内注射，于24小时、48小时、72小时观察皮试反应，结果各组豚鼠于24小时、48小时皮肤反应均为阳性(结果见表1)，72小时皮肤反应均为阴性，雌、雄豚鼠皮肤反应无显著差异，说明结核菌免疫成功。

表1 豚鼠免疫后PPD皮肤试验24小时、48小时皮肤红肿反应平均直径大小(mm)

三、上述用于鉴定诊断结核病的药物在豚鼠结核病模型中的应用：

1.皮肤试验：对两组豚鼠背部拔毛，以轮圈法皮内注射PPD、重组ESAT6蛋白、重组CFP10蛋白及重组ESAT6蛋白与重组CFP10蛋白的混合液各0.1ml，于注射后24小时、48小时、72小时分别测量豚鼠背部各注射点皮肤红肿的纵、横直径大小(mm)，记录其平均值。

2.结果：24小时、48小时皮肤反应结果见表2、3；72小时皮肤反应均小于5mm，为阴性；雌、雄豚鼠皮肤反应无显著差异。

表2 豚鼠不同蛋白皮肤试验24小时皮肤红肿反应平均直径大小(mm)

表3 豚鼠不同蛋白皮肤试验48小时皮肤红肿反应平均直径大小(mm)

实施例2

1.用于鉴定诊断结核病的药物(诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂)的制备：

(1)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白作为结核变态反应原；

(2)稀释液的配制：16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10μl聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.2，加双蒸馏水定容至2000ml。

(3)用稀释液将所述的结核分枝杆菌重组ESAT6稀释成1、2、4、6、8、10μg/ml，除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

2.动物模型的制备：

(1)细菌培养：将结核分枝杆菌H37Rv接种在改良罗氏培养基上，于37℃培养4周，用生理盐水冲洗下培养基表面的结核分枝杆菌H37Rv菌落，吸入一支事先称好重量的新的无菌离心管中，于80℃灭活2个小时。于4000rpm离心10分钟，将上清液吸到一支新的无菌离心管中，称量并计算出菌体沉淀的重量；用吸出的上清液将菌体沉淀稀释为80mg/ml。

(2)菌悬液制备：将80mg/ml的菌悬液超声破碎后，取2ml，加入等体积的福氏不完全佐剂，混匀，使其终浓度为40mg/ml。

(3)动物准备：从中国预防医学科学院流行病学研究所购进有合格证的体重为250g左右的豚鼠36只，雌雄各半。放动物实验室喂养1周后，取PPD0.1ml皮内注射，于24小时观察皮试反应，结果36只豚鼠24小时皮试反应均阴性，可用于进一步的试验。

(4)动物免疫：分别于豚鼠后肢腹股沟处，皮下注射0.1ml(5mg)灭活的结核分枝杆菌H37Rv全菌体，一周致敏一次，共致敏4次，最后一次致敏后1周进行皮肤试验。

3.上述用于鉴定诊断结核病的药物在豚鼠结核病模型中的应用：

(1)常规皮试法：将致敏豚鼠随机分成6组，每组6只，雌雄各半。背部剪毛，以稀释液、5IU PPD为对照，每只豚鼠在同一部位注射同一剂量的抗原，注射量均为0.1ml，皮内注射后24h、48h、72h分别测量豚鼠背部各注射点皮肤红肿的纵、横直径大小(mm)，记录其平均值。

24小时、48小时皮肤反应结果见表4，0.1μg、0.2μg重组ESAT6抗原组平均皮肤硬结直径显著小于PPD；0.4μg、0.6μg、0.8μg重组ESAT6抗原组平均皮肤硬结直径与PPD对照品相似；1.0μg重组ESAT6抗原组平均皮肤硬结直径显著大于PPD。72小时皮肤反应均小于5mm，为阴性。稀释液对照组，豚鼠局部皮肤无红肿、硬结反应。

表4 重组ESAT6抗原常规皮试法诱发结核菌致敏豚鼠皮肤反应结果

(2)轮圈法皮肤试验：为排除豚鼠个体差异，采用轮圈法在一只豚鼠背上注射PPD及不同剂量的重组ESAT6抗原，研究影响豚鼠皮肤变态反应反应的因素：剂量效应、时间效应、豚鼠性别。取6只豚鼠，雌雄各半，以轮圈法注射于豚鼠背部一侧，每侧6个点，稀释液、5IU PPD、0.4μg、0.6μg、0.8μg、1.0μg重组ESAT6抗原，注射量均为0.1ml，皮内注射后24h、48h、72h分别测量豚鼠背部各注射点皮肤红肿的纵、横直径大小(mm)，记录其平均值。结果见表5。

1)剂量效应：结果表明重组ESAT6抗原从低剂量到高剂量组诱发豚鼠皮肤变态反应的绝对值逐渐升高，但0.4μg—1.0μg重组ESAT6抗原与PPD对照品诱发豚鼠皮肤变态反应的效果差异无显著性。

2)时间效应：重组ESAT6抗原诱发豚鼠皮肤变态反应，随着时间的延长，平均绝对值变小。0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg、1.0μg剂量诱发豚鼠皮肤变态反应，24h、48h、72h之间均有差异，24小时的平均直径显著大于48小时的平均直径，48小时的平均直径显著大于72小时的平均直径。大部分豚鼠在注射后72小时皮肤皮肤变态反应直径小于5mm，无实际意义。

3)豚鼠性别效应：豚鼠雌雄个体之间皮肤变态反应强度略有不同，大部分雄豚鼠皮肤变态反应强于雌豚鼠，雄豚鼠皮肤变态反应的平均直径高于雌豚鼠，但无显著差别。

表5  重组ESAT6抗原轮圈皮试法诱发结核菌致敏豚鼠皮肤反应结果

(3)结论：应用结核分枝杆菌重组ESAT6抗原诱发灭活结核菌致敏豚鼠的皮肤变态反应，0.6—0.8μg的剂量较合适，皮内注射后24、48小时是皮肤反应较理想的观测时间，雌雄豚鼠的皮肤反应无显著差别。

实施例3

1.用于鉴定诊断结核病的药物(诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂)的制备：

(1)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组CFP10蛋白作为结核变态反应原；

(2)稀释液的配制：16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10μl聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.2，加双蒸馏水定容至2000ml。

(3)用稀释液将所述的结核分枝杆菌重组CFP10稀释成2、4、6、8、10、12μg/ml，除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

2.动物模型的制备：

(1)细菌培养：将结核分枝杆菌H37Rv接种在改良罗氏培养基上，于37℃培养4周，用生理盐水冲洗下培养基表面的结核分枝杆菌H37Rv菌落，吸入一支事先称好重量的新的无菌离心管中，于80℃灭活2个小时。于4000rpm离心10分钟，将上清液吸到一支新的无菌离心管中，称量并计算出菌体沉淀的重量；用吸出的上清液将菌体沉淀稀释为80mg/ml。

(2)菌悬液制备：将80mg/ml的菌悬液超声破碎后，取2ml，加入等体积的福氏不完全佐剂，混匀，使其终浓度为40mg/ml。

(3)动物准备：从中国预防医学科学院流行病学研究所购进有合格证的体重为250g左右的豚鼠6只，雌雄各半。放动物实验室喂养1周后，取PPD 0.1ml皮内注射，于24小时观察皮试反应，结果6只豚鼠24小时皮试反应均阴性，可用于进一步的试验。

(4)动物免疫：分别于豚鼠后肢腹股沟处，皮下注射40mg/ml的结核分枝杆菌混悬液0.2ml，每周免疫1次，共免疫5次。第5次免疫1周后，对两组豚鼠拔毛，取PPD 0.1ml皮内注射，于24小时、48小时、72小时观察皮试反应，结果各组豚鼠于24小时、48小时皮肤反应均为阳性。

3.上述用于鉴定诊断结核病的药物在豚鼠结核病模型中的应用：

(1)轮圈法皮肤试验：为排除豚鼠个体差异，采用轮圈法在一只豚鼠背上注射PPD及不同剂量的重组CFP10抗原，研究影响豚鼠皮肤变态反应反应的因素：剂量效应、时间效应、豚鼠性别。取6只豚鼠，雌雄各半，以轮圈法注射于豚鼠背部一侧，每侧8个点，稀释液、5IU PPD、0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg、1.0μg、1.2μg重组CFP10抗原，注射量均为0.1ml，皮内注射后24h、48h、72h分别测量豚鼠背部各注射点皮肤红肿的纵、横直径大小(mm)，记录其平均值。结果见表6。

1)剂量效应：结果表明重组CFP10抗原从低剂量到高剂量组诱发豚鼠皮肤变态反应的绝对值逐渐升高，但0.6μg—1.0μg重组ESAT6抗原与PPD对照品诱发豚鼠皮肤变态反应的效果差异无显著性。

2)时间效应：重组ESAT6抗原诱发豚鼠皮肤变态反应，随着时间的延长，平均绝对值变小。0.1μg、0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg、1.0μg剂量诱发豚鼠皮肤变态反应，24h、48h、72h之间均有差异，24小时的平均直径显著大于48小时的平均直径，48小时的平均直径显著大于72小时的平均直径。大部分豚鼠在注射后72小时皮肤皮肤变态反应直径小于5mm，无实际意义。

3)豚鼠性别效应：豚鼠雌雄个体之间皮肤变态反应强度无显著差别。

表6  重组CFP10抗原轮圈皮试法诱发结核菌致敏豚鼠皮肤反应结果

(2)结论：应用结核分枝杆菌重组CFP10抗原诱发灭活结核菌致敏豚鼠的皮肤变态反应，0.6—0.8μg的剂量较合适，皮内注射后24、48小时是皮肤反应较理想的观测时间，雌雄豚鼠的皮肤反应无显著差别。

实施例4

1.用于鉴定诊断结核病的药物(诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂)的制备：

(1)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白作为结核变态反应原；

(2)稀释液的配制：16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10μl聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.2，加双蒸馏水定容至2000ml。

(3)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白，使其终浓度分别为10μg/ml；

(4)将10μg/ml的重组ESAT6和CFP10蛋白按体积2:8(E2+C8)、4:6(E4+C6)、5:5(E5+C5)、6:4(E6+C4)、8:2(E8+C2)混合，ESAT6与CFP10混合蛋白的总浓度为10μg/ml，除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

2.动物模型的制备：

(1)细菌培养：将结核分枝杆菌H37Rv接种在改良罗氏培养基上，于37℃培养4周，用生理盐水冲洗下培养基表面的结核分枝杆菌H37Rv菌落，吸入一支事先称好重量的新的无菌离心管中，于80℃灭活2个小时。于4000rpm离心10分钟，将上清液吸到一支新的无菌离心管中，称量并计算出菌体沉淀的重量；用吸出的上清液将菌体沉淀稀释为80mg/ml。

(2)菌悬液制备：将80mg/ml的菌悬液超声破碎后，取2ml，加入等体积的福氏不完全佐剂，混匀，使其终浓度为40mg/ml。

(3)动物准备：从中国预防医学科学院流行病学研究所购进有合格证的体重为250g左右的豚鼠12只，雌雄各半。放动物实验室喂养1周后，取PPD 0.1ml皮内注射，于24小时观察皮试反应，结果12只豚鼠24小时皮试反应均阴性，可用于进一步的试验。

(4)动物免疫：将皮试反应阴性的豚鼠随机分为2组，雌雄各半。一组豚鼠于后肢腹股沟处，皮下注射市售卡介苗0.2ml 1次；另一组豚鼠于后肢腹股沟处，皮下注射40mg/ml的结核分枝杆菌混悬液0.2ml，每周免疫1次，共免疫5次。第5次免疫1周后，对两组豚鼠拔毛，取PPD 0.1ml皮内注射，于24小时、48小时、72小时观察皮试反应，结果各组豚鼠于24小时、48小时皮肤反应均为阳性。

3.上述用于鉴定诊断结核病的药物在豚鼠结核病模型中的应用：

(1)皮肤试验：对两组豚鼠背部拔毛，以轮圈法皮内注射PPD、重组ESAT6蛋白、重组CFP10蛋白及重组ESAT6蛋白与重组CFP10蛋白不同体积的混合液各0.1ml，于注射后24小时、48小时、72小时分别测量豚鼠背部各注射点皮肤红肿的纵、横直径大小(mm)，记录其平均值。

(2)结果：24小时、48小时皮肤反应结果见表7、8、9、10；72小时皮肤反应均小于5mm，为阴性。卡介苗免疫组对重组ESAT6蛋白、重组CFP10蛋白及重组ESAT6蛋白与重组CFP10蛋白不同体积的混合液均无反应。雌、雄豚鼠皮肤反应无显著差异。结果表明ESAT6蛋白、CFP10蛋白及ESAT6与CFP10混合蛋白均可鉴别结核菌感染者和卡介苗接种者；ESAT6与CFP10不同浓度的混合蛋白的皮肤反应略强于单独应用ESAT6蛋白、CFP10蛋白，说明两者的刺激有一定的相加作用。

表7 结核菌免疫组豚鼠不同蛋白皮肤试验24小时皮肤反应平均直径大小(mm)

表8 结核菌免疫组豚鼠不同蛋白皮肤试验48小时皮肤反应平均直径大小(mm)

表9 卡介苗免疫组豚鼠不同蛋白皮肤试验24小时皮肤反应平均直径大小(mm)

表10 卡介苗免疫组豚鼠不同蛋白皮肤试验48小时皮肤反应平均直径大小(mm)

对比例1

采用结核PPD皮肤试验检测来自解放军总医院第二附属医院志愿者1，女，43岁，身体健康。

1.吸取结核PPD试剂0.1ml，皮内注射于前臂掌侧中央；

2.注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径，并记录有无异常反应；

3.结果皮肤反应硬结平均直径21mm，为强阳性反应，说明有结核菌感染。

实施例5

1.用于鉴定诊断结核病的药物(诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂)的制备：

(1)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白作为结核变态反应原；

(2)稀释液的配制：16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10ul聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.2，加双蒸馏水定容至2000ml。

(3)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白，使其终浓度分别为20μg/ml，两者等体积混匀后，混合蛋白中ESAT6与CFP10蛋白的终浓度分别为10μg/ml，除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

2.上述皮肤试剂在人体的应用：

(1)吸取上述用于鉴定诊断结核病的药物0.1ml，皮内注射于志愿者1的前臂掌侧中央，于注射后24、48、72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应；

(2)结果：24、48、72小时皮肤反应硬结平均直径分别为18.5mm、15.5mm、9.5mm，为阳性反应，无异常反应。

对比例2

采用英国牛津免疫技术公司的T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检测来自解放军总医院第二附属医院结核科住院患者张某，男，19岁，诊断：继发性肺结核双肺涂(+)初治。

1.人外周血单个核淋巴细胞的分离和培养：抽取张某静脉血4ml，放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒混匀后，加在淋巴细胞分离液上方，于3000rpm离心20分钟；吸取白色的单个核细胞层，用8ml预热至37℃的无血清1640培养液，混悬后，于室温2000rpm离心10min；重复1次；弃去上清液，加入400μl预热至37℃的含10％小牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，计数细胞数后，用含10％小牛血清的1640培养液调整细胞至2×10⁶细胞/ml。

2.在96孔滤膜板的阴性对照孔内加入50μL无血清培养液；在阳性对照孔内加入50μL阳性对照试剂；在A测试孔内加入结核杆菌ESAT6混合多肽A；在B测试孔内加入结核杆菌CFP10混合多肽B。

3.每份样品在阴性对照、阳性对照、测试孔A和测试孔B内分别加入100μL含有2 x 10⁵个外周单核细胞。

4.将96孔滤膜板放入5％ CO2培养箱在37℃培养20小时。

5.每孔加入200μLPBS洗板4次。

6.加入50μL新鲜配制的工作浓度标记抗体。

7.在4℃孵育60分钟。

8.每孔加入200μLPBS洗板4次。

9.加入50μL底物液氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。

10.室温避光反应7分钟。

11.用双蒸水洗涤细胞培养孔。

12.将板放在37℃烘箱中干燥。

13.将96孔滤膜板放入美国CTL公司的ELISpot分析仪中，对实验结果进行扫描和分析。见图11。从图11可以看出，检测孔A的斑点数为22，为阳性；检测孔B的斑点数为3，为阴性，说明该结核病患者对ESAT6的刺激可产生免疫反应，而对CFP10的刺激不产生免疫反应。说明张某对ESAT6和CFP10的免疫反应。

实施例6

1.用于鉴定诊断结核病的药物(诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂)的制备：

(1)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白作为结核变态反应原；

(2)稀释液的配制：16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10ul聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.2，加双蒸馏水定容至2000ml。

(3)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白，使其终浓度分别为20μg/ml，两者等体积混匀后，混合蛋白中ESAT6与CFP10蛋白的终浓度分别为10μg/ml，除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

(4)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组CFP10蛋白，使其终浓度分别为10μg/ml，除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

2.上述皮肤试剂在人体的应用：

(1)吸取上述的重组CFP10蛋白0.1ml，皮内注射于志愿者张某的左前臂掌侧中央；吸取上述重组ESAT6和CFP10混合蛋白0.1ml，皮内注射于志愿者张某的右前臂掌侧中央，于注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应；

(2)结果：重组CFP10蛋白72小时皮肤反应硬结平均直径4.5mm，为阴性反应，无异常反应；重组ESAT6和CFP10混合蛋白为18mm，为强阳性反应，无异常反应。

对比例3

采用英国牛津免疫技术公司的T SPOT-TB结核感染T细胞斑点实验试剂盒检测来自解放军总医院第二附属医院结核科住院患者周某，男，33岁，诊断：继发性肺结核双肺涂(+)初治。

1.人外周血单个核淋巴细胞的分离和培养：抽取周某静脉血4ml，放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒混匀后，加在淋巴细胞分离液上方，于3000rpm离心20分钟；吸取白色的单个核细胞层，用8ml预热至37℃的无血清1640培养液，混悬后，于室温2000rpm离心10min；重复1次；弃去上清液，加入400μl预热至37℃的含10％小牛血清的1640培养液重悬沉淀细胞，计数细胞数后，用含10％小牛血清的1640培养液调整细胞至2×10⁶细胞/ml。

2.在96孔滤膜板的阴性对照孔内加入50μL无血清培养液；在阳性对照孔内加入50μL阳性对照试剂；在A测试孔内加入结核杆菌ESAT6混合多肽A；在B测试孔内加入结核杆菌CFP10混合多肽B。

3.每份样品在阴性对照、阳性对照、测试孔A和测试孔B内分别加入100μL含有2 x 10⁵个外周单核细胞。

4.将96孔滤膜板放入5％ CO2培养箱在37℃培养20小时。

5.每孔加入200μLPBS洗板4次。

6.加入50μL新鲜配制的工作浓度标记抗体。

7.在4℃孵育60分钟。

8.每孔加入200μLPBS洗板4次。

9.加入50μL底物液氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。

10.室温避光反应7分钟。

11.用双蒸水洗涤细胞培养孔。

12.将板放在37℃烘箱中干燥。

13.将96孔滤膜板放入美国CTL公司的ELISpot分析仪中，对实验结果进行扫描和分析。结果见图12。从图12可以看出，检测孔A的斑点数为4，为阴性；检测孔B的斑点数为45，为阳性，说明该结核病患者对ESAT6的刺激不产生免疫反应，而对CFP10的刺激产生免疫反应。说明周某对ESAT6和CFP10的免疫反应。

实施例7

1.用于鉴定诊断结核病的药物(诊断结核菌感染、活动性结核病的特异性皮肤试剂)的制备：

(1)通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白作为结核变态反应原；

(2)稀释液的配制：16g氯化钠、0.4g氯化钾、2.88g磷酸氢二钠、0.48g磷酸二氢钾、6g苯酚于1500ml蒸馏水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入10ul聚山梨酯80，加入盐酸调节pH值至7.2，加双蒸馏水定容至2000ml。

(3)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白，使其终浓度分别为20μg/ml，两者等体积混匀后，混合蛋白中ESAT6与CFP10蛋白的终浓度分别为10μg/ml，除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

(4)用稀释液稀释所述的结核分枝杆菌重组ESAT6蛋白，使其终浓度分别为10μg/ml，除菌滤过，检定，分装入一容器，1ml/支，置4℃避光保存备用。

2.上述皮肤试剂在人体的应用：

(1)吸取上述的重组ESAT6蛋白0.1ml，皮内注射于志愿者张某的左前臂掌侧中央；吸取上述重组ESAT6和CFP10混合蛋白0.1ml，皮内注射于志愿者张某的右前臂掌侧中央，于注射后72小时测量、记录注射部位皮下硬结的纵、横直径(mm)，并记录有无异常反应；

(2)结果：重组ESAT6蛋白72小时皮肤反应硬结平均直径4mm，为阴性反应，无异常反应；重组ESAT6和CFP10混合蛋白为21mm，为强阳性反应，无异常反应。

Claims (3)

1、ESAT6和CFP10蛋白在制备用于鉴定诊断结核病的药物中的应用，其特征在于，所述用于鉴定诊断结核病的药物由稀释液及溶于其中的结核变态反应原构成，所述的结核变态反应原采用ESAT6和CFP10混合蛋白。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的ESAT6和CFP10蛋白为天然的ESAT6和CFP10蛋白或通过基因工程技术克隆、表达、纯化得到的结核分枝杆菌重组ESAT6和CFP10蛋白。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的用于鉴定诊断结核病的药物中的ESAT6和CFP10蛋白终浓度分别为6-15μg/ml。

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