CN101382548A - 结核抗体多抗原elisa检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒及制备方法，属结核病医学免疫学诊断技术领域。本发明主要由检测抗原、酶联抗人IgG抗体、底物、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反应板所组成的一盒体，所述检测抗原采用结核分枝杆菌复合群菌种脂阿拉伯甘露糖(LAM)、38kD和16kD三种与MPT63、MTB48、CFP10－ESAT6重组蛋白之中的任意1种或1种以上结核分枝杆菌重组蛋白组合作为检测抗原。本发明的结核分枝杆菌灵敏度高、特异性强、并具有互补性；可用于检测血清、胸水等体液样品中特异的抗结核抗体，辅助结核病的诊断和鉴别诊断。

Description

结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于结核病医学免疫学检测技术领域，特别涉及由LAM、38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白不同联合作为检测抗原组成的结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒。

背景技术

在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核菌耐药问题和非结核分枝杆菌病的发病率逐年上升使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800～1000万，每年死亡人数约200万。

中国的结核病疫情相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次中国结核病流行病学抽样调查初步结果表明，中国有5.5亿人感染了结核菌；现有肺结核病人451万，其中传染性肺结核病人196万；每年死亡人数约13万，结核病死亡在中国各种死亡原因中居第9位，在传染病中居第一位。结核病也是AIDS感染者死亡的主要原因，根据1996年WHO统计每3个死亡的AIDS患者中就有一例死于合并结核，45-85％ HIV死亡者是由于结核病诊断延误所致。因此，结核病的早期诊断、早期治疗对结核病疫情的控制具有极其重要的意义，并可提高HIV患者的存活率。

抗结核抗体的检测是应用较广泛的一种简便、快速、价廉的结核病辅助诊断手段，尤其是对于那些诊断困难的菌阴肺结核、儿童结核病或肺外结核病具有实用价值，但存在灵敏度和特异性不高的问题。因此，建立一个敏感、特异、快速的血清学诊断试验可弥补目前诊断方法的不足。

酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是常用的抗体检测方法，虽操作步骤较多，需半天时间，但可半定量地检测抗体水平，可根据其抗体升高的程度，明确诊断，或确定可疑对象进行追踪观察；检测灵敏度较高，可达70-80％；尤其是在体检、大面积普查时，大批量样本检测更可显示其优越性，成本较低。目前已有的结核抗体ELISA检测试剂盒主要由检测抗原、酶联抗人IgG抗体、底物、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反应板所组成，所用包被抗原有的是结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，由于PPD是结核菌培养滤液蛋白，含有许多分枝杆菌(包括致病性分枝杆菌、环境中非致病性分枝杆菌和卡介苗)共同的抗原，其检测的特异性差，易出现假阳性；有的包被抗原采用结核菌胞膜抗原(见专利公开号CN 1072265A)，并采用酶联葡萄球菌A蛋白的免疫反应方法；还有的检测抗原采用ESAT-6和CFP-10融合蛋白抗原(见专利公开号CN 1388378)，它们采用的均是单一检测抗原。

南京大渊生物技术工程有限责任公司研制的结核抗体检测蛋白芯片试剂盒，该试剂盒以结核杆菌LAM、38kD和16kD蛋白为抗原，其灵敏度不高。另外它采用的是金标免疫斑点法，用硝酸纤维素膜为载体，将抗原固定在膜上，应用胶体金颗粒标记抗体，使抗原抗体反应在膜上快速进行，形成红色的结合物，通过肉眼观察结果，它虽简便、快速，但只能定性，不能定量，成本较高。

发明内容

本发明的目的是为克服已有技术的不足，提供一种结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒及制备方法，采用多种具有互补性的重组蛋白抗原联合作为结核病抗体检测抗原，可提高结核抗体检测的灵敏度和特异性。

本发明提出的结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒，主要由检测抗原、酶联抗人IgG抗体、底物、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反应板所组成的一盒体，其特征在于，所述检测抗原采用结核分枝杆菌复合群菌种脂阿拉伯甘露糖(LAM)、38kD和16kD三种与MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白之中的任意1种或1种以上结核分枝杆菌重组蛋白组合作为检测抗原。

本发明提出上述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括：

(1)检测抗原的制备：采用基因工程技术克隆、表达产生，经纯化分别得到38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白抗原，从结核分枝杆菌复合群菌株中提纯制备得到LAM；

(2)用稀释液分别稀释所述各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原，使各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原的浓度均为1mg/ml，再将各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原稀释溶液混匀后除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，冷冻干燥备用；

(3)试剂盒的装配：所述将1mg/ml的结核分枝杆菌各重组蛋白和糖抗原冷冻干燥管、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清各1支、30％过氧化氢1瓶、邻苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反应板1块放入包装盒密封后，置4℃避光保存。

本发明的特点及技术效果：

本发明通过从结核分枝杆菌复合群菌株中提纯制备糖抗原LAM及通过基因工程技术克隆、表达、纯化结核分枝杆菌38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白，通过多种不同的联合作为结核病抗体检测的抗原，制备^新的结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒，本试剂盒能用于半定量地检测结核病人的抗体水平。

本发明人研究证明应用结核分枝杆菌抗原组合1(LAM+38kD+16kD)检测结核病人的灵敏度和特异性为67.8％、89.2％；抗原组合2(LAM+38kD+16kD+MPT63)检测结核病人的灵敏度和特异性为69.7％、86.1％；抗原组合3(LAM+38kD+16kD+MPT63+CFP10-ESAT6)检测结核病人的灵敏度和特异性为72.4％、83.6％；抗原组合4(LAM+38kD+16kD+MTB48)检测结核病人的灵敏度和特异性为69.2％、86.4％。PPD皮试阴性健康人中假阳性率很低(<7.4％)，假阳性主要出现在PPD皮试阳性的结核感染者和卡介苗接种者中。菌阳结核病人抗体的阳性率很高(>83％)。

本发明的关键试剂-----结核分枝杆菌重组38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6蛋白抗原可大规模生产，且成本相对较低。该试剂盒可特异地检测结核病患者血清、胸水等体液样品中抗体，只需半天时间，

本发明是由糖抗原和多种重组蛋白抗原组成的新型结核抗体检测试剂盒，可用于检测血清、胸水等体液样品中特异的抗结核抗体，可用于结核病临床血清学诊断。

具体实施方式

本发明提出的结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒及其制备方法结合实施例及附图详细说明如下：

本发明提出的结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒，主要由检测抗原、酶联抗人IgG抗体、底物、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反应板所组成的一盒体，其特征在于，所述检测抗原采用结核分枝杆菌复合群菌种脂阿拉伯甘露糖(LAM)、38kD和16kD三种与MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白之中的任意1种或1种以上结核分枝杆菌重组蛋白组合作为检测抗原。

所述的结核分枝杆菌复合群菌种采用结核分枝杆菌。

所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括：

(1)检测抗原的制备：采用基因工程技术克隆、表达产生，经纯化分别得到38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白抗原，从结核分枝杆菌复合群菌株中提纯制备得到LAM；

(2)用稀释液(为常规的稀释液，例如0.5M氯化钠—20mM磷酸氢二钠—2％甘露醇，pH7.4，或磷酸盐缓冲液、生理盐水)分别稀释所述各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原，使各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原的浓度均为1mg/ml，再将各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原稀释溶液混匀后除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，冷冻干燥备用；

(3)试剂盒的装配：上述将1mg/ml的结核分枝杆菌各重组蛋白和糖抗原冷冻干燥管、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清各1支、30％过氧化氢1瓶、邻苯二胺1支(每种组分的量可根据实际应用确定)、聚苯乙烯微孔反应板1块放入包装盒密封后，置4℃避光保存。

上述步骤(1)的多种结核分枝杆菌抗原可采用基因工程技术将其中的两种或两种以上蛋白抗原融合表达产生。

上述步骤(2)的各结核分枝杆菌抗原可采用分别单独配制或混合配制。

本发明的检测试剂盒应用时结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白作为结核病抗体多抗原ELISA检测试剂盒的抗原，LAM包被在酶联板上的浓度为0.01μg-0.2μg，38kD、16kD、MPT63、MTB48和CFP10-ESAT6重组蛋白包被在酶联板上的浓度为0.5μg-2μg；

本发明的上述结核抗体ELISA检测试剂盒的使用方法：

(1)抗原包被：用包被缓冲液将LAM抗原稀释至0.1μg-2μg/ml，重组蛋白抗原稀释至5—20μg/ml，每孔加100μl。每板留1个孔，只加包被缓冲液，作为空白对照。置4℃过夜。次日用PBST洗板3—5次，3—5分钟/次。

(2)封闭：每孔加PBST—1％BSA 200μl，置37℃孵育1小时。用PBST洗板3—5次，3—5分钟/次。

(3)加待检样品：用PBST—1％BSA稀释待检样品，充分混匀后，每孔加100μl，做2—3个平行孔；同时做空白、阴性及阳性孔对照，置37℃孵育40-60分钟。用PBST洗板3—5次，3—5分钟/次。

(4)加酶标二抗：用PBST—1％BSA新鲜稀释酶标第二抗体，充分混匀后，每孔加100μl，置37℃孵育40-60分钟。用PBST洗板3—5次，3—5分钟/次。

(5)加底物液显色：每孔加100μl新鲜配制的底物溶液，置室温显色5～10分钟。

(6)终止反应：每孔加50—100μl 2M硫酸。

(7)酶标仪读数：以空白对照孔调零后，测各孔OD值，若大于或等于规定的阳性OD值即为阳性。

本发明的多种检测抗原的制备实施例及检测试剂盒实施例分别说明如下：

一、38kD重组蛋白可采用已有的商品，也可通过以下基因工程技术制备：

1、引物设计与合成

上游引物(含限制性内切酶NdeI位点)5’—GGT ATT CCA/TAT GT G TGG CTC GAAACC ACC GAG C—3’

下游引物(含限制性内切酶EcoRI位点)5’—GCA GTG ACG/AAT TCCTGG AAA TCGTCG CGA TCA AC—3’

扩增片段：1079bp

2、PCR扩增38kD基因

用上下游引物，在Taq plus I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增38kD基因。PCR反应程序：95℃ 5min；94℃ 1min，66℃ 1min，72℃2min，循环30次；最后72℃延伸7min。于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定1079bp的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，具体方法如下：

向管中加入等体积的溶胶液(约0.4ml)，直至琼脂糖完全融化；向管中加入0.6ml琼脂糖DNA纯化树脂，充分混匀；将注射器插入微量离心柱拧紧，拔出注射器活塞，将树脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；从微量离心柱上拔掉注射器，拔出注射剂活塞，将注射器插入微量离心柱拧紧，将2ml I型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入150μl II型柱子清洗液，离心1200rpm 2-3min以清洗和干燥树脂；将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入40μl TE缓冲液，静置一分钟，12,000rpm离心20s；回收DNA洗脱液，定量，浓度约为50ng/μl。贮存于-20℃备用。

4.重组表达质粒的构建：

用限制性内切酶Nde I、EcoRI双酶切纯化后的PCR产物和表达载体pET24b质粒DNA，于1％琼脂糖凝胶电泳，切取1058bp的38kD基因片段和5265bp的pET24b质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，38kD基因片段与pET24b质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10ul反应体系如下：

2×连接缓冲液              5μl

pET24b载体                 1μl

PCR产物                    2μl

T₄DNA连接酶                1μl

无菌水补至                 10μl

混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：

挑取大肠杆菌DH5α(或BL21)单菌落接种于5ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度OD₆₀₀为0.6~0.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4℃、4000rpm、离心10min，弃上清；20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，冰浴30min；于4℃、6000rpm、离心10min，弃上清；用4ml0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，置4℃冰箱放置过夜；次晨加入1ml无菌甘油，吹打混合均匀，每100μl分装于一个1.5ml的离心管中，置-70℃保存备用。

6.连接产物的转化：

次日取目的基因片段与载体pET24b连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG 4μl，混匀，取出200—400μl涂布于含有50ug/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

7.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有50ug/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。

(1)质粒小量提取试剂的配制

溶液I：50mmol/L葡萄糖

       25mmol/L Tris·CL(pH8.0)

       10mmol/L EDTA(pH8.0)

       在101bf/in²(6.895×10⁴Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4℃备用。

溶液II：0.2mmol/L NaOH，1％ SDS临用前配制

溶液III：5mol/L乙酸钾      60ml

         冰乙酸            11.5ml

         去离子水          28.5ml

         贮存于4℃，备用。

(2)小量提取质粒

分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12,000rpm离心1min，弃上清；细菌沉淀重悬于200μl溶液I中，冰浴10min；加400μl新配制的溶液II，冰浴5min；加300μl溶液III，冰浴10min；于4℃ 12,000rpm离心10min；上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-20℃放置2h沉淀DNA；于4℃ 12,000rpm离心10min，弃上清；用1ml 70％乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20μl TE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20μg/ml，于37℃水浴30min，消化RNA；取2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置—20℃储存备用。

8.鉴定重组质粒：

(1)PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为pET24b-38kD。

(2)酶切鉴定：取重组质粒5μl，分别用限制性内切酶Nde I、EcoRI双酶切3h；于1％琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准及扩增产物为对照，酶切后的片断与扩增片断一致。

(3)序列测定：直接挑选一个克隆送测序。测序结果与报道的基因组序列一致。

9.pET24b-38kD工程菌的诱导表达及鉴定

将pET24b-38kD质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，然后按1％转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养至OD₆₀₀为0.6左右时，加入IPTG，诱导4hr。

将1×载样缓冲液150μl分别加入来自1ml菌液的沉淀样本，混悬后，置100℃沸水浴5min，于12000rpm离心10min，取上清液40μl分别进行SDS-PAGE，电泳条件为：积层胶恒流10mA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h；用脱色液脱色至条带清晰。与对照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-38kD-BL21(DE3)沉淀部分在相对分子质量38kD位置附近有浓重的表达条带出现，诱导3—4小时表达量最多。

10.38kD重组蛋白的纯化

将诱导菌超声破碎后，采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书在变性条件下纯化38kD蛋白，SDS-PAGE电泳可见纯化的38kD蛋白呈一条带，未见其他杂蛋白。

二、16kD蛋白可采用已有的商品，也可通过以下基因工程技术制备16kD蛋白：

1、引物设计与合成

上游引物(5’端含限制性内切酶Nde I)5’—CATATGGCCACCACCCTTCCCGTTCA—3’下游引物(5’端含限制性内切酶Xho I)5’—CTCGAGGTTGGTGGACCGGATCTGAA—3’

扩增片段：444bp

2、PCR扩增16kD基因

用上下游引物，在Taq plus I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增16kD基因。PCR反应程序：95℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 40sec，72℃1min，循环32次；最后72℃延伸7min。于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定444bp的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，具体方法如下：

向管中加入等体积的溶胶液(约0.4ml)，直至琼脂糖完全融化；向管中加入0.6ml琼脂糖DNA纯化树脂，充分混匀；将注射器插入微量离心柱拧紧，拔出注射器活塞，将树脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；从微量离心柱上拔掉注射器，拔出注射剂活塞，将注射器插入微量离心柱拧紧，将2ml I型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入150μl II型柱子清洗液，离心1200rpm 2-3min以清洗和干燥树脂；将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入40μl TE缓冲液，静置一分钟，12,000rpm离心20s；回收DNA洗脱液，定量，浓度约为50ng/μl。贮存于-20℃备用。

4、目的基因与pGEM-T载体连接：

参照Promega公司pGEM-T vector System-I产品说明，将纯化后PCR产物(50ng)与克隆载体pGEM-T连接，目的基因片段与载体片断按摩尔比3:1混合，10ul反应体系如下：

2×连接缓冲液          5μl

pGEM-T载体             1μl

PCR产物                3μl

T₄DNA连接酶            1μl

无菌水补至             10μl

混匀后置于4℃冰箱反应12h，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：

挑取大肠杆菌DH5α(或BL21)单菌落接种于5ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度OD₆₀₀为0.6~0.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4℃、4000rpm、离心10min，弃上清；20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，冰浴30min；于4℃、6000rpm、离心10min，弃上清；用4ml 0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，置4℃冰箱放置过夜；次晨加入1ml无菌甘油，吹打混合均匀，每100μl分装于一个1.5ml的离心管中，置-70℃保存备用。

6.连接产物的转化：

将目的基因片段与PGEM-T的连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG 4μl，混匀，取出200—400μl涂布于含有60ug/ml氨苄青霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

7.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。

(1)质粒小量提取试剂的配制

溶液I： 50mmol/L葡萄糖

        25mmol/L Tris·CL(pH8.0)

        10mmol/L EDTA(pH8.0)

        在10lbf/in²(6.895×10⁴Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4℃备用。

溶液II：0.2mmol/L NaOH，1％ SDS 临用前配制

溶液III： 5mol/L乙酸钾   60ml

          冰乙酸         11.5ml

          去离子水       28.5ml

          贮存于4℃，备用。

(2)小量提取质粒

分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12,000rpm离心1min，弃上清；细菌沉淀重悬于200μl溶液I中，冰浴10min；加400μl新配制的溶液II，冰浴5min；加300μl溶液III，冰浴10min；于4℃ 12,000rpm离心10min；上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-20℃放置2h沉淀DNA；于4℃12,000rpm离心10min，弃上清；用1ml 70％乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20μl TE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20μg/ml，于37℃水浴30min，消化RNA；取2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置—20℃储存备用。

8.鉴定重组质粒：

(2)PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以引物P16a、P16b进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为PGEM-16kDa。

(2)酶切鉴定：取重组质粒5μl，分别用限制性内切酶Nde I、EcoRI双酶切3h；于1％琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准及扩增产物为对照，酶切后的片断与扩增片断一致。

(3)序列测定：直接挑选一个克隆送测序。测序结果与报道的基因组序列一致。

9.重组表达质粒的构建：

用限制性内切酶NdeI、EcoRI双酶切pGEM-16kDa重组质粒DNA和表达载体pET24b质粒DNA，于1％琼脂糖凝胶电泳，切取444bp的Rv1009基因片段和5265bp的pET24b质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，16kDa基因片段与pET24b质粒DNA片段按2∶1的摩尔比混合，在T₄DNA连接酶催化下，于16℃连接过夜，次日取连接产物5μl转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，置37℃恒温箱孵育14h。挑选5个克隆分别转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，用碱裂解法提取质粒。

10.重组表达质粒的鉴定

分别用牙签随机调取6个克隆，提取质粒，采用PCR扩增和双酶切鉴定方法挑选重组子；鉴定正确的阳性克隆命名为pET24b-16kDa。

11.pET24b-16kDa工程菌的诱导表达及鉴定

将pET24b-16kDa质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，然后按1％转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养至0D₆₀₀为0.6—0.8时，加入IPTG，诱导3—4hr。

将1×载样缓冲液150μl加入来自1ml菌液的沉淀样本，混悬后，置100℃沸水浴5min，于12000rpm离心10min，取上清液40μl进行SDS-PAGE，电泳条件为：积层胶恒流10mA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h；用脱色液脱色至条带清晰。与对照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-16kDa-BL21(DE3)菌体在相对分子质量16kDa位置附近有浓重的表达条带出现，诱导3-4小时表达量最多。

12.16kDa重组蛋白的纯化

将诱导菌超声破碎后，采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书纯化16kDa蛋白，SDS-PAGE电泳可见纯化的16kDa蛋白呈一条带，未见其他杂蛋白。

三、通过基因工程技术制备MPT63蛋白：

1、引物设计与合成

上游引物(5’端含限制性内切酶Nhe I)5’—GCTAGCGCCTATCCCATCACCGGA—3’

下游引物(5’端含限制性内切酶Xho I)5’—CTCGAGCGGCTCCCAAATCAGCAG—3’

扩增片段：402bp

2、PCR扩增MPT63基因

用上下游引物，在Taq plus I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增MPT63基因。PCR反应程序：95℃ 5min；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 60sec，循环30次；最后72℃延伸7min。于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定402bp的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，具体方法如下：

向管中加入等体积的溶胶液(约0.4ml)，直至琼脂糖完全融化；向管中加入0.6ml琼脂糖DNA纯化树脂，充分混匀；将注射器插入微量离心柱拧紧，拔出注射器活塞，将树脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；从微量离心柱上拔掉注射器，拔出注射剂活塞，将注射器插入微量离心柱拧紧，将2ml I型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入150μl II型柱子清洗液，离心1200rpm2-3min以清洗和干燥树脂；将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入40μl TE缓冲液，静置一分钟，12,000rpm离心20s；回收DNA洗脱液，定量，浓度约为50ng/μl。贮存于-20℃备用。

4、目的基因与pGEM-T载体连接：

参照Promega公司pGEM-T vector System-I产品说明，将纯化后PCR产物(50ng)与克隆载体pGEM-T连接，目的基因片段与载体片断按摩尔比3:1混合，10ul反应体系如下：

2×连接缓冲液           5μl

pGEM-T载体              1μl

PCR产物                 3μl

T₄DNA连接酶             1μl

无菌水补至              10μl

混匀后置于4℃冰箱反应12h，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：

挑取大肠杆菌DH5α(或BL21)单菌落接种于5ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度OD₆₀₀为0.6~0.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4℃、4000rpm、离心10min，弃上清；20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，冰浴30min；于4℃、6000rpm、离心10min，弃上清；用4ml 0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，置4℃冰箱放置过夜；次晨加入1ml无菌甘油，吹打混合均匀，每100μl分装于一个1.5ml的离心管中，置-70℃保存备用。

6.连接产物的转化：

将目的基因片段与PGEM-T的连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG 4μl，混匀，取出200—400μl涂布于含有60ug/ml氨苄青霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

7.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。

(1)质粒小量提取试剂的配制

溶液I： 50mmol/L葡萄糖

        25mmol/L Tris·CL(pH8.0)

        10mmol/L EDTA(pH8.0)

        在10lbf/in²(6.895×10⁴Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4℃备用。

溶液II：0.2mmol/L NaOH，1％ SDS 临用前配制

溶液III：5mol/L乙酸钾   60ml

         冰乙酸         11.5ml

         去离子水      28.5ml

         贮存于4℃，备用。

(2)小量提取质粒

分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12,000rpm离心1min，弃上清；细菌沉淀重悬于200μl溶液I中，冰浴10min；加400μl新配制的溶液II，冰浴5min；加300μl溶液III，冰浴10min；于4℃ 12,000rpm离心10min；上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-20℃放置2h沉淀DNA；于4℃ 12,000rpm离心10min，弃上清；用1ml 70％乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20μl TE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20μg/ml，于37℃水浴30min，消化RNA；取2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置—20℃储存备用。

8.鉴定重组质粒：

(3)PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为PGEM-MPT63。

(2)酶切鉴定：取重组质粒5μl，分别用限制性内切酶Nhe I、Xho I双酶切3h；于1％琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准及扩增产物为对照，酶切后的片断与扩增片断一致。

(3)序列测定：直接挑选—个克隆送测序。测序结果与报道的基因组序列一致。

9.重组表达质粒的构建：

用限制性内切酶Nhe I、Xho I双酶切pGEM-MPT63重组质粒DNA和表达载体pET24b质粒DNA，于1％琼脂糖凝胶电泳，切取402bp的MPT63基因片段和5235bp的pET24b质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，MPT63基因片段与pET24b质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，在T₄ DNA连接酶催化下，于16℃连接过夜，次日取连接产物5μl转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，置37℃恒温箱孵育14h。挑选5个克隆分别转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，用碱裂解法提取质粒。

10.重组表达质粒的鉴定

分别用牙签随机调取6个克隆，提取质粒，采用PCR扩增和双酶切鉴定方法挑选重组子；鉴定正确的阳性克隆命名为pET24b-MPT63。

11.pET24b-MPT63工程菌的诱导表达及鉴定

将pET24b-MPT63质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，然后按1％转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养至OD₆₀₀为0.6左右时，加入IPTG，诱导4hr。

将诱导菌超声破碎后的上清、沉淀部分分别进行SDS—PAGE分析。将1×载样缓冲液150μl分别加入来自1ml菌液的上清、沉淀样本，混悬后，置100℃沸水浴5min，于12000rpm离心10min，取上清液40μl分别进行SDS-PAGE，电泳条件为：积层胶恒流10mA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h；用脱色液脱色至条带清晰。与对照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-MPT63-BL21(DE3)上清液在相对分子质量16—18kDa位置附近有浓重的表达条带出现，诱导4小时表达量最多；而pET24b-MPT63-BL21(DE3)沉淀部分只见少量特异蛋白表达带，MPT63工程菌是以细胞内可溶性蛋白的形式表达。

12.MPT63重组蛋白的纯化

将诱导菌超声破碎后，采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书纯化MPT63蛋白，SDS-PAGE电泳可见纯化的MPT63蛋白呈一条带，未见其他杂蛋白。

四、通过基因工程技术制备CFP10—ESAT6融合蛋白：

1、引物设计与合成

cfp10引物设计：

P1(上游)：5’-CCGGATCCATGGCAGAGATGAAGAC-3’

P2(下游)：5’-GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACC

             GAAGCCCATTTGCGAGGACAGCGCCT-3’

扩增片段：353bp

esat6引物设计：

P3(上游)：5’-GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGC

          GGCAGCATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGG-3’

P4(下游)：5’-CC AAGCTT TGCGAACATCCCAGTGA-3’

扩增片段：338bp

2、PCR扩增cfp10和esat6基因

分别用P1、P2和P3、P4引物，在Taq plus I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增CFP10和ESAT6基因。PCR反应程序：95℃ 5min；94℃20sec，60℃ 20sec，72℃ 2min，循环25次；最后72℃延伸7min。于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定353bp(cfp10)、338bp(esat6)的扩增DNA片段；回收这2个片段，分别取1ul回收片段作为模板，以P1和P4为引物扩增，于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定681bp的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的eppendrof管中。判定DNA片段位置时，使用长波紫外线，照射时间尽可能短。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书，具体方法如下：

向管中加入等体积的溶胶液(约0.4ml)，(可在55-65℃水浴中加热5-15min)直至琼脂糖完全融化；向管中加入0.6ml琼脂糖DNA纯化树脂，充分混匀；将注射器插入微量离心柱拧紧，拔出注射器活塞，将树脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；从微量离心柱上拔掉注射器，拔出注射剂活塞，将注射器插入微量离心柱拧紧，将2ml I型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml eppendrof管拧紧，向离心柱中加入150μl II型柱子清洗液，离心1200rpm 2-3min以清洗和干燥树脂；将微量离心柱插入一个新的1.5ml eppendrof管拧紧，向离心柱中加入40μl TE缓冲液，静置一分钟，12,000rpm离心20s；回收DNA洗脱液，定量，浓度约为50ng/μl。贮存于-20℃备用。

4、目的基因与pGEM-T载体连接：

参照Promega公司pGEM-T vector System-I产品说明，将纯化后PCR产物(50ng)与克隆载体pGEM-T连接，目的基因片段与载体片断按摩尔比3:1混合，10ul反应体系如下：

2×连接缓冲液(Rapid ligation Buffer)           5μl

pGEM-T载体(pGEM-T vector)                     1μl

PCR产物(PCR product)                          0.6μl

T₄ DNA连接酶(T₄ DNA ligase)                   1μl

无菌水(dH₂O)补足                              10μl

混匀后置于4℃冰箱反应12h，或者室温反应2h。75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：

挑取大肠杆菌DH5α(或BL21)单菌落接种于5ml LB培养液中，37℃，200rpm，培养过夜；次晨按1/100转种于100ml LB培养液中，37℃，继续培养2-3h，待菌浓度OD₆₀₀为0.6~0.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4℃、4000rpm、离心10min，弃上清；20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，冰浴30min；4℃、6000rpm、离心10min，弃上清；4ml0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，4℃冰箱放置过夜；次晨加入1ml无菌甘油，吹打混合均匀，100μl分装1.5ml eppendrof管，-70℃保存备用。

6.连接产物的转化：

将目的基因片段与PGEM-T的连接产物各5μl分别加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG 4μl，混匀，取出200—400μl涂布于含有氨苄青霉素(60ug/ml)的LB平板。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

7.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有氨苄青霉素60μg/ml的LB培养基，37℃振荡培养过夜，取3ml菌沉淀，根据《分子克隆》的碱裂解方法，小量提取质粒。

(1)质粒小量提取试剂的配制

溶液I： 50mmol/L葡萄糖

        25mmol/L Tris·CL(pH8.0)

        10mmol/L EDTA(pH8.0)

        在101bf/in²(6.895×10⁴Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4℃备用。

溶液II：0.2mmol/L NaOH，1％ SDS 临用前配

溶液III：5mol/L 乙酸钾  60ml

        冰乙酸         11.5ml

        去离子水       28.5ml

        贮存于4℃，备用。

(2)小量提取质粒

分别取约3.0ml菌液置试管中，12,000rpm离心1min，弃上清；菌体重悬于200μl溶液I中，冰浴10min；加400μl新配制的溶液II，冰浴5min；加300μl溶液III，冰浴10min；4℃ 12,000rpm离心10min；上清移入干净的管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；2倍体积的无水乙醇沉淀双链DNA，充分混合，-20℃放置2h；4℃ 12,000rpm离心10min，弃上清；用1ml 70％乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20μl TE中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20μg/ml，37℃水浴30min，消化RNA；取2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、定量，—20℃储存，备用。

8.鉴定重组质粒：

(4)PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以P1、P4引物进行PCR扩增鉴定。1％琼脂糖凝胶电泳，阳性重组质粒命名为PGEM-CFP10-ESAT6。

(2)酶切鉴定：取重组质粒5μl，分别用限制性内切酶双酶切2h；1％琼脂糖凝胶电泳。设置DNA分子量标准及扩增产物为参照，观察酶切后片断是否与扩增目的片断一致。

(3)序列测定：直接挑选一个克隆送测序。测序结果与报道的基因组序列一致。

9.重组表达质粒的构建：

用限制性内切酶BamH I及HindIII双酶切pGEM-CFP10-ESAT6重组质粒DNA和表达载体pET28a质粒DNA，1％琼脂糖凝胶电泳，切取630bp CFP10-ESAT6基因片段和5.344kb片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，基因片段与载体DNA按2∶1的摩尔比混合，在T4DNA连接酶催化下，16℃连接过夜，次日取连接产物5μl转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃恒温箱孵育14h。挑选3-5个克隆分别转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，37℃恒温振荡器培养过夜，用碱裂解法提取质粒。

10.重组表达质粒的鉴定

分别用牙签随机调取6—7个克隆，提取质粒，采用PCR扩增和双酶切鉴定方法挑选重组子；鉴定正确的阳性克隆命名为pET28a-CFP10-ESAT6。

11、pET28a-CFP10-ESAT6工程菌的诱导表达及鉴定

将pET28a-CFP10-ESAT6质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，37℃恒温振荡器培养过夜，然后按1％转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，37℃恒温振荡器培养至OD₆₀₀值为0.6—0.8时，加入IPTG，诱导3—4hr。

将1×载样缓冲液150μl加入来自1ml菌液的沉淀样本，吹打混匀，100℃沸水浴5min，12000g离心10min，取上清40μl进行SDS-PAGE，电泳条件为：积层胶恒流10mA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h；脱色液脱色至条带清晰，观察是否有目的蛋白表达条带。

应用0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mM浓度的IPTG诱导，pET28a-CFP10-ESAT6大肠杆菌工程菌的蛋白表达量无明显区别。

与对照菌pET28a-BL21(DE3)相比，pET28a-CFP10-ESAT6-BL21(DE3)菌体在相对分子质量28kDa位置附近有浓重的表达条带出现，诱导3-4小时时表达量最多，经激光密度扫描测定占菌体总蛋白的40％左右。将诱导菌超声破碎后的上清液和沉淀部分进行SDS-PAGE分析，重组蛋白均出现在破碎的上清中，沉淀极少，说明该重组蛋白主要以可溶形式表达。

12.CFP10-ESAT6重组蛋白的纯化

由于重组蛋白末端携带6×组氨酸，它可通过形成配位键而与金属螯合亲和层析柱上固定化的某些二价金属离子(如镍)结合，按试剂盒说明书直接纯化重组蛋白，蛋白纯度达90％以上。

五、通过基因工程技术制备MTB48蛋白：

1、引物设计与合成

上游引物(5’端含限制性内切酶Nhe I)5’—CCC AAGCTT CTT CGA CTC CTTACT GTC CT—3’

下游引物(5’端含限制性内切酶HindIII)5’—GCT AGC CAG TCG CAG ACG TGACG—3’

扩增片段：1.4kb

2、PCR扩增MTB48基因

用上下游引物，在Taq plus I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增mtb48基因。PCR反应程序：95℃ 5min；94℃ 20sec，60℃ 20sec，72℃ 2min，循环32次；最后72℃延伸7min。于1％琼脂糖凝胶电泳鉴定1.4kb的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，具体方法如下：

向管中加入等体积的溶胶液(约0.4ml)，直至琼脂糖完全融化；向管中加入0.6ml琼脂糖DNA纯化树脂，充分混匀；将注射器插入微量离心柱拧紧，拔出注射器活塞，将树脂混合物加入注射筒，插入注射器活塞，缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；从微量离心柱上拔掉注射器，拔出注射剂活塞，将注射器插入微量离心柱拧紧，将2ml I型柱子清洗液加入注射筒，用注射器活塞缓慢用力向下压，排出所有的液体和气体；取下微量离心柱，将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入150μl II型柱子清洗液，离心1200rpm 2-3min以清洗和干燥树脂；将微量离心柱插入一个新的1.5ml离心管拧紧，向离心柱中加入40μl TE缓冲液，静置一分钟，12,000rpm离心20s；回收DNA洗脱液，定量，浓度约为50ng/μl。贮存于-20℃备用。

4、目的基因与pGEM-T载体连接：

参照Promega公司pGEM-T vector System-I产品说明，将纯化后PCR产物(50ng)与克隆载体pGEM-T连接，目的基因片段与载体片断按摩尔比3:1混合，10ul反应体系如下：

2×连接缓冲液           5μl

pGEM-T载体              1μl

PCR产物                 0.6μl

T₄ DNA连接酶            1μl

无菌水补至              10μl

混匀后置于4℃冰箱反应12h，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：

挑取大肠杆菌DH5α(或BL21)单菌落接种于5ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度OD₆₀₀为0.6~0.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4℃、4000rpm、离心10min，弃上清；20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，冰浴30min；于4℃、6000rpm、离心10min，弃上清；用4ml 0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，置4℃冰箱放置过夜；次晨加入1ml无菌甘油，吹打混合均匀，每100μl分装于一个1.5ml的离心管中，置-70℃保存备用。

6.连接产物的转化：

将目的基因片段与PGEM-T的连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG 4μl，混匀，取出200—400μl涂布于含有60ug/ml氨苄青霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

7.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。

(1)质粒小量提取试剂的配制

溶液I：  50mmol/L葡萄糖

         25mmol/L Tris·CL(pH8.0)

         10mmol/L EDTA(pH8.0)

         在101bf/in²(6.895×10⁴Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4℃备用。

溶液II： 0.2mmol/L NaOH，1％ SDS 临用前配制

溶液III：5mol/L 乙酸钾    60ml

         冰乙酸          11.5ml

         去离子水        28.5ml

         贮存于4℃，备用。

(2)小量提取质粒

分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12,000rpm离心1min，弃上清；细菌沉淀重悬于200μl溶液I中，冰浴10min；加400μl新配制的溶液II，冰浴5min；加300μl溶液III，冰浴10min；于4℃ 12,000rpm离心10min；上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-20℃放置2h沉淀DNA；于4℃ 12,000rpm离心10min，弃上清；用1ml 70％乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20μl TE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20μg/ml，于37℃水浴30min，消化RNA；取2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置—20℃储存备用。

8.鉴定重组质粒：

(5)PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，设DNA分子量标准为参照，阳性重组质粒命名为PGEM-MTB48。

(2)酶切鉴定：取重组质粒5μl，分别用限制性内切酶Nhe I、Hind III双酶切2h；于1.2％琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准及扩增产物为对照，酶切后的片断与扩增片断一致。

(3)序列测定：直接挑选一个克隆送测序。测序结果与报道的基因组序列一致。

9.重组表达质粒的构建：

用限制性内切酶Nhe I和HindIII双酶切pGEM-MTB48重组质粒DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收1.4kb基因片段。同样方法酶切表达载体pET24b质粒，0.8％琼脂糖凝胶电泳回收5.3kb片段。用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化两个回收产物。定量后，基因片段与载体DNA按2:1的摩尔比混合，在T₄ DNA连接酶催化下，16℃连接过夜，次日取连接产物5μl转化E.coli DH5α感受态细胞，37℃恒温箱培育14h。挑选克隆3-5个分别转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，37℃恒温振荡器培养过夜，用碱裂解法提取质粒。

10.重组表达质粒的鉴定

分别用牙签随机调取6个克隆，提取质粒，采用PCR扩增和双酶切鉴定方法挑选重组子；鉴定正确的阳性克隆命名为pET24b-MTB48。

11.pET24b-MTB48工程菌的诱导表达及鉴定

将pET24b-MTB48质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑单克隆转种于5ml含50ug/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，然后按1％转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养至OD₆₀₀为0.8~1.0左右时，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导4—5hr。以空载体pET24b菌株菌株和工程菌诱导前菌液作为对照样本，离心，收集菌体，备用。

将诱导菌超声破碎后的上清、沉淀部分分别进行SDS—PAGE分析。将1×载样缓冲液150μl分别加入来自1ml菌液的上清、沉淀样本，混悬后，置100℃沸水浴5min，于12000rpm离心10min，取上清液40μl分别进行SDS-PAGE，电泳条件为：积层胶恒流10mA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h；用脱色液脱色至条带清晰。与对照菌pET24b-BL21(DE3)相比，pET24b-MTB48-BL21(DE3)沉淀部分在相对分子质量约50kDa位置附近有浓重的表达条带出现，诱导4-5小时表达量最多；而pET24b-MTB48-BL21(DE3)上清液部分只见少量特异蛋白表达带，MTB48工程菌是以包涵体形式表达。

12.MTB48重组蛋白的纯化

由于重组蛋白末端携带6×组氨酸，它可通过形成配位键而与金属螯合亲和层析柱上固定化的某些二价金属离子(如镍)结合，使重组蛋白直接纯化。MTB48蛋白以不可溶形式表达，因此选择含尿素的变性条件下纯化。将诱导菌超声破碎后，采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书纯化MTB48蛋白，SDS-PAGE电泳可见纯化的MTB48蛋白呈一条带，未见其他杂蛋白。

六、结核分枝杆菌LAM可采用已有商品，也可采用以下方法的制备：

1.结核分枝杆菌H37Rv 0.5克加蒸馏水15ml，80℃灭活2h；

2.超声粉碎，12000rpm离心30min，取上清；

3.加等体积的苯酚颠倒混匀，在68-70℃水浴中使成匀相，或冷却后于8000rpm离心10min，取出水相；

4.再加等体积的蒸馏水于酚相中萃取1次；

5.合并2次水相，离心去除沉淀；

6.回收所得即为脂多糖，低温贮存备用。

七、结核病抗体检测试剂盒的抗原的制备和贮存：

1.稀释液(0.5M氯化钠—20mM磷酸氢二钠—2％甘露醇，pH7.4)的配制：称取29.22g氯化钠、7.1628g磷酸氢二钠于700ml蒸馏水中，加入20g甘露醇，在磁力搅拌器上搅拌，加入盐酸调节pH值至7.4，加双蒸馏水定容至1000ml。

2.用稀释液稀释选用的结核分枝杆菌重组蛋白和糖抗原，使其浓度为1mg/ml；

3.混匀后除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，冷冻干燥，置4℃避光保存备用。

八、检测试剂盒中的酶联抗人IgG抗体、底物、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反应板，均可采用常规公知技术制备或直接选用已知的商品。

以下结合具体本发明检测试剂盒的实施例详细说明本发明，各实施例中的抗原原料均可通过上述制备方法获得，但不应构成对本发明实施范围的限定。

实施例1

(1)检测抗原的制备：用稀释液(0.5M氯化钠—20mM磷酸氢二钠—2％甘露醇，pH7.4)分别稀释结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD重组蛋白，使各结核分枝杆菌重组蛋白的浓度均为1mg/ml，再将各结核分枝杆菌重组蛋白稀释溶液混匀后除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，冷冻干燥备用；

(2)试剂盒的装配：将1mg/ml的结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD重组蛋白冻干管、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清各1支、30％过氧化氢1小瓶、邻苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反应板1块放入包装盒密封后，置4℃避光保存。

实施例2

(1)检测抗原的制备：用稀释液(磷酸盐缓冲液)分别稀释结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD、MPT63重组蛋白，使各结核分枝杆菌重组蛋白的浓度均为1mg/ml，再将各结核分枝杆菌重组蛋白稀释溶液混匀后除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，冷冻干燥备用；

(2)试剂盒的装配：将1mg/ml的结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD、MPT63重组蛋白冻干管、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清各1支、30％过氧化氢1小瓶、邻苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反应板1块放入包装盒密封后，置4℃避光保存。

实施例3

(1)检测抗原的制备：用稀释液(生理盐水)分别稀释结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD、MPT63、CFP10-ESAT6重组蛋白，使各结核分枝杆菌重组蛋白的浓度均为1mg/ml，再将各结核分枝杆菌重组蛋白稀释溶液混匀后除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，冷冻干燥备用；

(2)试剂盒的装配：将1mg/ml的结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD、MPT63、CFP10-ESAT6重组蛋白冻干管、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清各1支、30％过氧化氢1小瓶、邻苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反应板1块放入包装盒密封后，置4℃避光保存。

实施例4

(1)检测抗原的制备：用稀释液(0.5M氯化钠—20mM磷酸氢二钠—2％甘露醇，pH7.4)分别稀释结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD、MTB48重组蛋白，使各结核分枝杆菌重组蛋白的浓度均为1mg/ml，再将各结核分枝杆菌重组蛋白稀释溶液混匀后除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，冷冻干燥备用；

(2)试剂盒的装配：将1mg/ml的结核分枝杆菌LAM、38kD、16kD、MTB48重组蛋白冻干管、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清各1支、30％过氧化氢1小瓶、邻苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反应板1块放入包装盒密封后，置4℃避光保存。

上述各实施例的应用

(1)抗原包被：用包被缓冲液将LAM抗原稀释至1μg/ml，重组蛋白抗原稀释至10μg/ml，每孔加100μl。每板留1个孔，只加包被缓冲液，作为空白对照。置4℃过夜。次日用PBST洗板3次，3分钟/次。

(2)封闭：每孔加PBST—1％BSA 200μl，置37℃孵育1小时。用PBST洗板3次，3分钟/次。

(3)加待检样品：用PBST—1％BSA稀释待检样品，充分混匀后，每孔加100μl，做2个平行孔；同时做空白、阴性及阳性孔对照，置37℃孵育40分钟。用PBST洗板3次，3分钟/次。

(4)加酶标二抗：用PBST—1％BSA新鲜稀释酶标第二抗体，充分混匀后，每孔加100μl，置37℃孵育40分钟。用PBST洗板3次，3分钟/次。

(5)加底物液显色：每孔加100μl新鲜配制的底物溶液，置室温显色10分钟。

(6)终止反应：每孔加50μl 2M硫酸。

(7)酶标仪读数：以空白对照孔调零后，测各孔OD值，若大于或等于规定的阳性OD值即为阳性。结果见表1。

表1 应用结核多抗原ELISA方法检测正常人和结核病人血清中抗结核抗体

实施例1：LAM+38kD+16kD；

实施例2：LAM+38kD+16kD+MPT63；

实施例3：LAM+38kD+16kD+MPT63+CFP10-ESAT6

实施例4：LAM+38kD+16kD+MTB48

上述各实施例效果总结：

本发明选择灵敏度高、特异性较强、并具有互补性的结核分枝杆菌多糖LAM及重组蛋白38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6按自有的方法制备后，以不同组合联合作为结核病抗体检测试剂盒的抗原。通过ELISA方法评价四种不同抗原组合的试剂盒检测360例正常人和373例结核病人血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性。以6种抗原检测正常人抗体OD492的平均值(X)+2SD为阳性界限值，下列四种抗原组合检测健康人和结核病人血清中抗结核抗体的阳性率见表2：

表2

实施例1(LAM+38kD+16kD)；实施例2(LAM+38kD+16kD+MPT63)；实施例3(LAM+38kD+16kD+MPT63+CFP10-ESAT6)；抗原组合4(LAM+38kD+16kD+MTB48)。从表1可看出，实施例1检测结核病人的灵敏度和特异性为67.8％、89.2％；实施例2检测结核病人的灵敏度和特异性为69.7％、86.1％；实施例3检测结核病人的灵敏度和特异性为72.4％、83.6％；实施例4检测结核病人的灵敏度和特异性为69.2％、86.4％。虽然PPD皮试阳性和阴性健康人之间抗体水平差异并无显著性，但在PPD皮试阴性健康人中假阳性率很低，假阳性主要出现在PPD皮试阳性的结核感染者和卡介苗接种者中。虽然菌阳和菌阴两组结核病人之间抗体水平差异无显著性，但菌阳病人抗体的阳性率显著高于菌阴病人，菌阳病人的抗体水平也略高于菌阴病人。

Claims (5)

1、一种结核抗体多抗原ELISA检测试剂盒，主要由检测抗原、酶联抗人IgG抗体、底物、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清和聚苯乙烯微孔反应板所组成的一盒体，其特征在于，所述检测抗原采用结核分枝杆菌复合群菌种脂阿拉伯甘露糖(LAM)、38kD和16kD三种与MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白之中的任意1种或1种以上结核分枝杆菌重组蛋白组合作为检测抗原。

2、如权利要求1所述的的检测试剂盒，其特征在于，所述的结核分枝杆菌复合群菌种采用结核分枝杆菌。

3、如权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括：

(1)检测抗原的制备：采用基因工程技术克隆、表达产生，经纯化分别得到38kD、16kD、MPT63、MTB48、CFP10-ESAT6重组蛋白抗原，从结核分枝杆菌复合群菌株中提纯制备得到LAM；

(2)用稀释液分别稀释所述各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原，使各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原的浓度均为1mg/ml，再将各结核分枝杆菌重组蛋白或糖抗原稀释溶液混匀后除菌滤过，分装入一容器，1ml/支，冷冻干燥备用；

(3)试剂盒的装配：上述将1mg/ml的结核分枝杆菌各重组蛋白和糖抗原冷冻干燥管、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体、结核病人阳性对照血清、正常人对照血清、小牛血清各1支、30％过氧化氢1瓶、邻苯二胺1支、聚苯乙烯微孔反应板1块放入包装盒密封后，置4℃避光保存。

4、如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述多种结核分枝杆菌抗原是采用基因工程技术将其中的两种或两种以上蛋白抗原融合表达产生。

5、如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌抗原采用分别单独配制或混合配制。