CN102719438A - 一种能特异结合结核菌抗原的核酸适配子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能特异结合结核分枝杆菌抗原的核酸适配子及其用途。该适配子是针对结核分枝杆菌分泌抗原CFP10-ESAT6融合蛋白的小分子单链DNA（ssDNA），其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。该小分子单链DNA具有与单克隆抗体类似功能，能直接并特异结合CFP10-ESAT6蛋白。采用适配子直接法或适配子和多克隆抗体的夹心法（或称酶联寡核苷酸夹心吸附法），能在2小时内快速有效地检测肺结核、肺外结核等病人血清（或血浆）中的CFP10和ESAT6抗原。本适配子建立的技术能灵敏检测结核病人血样或体液中的结核特异早期分泌性抗原CFP10-ESAT6蛋白或抗体，对血清中CFP10-ESAT6抗原检测的灵敏度可达到检测﹤0.01ng/ml。
Description
技术领域
本发明属于分子微生物学和感染免疫领域，涉及一种长约30nt的单链DNA（single strand DNA,ssDNA）适配子及其应用，该适配子能特异性、高亲和力地结合结核分枝杆菌特异性分泌蛋白CFP10、ESAT6，可用于血清学诊断结核病早期感染。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌（M.tuberculosis）感染机体所引起的疾病，涉及到全身多个脏器。目前，全球约1/3的人感染过结核分枝杆菌，每年约有200万人死于结核感染（Dye C SS,Dolin P PV，RaviglioneMC.Consensus statement.Global burden of tuberculosis:estimatedincidence,prevalence,and mortality by country.W.H.O.GlobalSurveillance and Monitoring Project.J Am Med Assoc.1999.282:677-686.），结核病正严重威胁人类的健康。目前我国结核感染的现状为：每年新增结核病患达130万之多，每年因结核死亡的人数有15万，结核疫情呈现出患病率高、死亡率高、耐药率高、年递减率低的现状，疫情严重度仅次于印度(全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告.中华结核和呼吸杂志.2002.25(1):3-7.)。目前国际上针对结核分枝杆菌的检测技术分为三类：细菌学检测、免疫学诊断、分子生物学诊断。细菌学检测是一种传统的检测手段，包括痰涂片抗酸染色以及痰培养，已经在临床上广泛应用多年，是公认的检测结核分枝杆菌的标准性诊断，痰涂片抗酸染色可能漏诊痰涂片阴性的患者，而痰培养又耗时长，需2-8周时间，因而其使用也受到极大的限制（Martinez A,Balandrano S,Parissi A,et al.Evaluation of new external quality assessment guidelines involvingrandom blinded rechecking of acid-fast bacilli smears in a pilot projectsetting in Mexico.Int J Tuberc Lung Dis.2005.9(3):301-305.）。免疫学诊断结核分枝杆菌的方法有结核菌素试验以及特异性T淋巴细胞IFN-γ释放试验。这两者检测结核抗原特异性T细胞反应，结核菌素试验是利用纯蛋白衍化物（purified protein derivative,PPD）诱导的迟发型反应来对T细胞的功能进行检测，但PPD中大多数蛋白成分是各种分枝杆菌所共有成分，尤其是接种BCG后与感染结核分枝杆菌后，这两者很难区别，所以该方法存在特异性差的弊端。所以建立一种新型检测方法，实现对血清中结核分支杆菌感染的早期诊断，对于控制结核病疫情意义重大。分子生物学诊断主要包括DNA探针法，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）以及定量PCR的方法。其中，PCR的方法主要针对结核分枝杆菌基因组中一段保守序列，通过PCR的方法能快速检测结核分枝杆菌，但是存在假阴性和假阳性，而且无法区分是活菌还是死菌，因此不能用于化疗后监测。
CFP-10和ESAT-6最早发现于结核分枝杆菌的早期培养滤液之中，是结核分枝杆菌早期、特异性地分泌的小分子量蛋白，不存在与卡介苗（BCG）中。编码这两种蛋白的基因分别为Rv3874和Rv3875，在结核分枝杆菌基因组中紧密相邻，受同一个启动子转录，所编码的两种蛋白质是以一种1:1的二聚体的形式分泌至细菌外，两者之间主要靠疏水性氨基酸以及范德华力紧密地相互作用（Renshaw PS,Panagiotidou P，Whelan A,et al.Conclusive evidence that the majorT-cell antigens of the Mycobacterium tuberculosis complex ESAT-6 andCFP-10 form a tight,1:1complex and characterization of the structuralproperties of ESAT-6,CFP-10,and the ESAT-6-CFP-10complex.Implications for pathogenesis and virulence.J Biol Chem.2002,277(24):21598-21603.）。编码这两种蛋白的基因位于致病分枝杆菌基因组的RD-1区（region of difference-1），RD-1区只存在于致病结核分枝杆菌中，而在所有非致病的卡介苗-BCG菌株中均缺失，因而，检测CFP-10和ESAT-6不仅能有效地辅助诊断结核分枝杆菌的感染，而且还能有效地区分是结核分枝杆菌感染还是BCG接种(Bardarov S,Bardarov JS Jr,Pavelka JMS Jr，et al.Specialized transduction:anefficient method for generating marked and unmarked targeted genedisruptions in Mycobacterium tuberculosis,M.bovis BCG and M.smegmatis.Microbiology.2002.148(Pt10):3007-17.)。
适配子与抗体功能类似。适配子能特异性地识别靶分子，并能与靶分子高亲和力地结合。其与靶分子的结合的解离常数（Kd值）一般可达nmol/L，高者可达pmol/L。核酸适配子与单克隆抗体相比具有如下优点：1）单克隆抗体制备周期长，投入成本高。而适配子一般通过10-15轮筛选即可获得，制备周期较短，且投入成本低，大大节省资源；2）单克隆抗体属于蛋白质，对温度较敏感，长距离运输十分不易，而适配子却没有这方面的要求，用之前，只需先95℃变性，然后立即置于冰浴即可；3）不同批次制备的单克隆抗体效价差别比较大，而适配子可以通过化学合成、采用核酸蛋白检测仪或紫外分光光度计精确定量；4）靶物质的免疫原性的好坏可能影响单克隆抗体的制备，但是对于制备其特异性的适配子却无影响；5）相比单克隆抗体而言，适配子分子量小，更容易进行化学标记，如荧光、生物素等标记。
指数富集的配体系统进化（systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX），是一种结合体外筛选与PCR扩增的组合技术，从人工合成的随机寡核苷酸文库（RNA文库或者单链DNA文库）中筛选到能特异性地结合靶分子的寡核苷酸配体。该方法是基于小片段RNA和ssDNA分子能通过局部碱基配对形成特异的空间构象，并借助氢键、疏水键、范德华力等与靶分子高亲和力地结合(Tuerk C,Gold L.Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science.1990.249(4968):505-510.)。SELEX技术的基本流程为：分离与靶分子高亲和力的单链寡核苷酸，对称PCR大量扩增dsDNA文库，然后不对称PCR得到ssDNA文库，用于下一轮筛选，如此经过结合-分离-扩增-结合的若干循环后，可以获得具有与靶分子高亲和力的寡核苷酸适配子。然而，通过ssDNA适配子的筛选具有较大的随机性，有效的高亲和力适配子的获得具有较大难度。而且不同筛选条件所筛选出的适配子序列不同，与靶分子的亲和力也不同。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能特异性地、高亲和力地结合结核分枝杆菌早期特异性分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的ssDNA适配子的一级序列；
本发明的第二个目的在于提供上述DNA适配子在制备诊断结核病检测血清或体液中CFP10和ESAT6抗原或其抗体的诊断试剂中的应用；
本发明的目的还在于提供制备上述DNA适配子的方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明通过随机单链DNA文库以及引物的构建、SELEX筛选、PCR扩增、亲和力测定、体外不同细菌结合实验等得到具有与结核分支杆菌CFP10和ESAT6抗原的高特异性、高亲和力的DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过免疫学实验证实该适配子可以灵敏地诊断结核病检测血清或体液中CFP10和ESAT6抗原。此外，本领域技术人员可以在本发明SEQ ID No.1的基础上，通过替换、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，也能得到与本发明具有同等功能的适配子序列。例如，可以将SEQ ID No.1序列的第1位核苷酸缺失或者将第4位核苷酸A替换为G，或者在第25位添加G。另外，以SEQID No.1为核心序列，按SEQ ID No.2（n30为SEQ ID No.1所示的核心序列）中SEQ ID No.2由所述核心序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列也具有该功能。据此，本发明提供的能特异结合结核分枝杆菌分泌抗原CFP10和ESAT6的核酸适配子，其核苷酸序列为：
1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
2）SEQ ID No.1所示核苷酸序列经替换、缺失和/添加一个或几个核苷酸形成的具有SEQ ID No.1同等功能的序列；或，
3）含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列，基于SEQ ID No.2由1）所述序列向其3’和/或5’端延伸所得到的序列，其中SEQ ID No.2中的n30为1）所述的核心序列。
进而，本发明提供上述DNA适配子在制备结核病诊断试剂中的应用。例如可以通过诊断结核病检测血清或体液中CFP10、ESAT6抗原或其抗体的从而确定病人是否患有结核病。本领域技术人员可以将本发明适配子制成各种可用于诊断结核病的诊断试剂。
本发明ssDNA可以采用任何方法制备获得，例如包括不限于：直接合成；通过不对称PCR得到；采用普通PCR方法，在任一引物上连接可分离标记（例如生物素标记），获得PCR产物后变性分离。发明的优点和效果
本发明筛选并得到针对靶分子CFP10-ESAT6融合蛋白的适配子，该适配子能高亲和力、高特异性地与该蛋白结合。发明人直接将该适配子运用于临床血清样品检测，结果表明，无论是肺内结核还是肺外结核（肠结核），运用该适配子均能快速有效检测，与目前诊断结核感染的T-SPOT法(其是反映CFP10-ESAT6抗原特异性细胞活化后释放IFN-γ水平的方法)相比较，本发明的试剂与应用实施较为简单，无需分离患者的外周血单核细胞（PBMC），并且直接对CFP10-ESAT6抗原水平进行检测。本发明克服了传统上检测结核病人痰液细菌的抗酸染色灵敏度低的严重问题，也克服了传统上仅能检测结核病人血清中抗体，而不能检测抗原的局限性，以及不能诊断窗口期早期感染的严重问题，同时，该适配子还可用于诊断病人血样中结核抗体。该适配子制备简单，成本低，可作为一种有效的新型结核感染的早期诊断试剂，包括肺内结核和肺外结核（如肠结核）。
附图说明
图1.SDS-PAGE、Western Blot和质谱分析鉴定CFP10-ESAT6融合蛋白
A图为CFP10-ESAT6（CE）融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白分子量标准，1～5分别为IPTG诱导0h、1h、2h、3h、4h细菌裂解上清的SDS-PAGE鉴定结果；B图为纯化的蛋白SDS-PAGE电泳图；C为相应的Western Blot图，由图可知，该融合蛋白分子量介于26KD与34KD之间；D图为用肽指纹图谱法检测该融合蛋白的一级结构的正确性。所示，从质谱图看出，主峰对应的分子量依次为1142、1573、1593、1668、1901、2003，和理论预测的酶切片段分子量接近。因而进一步论证该目的蛋白即为本发明的目的蛋白。
图2.检测各轮ssDNA适配子库与靶蛋白的亲和力
如图2所示，检测第1、3、5、7、9、11、13、15、16、17轮的ssDNA库与靶蛋白的亲合力，从结果可以看出，第15轮的ssDNA库与靶蛋白亲和力最高。
图3.不同适配子与靶蛋白的亲和力比较。
如图3A所示，第15轮的ssDNA库中分离获得30个单适配子，横坐标的编号为单适配子的编号，由图可知，1、5、6、8、11、15、18、24号这8个适配子与靶蛋白亲和力最高(图3A)，因而，将该8个适配子作为候选适配子，并命名为CE1、5、6、8、11、15、18、24。候选适配子对CE蛋白的结合力呈剂量依赖性。
图3B检测结果显示出CE24单适配子具有较高的特异性和较好的检测稳定性和剂量依赖性，因而以后实验均以适配子CE24进行进一步临床验证。
图4.适配子直接法检测CE蛋白的灵敏度
如图4所示，包被不同浓度的表达纯化的CE蛋白和牛血清白蛋白（BSA），以生物素标记的CE24进行检测,可见灵敏度可达0.01ng/ml。
图5.适配子CE24直接法检测肠结核、肺结核、肠克罗恩病人血清中的CE蛋白
由图5可知，15例肠结核病人以及19例肺结核病人的血清检测OD值，明显高于25例克罗恩病人以及14例健康体检者，经统计学分析（t检验），其肠结核病人组和肺结核病人组血样检测值与健康志愿者之间比较，P均小于0.01，差异具有显著性。肠结核病人组和克罗恩病人组之间，P均小于0.01其差异亦具有显著性。图6.适配子CE24直接法检测结核病人血清中抗CE蛋白的抗体
如图6所示，包被结核病人血清和正常人血清，加入纯化的CE蛋白，随后以生物素标记的CE24适配子进行检测，发现两组间具有显著的差异（p<0.001）。
图7.适配子和多克隆抗体夹心法检测结核病人血清中的CE蛋白抗原
如图7所示，包被多克隆抗体（兔抗CE蛋白或抗结核菌的抗血清，1：200～1—：500稀释），加入人血清标本（正常人和结核病人），以生物素标记的CE24适配子进行检测，发现两组间具有显著的差异（p<0.05）。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1适配子的筛选
1、纯化并鉴定CFP10-ESAT6融合蛋白
构建原核表达质粒pET28a-CFP10-ESAT6（或称pET28a-CE，李娟，吴雪琼，张俊仙，等.结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达[J].中国防痨杂志，2004,26(4):204-208.），在CFP-10和ESAT-6片段之间加入一段linker序列，该序列对应的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，该序列的存在可以提高CFP10-ESAT6融合蛋白(简称CE融合蛋白或CE蛋白)中CFP-10和ESAT-6序列之间的柔韧性，从而充分保持各自的天然构象。
将正确质粒转化至大肠杆菌BL21中，从卡那霉素抗性（Kanr）平板上挑取单克隆，接种于5ml无菌预先按1:1000加入卡那霉素的LB培养基中（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，溶于双蒸水中，定容至终体积为1000mL，121℃灭菌20min），37℃振摇过夜。按1:40的比例，将新鲜培养的菌液加入到20ml预先按1:1000加入卡那霉素的2×YT培养基中（胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g溶解到灭菌双蒸水中定容至1L,121℃灭菌20min。），37℃，200rpm继续培养。当菌液生长至对数生长后期，即OD值约为0.6-0.8时，向其中加入异丙基-β-D-留待吡喃半乳糖苷（IPTG）(分子量:238.30)，使其终浓度为0.84mM,继续于37℃，200rpm/min。分别在诱导4小时后,收取诱导菌液各12000rpm离心1min,弃上清，收集菌体。用高压均质仪在4℃的条件下，用950kpa的压力进行破菌。向细菌裂解液中加入终浓度为1%（v/v）的曲通X-100（TritonX-100），冰上轻摇1小时。10000转每分钟离心，共三次离心，依次为30分钟、10分钟和5分钟，直至肉眼看不见明显的菌体沉渣，最后收集上清液，备用。在上步的同时，用洗涤缓冲液（50mM NaH2PO4·2H2O，200mM NaCl，20mM咪唑（imidazole）,用NaOH调pH至8.0）平衡镍(Ni)柱（美国AmershamBiosciences公司，约用Ni柱800ul）共三次，每次用3000rpm离心2分钟。将用咪唑平衡好的Ni柱加入到细菌裂解液上清中，让其在冰上轻摇作用1小时，5000rpm离心两分钟收集Ni柱。用含20mM咪唑的洗涤缓冲液洗涤Ni柱3次，每次用3000rpm离心两分钟收集Ni柱。最后用洗脱缓冲液（50mM NaH2PO4·2H2O，200mM NaCl，200mMAmidazole,用NaOH调pH至8.0）在冰上与Ni柱作用，间或混匀，作用20分钟后，用3000rpm离心2分钟，收集上清，此上清即为含高浓度CE蛋白溶液,冻存于-80℃，备用。将靶蛋白进行电泳，结束后分别进行考马斯亮蓝染色和western blot检测。在胶块染色后，切下目的蛋白位置的胶块，用trypsin进行胶带酶解过夜，进行质谱分析。（对应图1）
2.构建随机单链DNA（ssDNA）文库及引物
人工合成一段随机ssDNA序列：5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’(88nt)，N代表A、C、T或G中的任意一个碱基。上游引物为：5’-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGA ACAGTCCGAGCC-3’，画线部分为EcoRI的DNA限制性酶切位点；下游引物为：5’-GCGGGATCCTATGACGCATT GACCC-3’，画线部分为BamHI的DNA限制性酶切位点。该随机单链DNA文库以及引物均可由公司合成。
3、双链DNA(dsDNA)及ssDNA文库的PCR扩增及保存
每一轮筛选前先将ssDNA文库扩增为dsDNA文库后保存，取少量dsDNA文库作为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。反应程序均为：95℃5min，95℃36s，60℃36s，72℃84s，20～30个循环，72℃5min。循环次数根据具体的扩增效果进行调整。PCR产物通过3%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶纯化试剂盒进行回收（按照试剂盒产品说明书操作）。
4、借助指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment，SELEX)筛选
该方法是基于小片段ssDNA分子能通过局部碱基配对形成特异的空间构象，并借助氢键、疏水键、范德华力等与靶分子高亲和力地结合。SELEX技术的基本流程为：分离与靶分子高亲和力的单链寡核苷酸，对称PCR大量扩增dsDNA文库，然后不对称PCR得到ssDNA文库，用于下一轮筛选，如此经过结合-分离-扩增-结合的若干循环后，可以获得具有与靶分子高亲和力的寡核苷酸适配子。
每轮筛选所用的ssDNA量均为40pmol，使用前置于95℃水浴10分钟后迅速冰浴5min；将提纯的结核分支杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白溶于pH9.6的碳酸盐包被缓冲液(Na2CO31.5g,NaHCO32.9g,Na2N30.2g,加水1000ml,调节pH至9.6)中包被96孔ELISA板，4℃过夜；使用筛选洗脱液（20mM pH7.4Tris·HCl，137mM NaCl，5mM KCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2）反复洗涤6次后加入40pmol的ssDNA文库，37℃孵育1h后用筛选洗脱液洗涤6次；在筛选孔中加入100μl高压灭菌的双蒸水（ddH2O），95℃加热10分钟；将孔内ddH2O吸至新的EP管中，经PCR反应之后，将PCR产物加入1/10体积的3摩尔每升浓度的醋酸钠（NaAc）然后再加入2倍体积的无水乙醇及置于-70℃沉淀过夜，最后通过凝胶回收。随着筛选的进行，逐渐减少包被的纯化蛋白质的量，从10ug每孔到0.5ug每孔，从而进一步提高了适配子对靶物质的结合特异性，更有利于高亲和力的适配子的筛选。
如此经过16轮的筛选，得到17轮dsDNA文库，用不对称PCR的方法扩增各轮生物素标记的ssDNA文库，扩增体系如下：
用类似ELISA的方法，检测各轮ssDNA文库与靶蛋白（CFP10-ESAT6融合蛋白）的结合力，方案如下：
1.将靶蛋白（CE蛋白）用碳酸氢盐包被液稀释后包被微孔板，2g每孔，4℃过夜，然后在37℃包被2小时。
2.将各轮的生物素标记的ssDNA库，分别测定其浓度，备用。（在孵育前，先95℃10min,然后立即放在冰上10min）
3.用2%PBST-BSA封闭微孔板，37℃作用1小时。
4.用PBST洗涤微孔板3次，5min/次。
5.将各轮生物素标记的适配子库按40pmol/孔加入至微孔板中，每轮适配子库做3个复孔，37℃作用1小时。
6.用PBST洗涤微孔板3次，5min/次。
7.加入HRP标记的链酶亲和素（1：2000稀释），100 l/孔，37℃作用45分钟。
8.用PBST洗涤微孔板3次，5min/次。
9.加入TMB底物，37℃下作用1min至3min,观察颜色变化。然后用2M浓硫酸终止。
用包被蛋白，且用BSA封闭，但不加适配子的孔为调零孔，用酶标仪读出OD450值。
如图2所示，第15轮15th ssDNA pool与靶蛋白结合力最高。将第15轮dsDNA pool构建至pUC19载体中，挑取25个克隆测序，得到24个阳性克隆子。分别扩增24个单克隆生物素标记的ssDNA，检测各个单适配子与靶蛋白的亲和力，并选取结合力较高的8条候选适配子（图3A所示），检测其与靶蛋白结合的剂量依赖性，实验结果（图3B）表明，CE24适配子能与靶蛋白高亲和力高特异性结合且实验结果稳定，其一级序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2抗体包被适配子检测夹心法检测CE蛋白的灵敏度
96孔ELISA板(Costar)后，将兔抗CE蛋白抗血清（也可以是兔抗结核菌H37Rv的多抗血清）按1：200～1：500稀释包被ELISA板，将CE蛋白和BSA用pH9.6的碳酸盐缓冲液（Na2CO31.5g,NaHCO32.9g,Na2N30.2g,加水1000ml,调节pH至9.6）配制成10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml浓度梯度每孔加入50μl，于4℃中孵育过夜后以PBST洗涤3次，每次2分钟；然后每孔加入100μl封闭液（0.2%明胶）于37℃孵育1小时，再以PBST洗涤3次，每次2分钟；随后每孔再加入50μl浓度为100nM生物素标记的CE24适配子,在37℃或者室温（25℃）下孵育1小时，PBST洗涤，共洗3次，每次2分钟。后加入50μl链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)（1：2000稀释）于37℃条件下作用30分钟，PBST洗涤3次，每次2分钟；最后以50μl四甲基联苯胺（TMB）为显色底物37℃孵育3分钟，再加入2M浓硫酸50μl终止反应，用酶标仪在450nm处比色。
结果如图4所示，包被不同浓度的表达纯化的CE蛋白和牛血清白蛋白（BSA），以生物素标记的CE24进行检测,可见灵敏度可达0.01ng/ml。
实施例3适配子直接法检测肠结核、肺结核、肠克罗恩病人血清中的CE蛋白
将96孔ELISA板中每孔分别加入各种血清100μl（包括肠结核、肺结核、肠克罗恩病及健康志愿者的血清），于4℃下孵育过夜，PBST清洗3次，每次2分钟。每孔加入100μl2%BSA于37℃封闭1小时后再次用PBST洗涤3次，每次2分钟；随后每孔加入300nM生物素标记的CE24适配子100μl，于37℃或者室温（25℃）孵育1小时，PBST清洗3次，每次2分钟。随后加入50μl链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)（1：2000稀释）于37℃条件下作用30分钟，PBST洗涤3次，每次2分钟；最后以50μl四甲基联苯胺（TMB）为显色底物37℃孵育3分钟，再加入2M浓硫酸50μl终止反应，用酶标仪在450nm处比色。
按上述方法选取肠克罗恩病（bowl crohn’s disease）病人血样25例，肠结核病(intestinal TB)的病人血样15例，在武汉市结核病院住院的肺结核(pulmonary TB)病人血样19例，健康体检者血样14例，用CE24检测血清中靶标抗原：CFP-10、ESAT-6。
由图5可知，15例肠结核病人以及19例肺结核病人的血清检测OD值，明显高于25例克罗恩病人以及14例健康体检者，经统计学分析（t检验），其肠结核病人组和肺结核病人组血样检测值与健康志愿者之间比较，P均小于0.01，差异具有显著性。肠结核病人组和克罗恩病人组之间，P均小于0.01其差异亦具有显著性。
实施例4适配子直接法检测结核病人血清中抗CE蛋白的抗体
在96孔板中每孔加入结核病人或正常人血清50μl，于4℃下孵育过夜，以PBST洗涤3次，每次2分钟；以100μl封闭液（0.2%明胶）于37℃封闭2小时，重复以PBST洗涤3次，每次2分钟；然后加入纯化的CE蛋白5μg/ml每孔50μl,PBST洗涤3次，每次2分钟；然后每孔加入50μl浓度为200nM生物素CE24适配子，在37℃或者室温（25℃）下孵育1小时，PBST洗涤3次，每次2分钟。随后加入50μl链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)（1：2000稀释）于37℃条件下作用30分钟，PBST洗涤3次，每次2分钟；最后以50μl四甲基联苯胺（TMB）为显色底物37℃孵育3分钟，再加入2M浓硫酸50μl终止反应，用酶标仪在450nm处比色。
如图6所示，包被结核病人血清（24例）和正常人血清（21例），加入纯化的CE蛋白，随后以生物素标记的CE24适配子进行检测，发现两组间具有显著的差异（p<0.001）。
实施例5适配子和多克隆抗体夹心法检测结核病人血清中的CE蛋白
在96孔板中包被制备的兔抗结核菌的多抗血清（也可以是兔抗CE蛋白血清）按1:200稀释，每孔50μl，于4℃下孵育过夜，以PBST洗涤3次，每次2分钟；以100μl封闭液（0.2%明胶）于37℃封闭2小时后，PBST清洗3次，每次2分钟。加入人血清标本（结核病人和正常人）每孔50μl,然后每孔加入50μl浓度为200nM生物素CE24适配子，在37℃或者室温（25℃）下孵育1小时，PBST洗涤3次，每次2分钟。随后加入50μl链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)（1：2000稀释）于37℃条件下作用30分钟，PBST洗涤3次，每次2分钟；最后以50μl四甲基联苯胺（TMB）为显色底物37℃孵育3分钟，再加入2M浓硫酸50μl终止反应，用酶标仪在450nm处比色。
结果如图7所示，包被制备所得多克隆抗体血清，加入人血清标本（正常人26例和结核病人30例），以生物素标记的CE24适配子进行检测，发现两组间具有显著的差异（p<0.05）。
实施例6与现有基于CE蛋白的结核诊断方法之间的比较
本发明所得针对CFP10、ESAT6蛋白的适配子以及建立的检测方法与市售的结核检测试剂盒的各种特征的比较。本发明可以在两小时内完成对CE蛋白的直接检测，且灵敏度高达0.01ng/ml，并且最终的结果判断仅需普通酶标仪即可。
表1.两种市售结核病检测相关试剂盒与本专利的主要特征的比较
Claims (4)
1.一种能特异结合结核分枝杆菌分泌抗原CFP10和ESAT6的核酸适配子，其核苷酸序列为：
1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
2）SEQ ID No.1所示核苷酸序列经替换、缺失和/添加一个或几个核苷酸形成的具有SEQ ID No.1同等功能的序列；或，
3）含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列为核心序列并两边延长的序列，基于SEQ ID No.2由1）所述序列向其3’和/或5’端延伸所得到的序列，其中SEQ ID No.2中的n30为1）所述的核心序列。
2.权利要求1所述核酸适配子在制备结核分枝杆菌早期分泌性抗原或抗体诊断试剂以及结核病早期感染诊断试剂中的应用。
3.含有权利要求1所述核酸适配子的诊断试剂。
4.制备权利要求1所述核酸适配子的方法，其采用：
1）人工合成；
2）不对称PCR；或，
3）采用PCR法，在其中一个引物中引入生物素标记，PCR产物变性后用亲和素分离。
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