CN102399753A - 一种小麦矮腥黑粉菌的特异性单克隆抗体及免疫荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明“一种小麦矮腥黑粉菌的特异性单克隆抗体及免疫荧光检测方法”，属于生物检测技术。本发明提供了分泌小麦矮腥黑粉菌的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞CGMCC No.5270，以及该单克隆抗体在检测和鉴别小麦矮腥黑粉菌中的应用，特别是采用该单克隆抗体的试剂盒以及荧光检测方法。

Description

一种小麦矮腥黑粉菌的特异性单克隆抗体及免疫荧光检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术，涉及一种小麦矮腥黑粉菌的特异性单克隆抗体以及免疫荧光检测法。

技术背景

小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa Kühn，简称TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产具有毁灭性危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一(王圆.小麦矮腥黑穗病菌[M].中国进境植物检疫有害生物选编，中华人民共和国动植物检疫局和农业部植物检疫实验所编，北京：中国农业出版社，1997，95～98)。在小麦矮腥黑穗病流行年份引起的产量损失一般为20～50％，严重时可达75～90％，甚至绝产。病菌抗逆性极强，其冬孢子在土中可存活3～7年，包裹在菌瘿中的冬孢子甚至可保持活力长达10年以上。此病害一旦发生，很难防治或根除，所以国际上有15个国家将其列为检疫对象加以防范。我国从20世纪60年代开始一直将此病害列为一类对外检疫对象。在腥黑粉菌中，TCK与其近缘种小麦网腥黑粉菌在形态学上极为相似，难于区别。

传统的病害诊断、检测方法主要是依据病原形态学、生理学和生物化学的特性，不但过程繁琐、时间周期长，而且准确性差、精度不高。分子生物学手段快速、准确地鉴别小麦矮腥黑粉菌具有重要的理论意义和实用价值。1996年Ferreira等(Ferreira M.A.，Tooley P.W.，Hatziloukas E.etc.Isolation of a species specific mitochondrial DNA sequence for identification ofTilletia indica，the Karnal bunt of wheat fungus[J].Application Environment Microbiology，1996，62：87～93)首次将PCR技术引进到印度腥黑穗病(Tilletia indica Mitra)的鉴定中来，他们选择了印度腥黑粉菌线粒体DNA的一个2.3kb的EcoR I片段进行了克隆和测序，设计的特异性引物Ti1/Ti4从25种腥黑穗病菌菌株中鉴定出了印腥。另外，Smith等(Smith O.P.，Peterson G.L.Beck R.J.etc.Development of a PCR-based method for identification of Tilletiaindica，causal agent of karnal bunt of wheat[J].Phytopathology，1996，86：115～122)通过克隆印度腥黑粉菌线粒体DNA的Dra I片段，进行了序列分析，设计了两套寡核苷酸引物对Ti17/M1和Ti17/M2，能分别从印度腥黑粉菌中扩增出大小为825bp和118bp特异性片段，也实现了对印度腥黑穗病的检测鉴定工作。2000年Frederic等(Frederick R.D.，Snyder K.E.，Tooley P.W.Identification and Differentiation of Tilletia indica and T.walkeri using the Polymerase ChainReaction[J].Phytopathology，2000，90：951-960.)根据线粒体的差异设计了5对针对印度腥黑粉菌的特异性引物和3对针对黑麦草腥黑粉菌的特异性引物，分别能将印度腥黑粉菌菌株和黑麦草腥粉菌病菌株从其近缘属种中鉴别出来。张竞宇等(张竞宇，张正光，郑小波，等.小麦印度腥黑穗病菌的分子检测[J].高技术通讯，2004，1：31～36)利用核糖体ITS序列上的差异在Tilletia属20个种中设计了一对特异性引物T1/T2，能将T.indica和T.walkeri从其它种中区分开来，而后又根据T.indica和T.walkeri线粒体之间的差异设计了一对特异性引物M1/M2，可以将二者区分开来，为了使反应更为灵敏，建立了套式PCR技术，以便于提供更简单的鉴定方法。梁宏等(梁宏，彭友良，张国珍，等.腥黑粉菌属3种检疫性真菌rDNA2IGS区的扩增及其序列分析[J].植物病理学报，2006，36(5)：407-412)依据核糖体的IGS1区特性，设计了一对特异性引物，可以将小麦光腥黑粉菌菌株从其近缘属种中鉴别出来。2004年高强(高强.小麦矮腥黑穗病的分子检测[D].长沙，湖南农业大学，2004)利用RAPD技术找到了一条可以将小麦网腥黑粉菌菌株和小麦矮腥黑粉菌菌株区别于其它黑粉菌株的条带，但是很遗憾在矮腥黑粉菌和网腥黑粉菌之间没有找到有差异的条带，没能将二者分开。2006年周业琴，刘素萍等(周业琴，刘素萍，周国梁，等.水稻腥黑粉病菌的单孢检测[J]。植物检疫，2006，20：38～41)应用核糖体ITS序列的通用引物Til1/Til4和两对特异性引物(Hor2/Hor9；Hm1/Hm5)结合建立了套式PCR技术，可以将水稻腥黑粉菌标定出来。本实验室陈万权、刘太国、刘建华利用AFLP技术，找到了小麦矮腥黑粉菌的特异性片段，能将小麦矮腥黑粉菌从其近缘属种中区分开来，该技术已经获得国家发明专利，专利号为：200510080073.7，本实验室的另外三个专利涉及采用ISSR的方法获得小麦矮腥黑穗病的特异性分子标记，灵敏度分别可达到1ng/25ul.

分子检测可实现准确、快速、高通量，但是需要较高的检测设备要求如PCR仪、电泳仪等，并且，这些方法在海关的实际检测过程中不仅耗时费工，且其准确性和可靠度在很大程度上取决于工作人员的经验积累与技术水平。因此，有必要研发简单易行、灵敏准确的快速诊断和检测技术，其于鉴别病害、提高病害预测预报的准确度均具有重要的理论意义和实际应用价值。

单克隆抗体技术，是由单细胞系列产生的同一种抗体蛋白，其仅与抗原分子中的一个抗原决定簇结合，故与抗原性物质反应时相对专一，不受其它物质干扰，能区别物种间的细微差异。利用该方法检测病原菌具有诸多优点，如易于大量生产、可高通量检测、免用标记物，较易实现病菌的快速、实时、实地检测(Ward et al.，2004；Werres & Steffens，1994)，促使其迅速在农学、医学和食品学中得到广泛应用。同时，该方法涉及的仪器化程度较低、操作简便，特别是对样本前处理要求简单易于推广，国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一。因而，单克隆抗体技术是实现田间快速检测病原菌的好方法(Danks & Barker，2000；Dewey et al.，1990；Ward et al.，2004)。自上世纪80年代以来，单克隆抗体技术已广泛应用于一些卵菌病原菌的生物学、分类学及致病性方面的研究，诸如Phytophthora cinnamomi(Hardhamet al.，1986；Gabor et al.，1993)，Pythium aphanidermatum(Estrada-Garcia et al.，1989)，及Aphanomyces invadans(Miles et al.，2003)，且成功研发了水生真菌Salmonella sp.，Escherichiacoli、Listeria monocytoenes(Bokken et al.，2003；Fratamico et al.，1998；Kouboves et al.，2001；Leonard et al.，2004)及几种细菌病原菌单克隆抗体检测技术(Ipbal et al.，2000)。

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体)。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、种类。我们采用荧光免疫技术可以实现对二种小麦黑粉菌的区别。

发明内容

本发明针对小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体检测的空白现状，提供一种特异性识别小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，结合免疫荧光技术，提供一种小麦矮腥黑粉菌免疫荧光检测方法的应用，具有特异性好、灵敏度高、操作简便快速的优点。

一种杂交瘤细胞株，其保藏号为：CGMCC No.5270。

一种小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa

)的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌而得。

上述单克隆抗体在检测小麦矮腥黑粉菌中的应用。

一种检测小麦矮腥黑粉菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于酶标板上直接或间接包被有上述单克隆抗体。

一种小麦矮腥黑粉菌的酶联免疫荧光检测方法，步骤如下：

(1)用水溶解待测孢子5×10⁵，加入粘片剂，涂于载玻片上，晾干，备用；

(2)玻片用PBS洗2次，各5分钟；

(3)在玻片上加上述单克隆抗体作为一抗，4℃，孵育过夜；

(4)复温10分钟，PBS洗5分钟，3次；

(5)在玻片上加PE-cy3标记的羊抗鼠IgG二抗孵育37℃，90分钟，PE-cy3标记的羊抗鼠IgG 1∶50；

(6)PBS洗5分钟，3次，甘油缓冲液封片；

(7)镜检，显示边缘黄绿色为小麦矮腥黑粉菌，暗褐色边缘不带亮色荧光的小麦网腥黑穗病菌。

本发明以小麦矮腥黑粉菌冬孢子为抗原制得了专门分泌抗小麦矮腥黑粉菌冬孢子的单克隆抗体的杂交瘤细胞，经特异性和血清效价检测，该杂交瘤细胞能够产生高特异性和高效价的小麦矮腥黑粉菌冬孢子抗单克隆抗体。

本发明得到的单克隆抗体可用于检测和鉴定小麦矮腥黑粉菌冬孢子。

本发明在获得该单克隆抗体的基础上，用荧光素标记该单克隆抗体，可实现在荧光显微镜下对两种黑粉菌的区分，使技术人员可以快速鉴定小麦是否感染小麦矮腥黑粉菌，并与其他种类致病菌区分开。

杂交瘤保藏信息：

杂交瘤细胞株名称：抗小麦矮腥黑粉菌冬孢子的单克隆抗体杂交瘤细胞株3B5-D1。

分类命名：抗黑粉菌(TCK)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

保藏号：CGMCC No.5270。

保藏日期：2011年9月27日。

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1.本发明的单克隆抗体在免疫荧光方法检测上的应用及结果。

具体实施方式

实验材料：

小麦矮腥黑粉菌冬孢子，本实验室有保存，可向公众发放。

实施例1：小麦矮腥黑粉菌冬孢子免疫小鼠

1.称量小麦矮腥黑粉菌冬孢子各0.3mg(5×10⁵个孢子/ml)，加入675μl生理盐水与675μl弗氏完全佐剂(美国sigma公司，货号F5881)制得孢子悬液，放入注射筒中，将2个注射筒接起来，来回推动混匀得到乳化抗原。

2.取4～8周龄雌性Balb/C小鼠，取200μl乳化抗原以皮下多点注射的方式进行免疫。3周后，夏孢子悬液与弗氏不完全佐剂混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐剂(美国sigma公司，货号F5506)代替弗氏完全佐剂与菌液混合乳化，按照相同剂量及方式进行免疫，后续免疫均按照此方案进行。第3次加强免疫后，每次免疫后的第10天进行小鼠眼下部位采血，采用间接ELISA法测定血清的效价与特异性。

3.测定血清效价时，须预先准备预包被有小麦矮腥黑粉菌冬孢子的酶标板孔，具体操作如下：

(1)将步骤1中的冬孢子悬液，以每孔100μl加入酶标板孔，放置于37℃恒温箱中孵育16h，取出后以PBS-T(含有0.05％的吐温20)洗板3次，再向每孔加入200μl含有1％的脱脂奶粉的PBS于37℃封闭2h后储存备用。

(2)将梯度稀释的抗血清100μl加入酶标板孔，放置于37℃孵育1h，而后加入用PBS稀释1000倍的羊抗鼠酶标二抗，37℃孵育1h后取出洗板。

(3)加入100μl的单组份显色底物(丹麦Kem-en-tec司，货号4800H)，37℃孵育10min。

(4)以0.2M的硫酸溶液中止反应，用酶标仪测定450nm吸光度值。表1为其中一次的测定数据。

表1

实施例2：小麦矮腥黑粉菌杂交瘤细胞株的筛选及单克隆抗体的制备

取实施例1中血清效价较高的小鼠，以实施例1中的冬孢子悬液150μl加强免疫，于5天后取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行细胞融合，“二步筛选法”筛选阳性克隆，同时对于检测出特异性抗体阳性孔的细胞，及时地转种并进行克隆化。

采用“有限稀释法”进行杂交瘤细胞的克隆化，将细胞悬浮液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞，接种至培养板，就可由此单个细胞繁殖形成同源性的细胞克隆，有多孔阳性时，尽可能取单克隆孔进行再次克隆化，同时转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培养，直至所有细胞孔的培养上清液均为阳性。

阳性细胞株的筛选方法与实施例1中所述血清效价测定方法基本相同。唯一不同之处在于将实施例1中梯度稀释的抗血清用阳性细胞株的培养液上清进行替换。将最终选得的阳性细胞株(保藏号：CGMCC No.5270)，扩大培养后，以体内诱生法制备腹水。

将制备的腹水中单克隆抗体经盐析沉淀后以蛋白A亲和柱层析纯化后备用。取与小麦矮腥黑粉菌冬孢子同类的小麦网腥黑穗病菌冬孢子、小麦光腥黑穗病菌冬孢子等，分别按照实施1的方法包被酶标板，用于包被的冬孢子的浓度为0.5mg/ml，将纯化的单克隆抗体稀释后加入酶标板孔，进行ELISA测定。

根据吸光度值结果判定所筛选的单克隆抗体对这几种孢子的交叉反应。由表2可知，所制抗体对于小麦矮腥黑粉菌冬孢子OD值较高(OD＞0.6，其余均较低(OD＜0.6)。说明本发明制备的单克隆抗体是对小麦矮腥黑粉菌的特异性抗体，可用于鉴别诊断小麦矮腥黑粉菌。

表2

注：包被浓度为0.5mg/ml，其余条件同实施例2步骤3。

实施例3：特异性单克隆抗体在小麦矮腥黑粉菌冬孢子检测中的验证

材料：

小麦矮腥黑粉菌冬孢子与5份待测样品。5份待测样品(都为已知的生物材料，本实验室亦有保存，可自申请日起20年向公众发放，用于验证试验)经传统方法鉴定，分别为：

待测样品1：是小麦条锈菌

待测样品2：是小麦叶锈菌

待测样品3：是小麦网腥黑穗病菌

待测样品4：是小麦秆锈菌

待测样品5：是小麦赤霉菌

方法：

将实施例2中纯化的单克隆抗体与包被好的酶标板进行ELISA测定，具体操作方法如下：

(1)称取小麦矮腥黑粉菌冬孢子及待测样品各0.3mg，以实施例1的方法包被酶标板，小麦矮腥黑粉菌冬孢子包被的孔作为标准孔和对照孔。

(2)在酶标板孔中加入按最适合稀释倍数稀释好的单克隆抗体100μl，37℃避光反应30min，PBS-T洗板4次，每次间隔30s，拍干；

(3)加入用PBS稀释1000倍的羊抗鼠酶标二抗，37℃避光反应30min，PBS-T洗板4次，每次间隔30s，拍干；

(4)加入单组份显色液(丹麦Kem-en-tec司，货号4800H)100μl，37℃避光反应30min；

(5)加入0.2M的硫酸溶液100μl终止反应，酶标仪置450nm读数。

所有酶标板加样方式及反应时间均一致。根据标准孔和对照孔的吸光度值确定未知样品是否是小麦矮腥黑粉菌冬孢子。

检测结果见表3。

表3  应用单克隆抗体酶联免疫检测结果示例

说明，本发明制备得到的单克隆抗体对小麦黑穗病菌具有准确的识别能力。

实施例4：免疫荧光方法结合小麦矮腥黑粉菌特异性单克隆抗体在二种黑穗病菌检测中的应用

操作步骤如下：

(1)5x10⁵(个孢子/毫升)待测孢子(小麦矮腥黑粉菌和小麦网腥黑穗病菌)用水溶解，再加入多聚赖氨酸作为粘片剂(加入量为每100ml悬液中加5mg多聚赖氨酸)，涂于载玻片上，晾干，备用。

(2)玻片用PBS洗2次，各5分钟

(3)加一抗(即实施例2制备得到的小麦矮腥黑粉菌冬孢子特异性单克隆抗体)孵育，4℃过夜。

(4)复温10分钟，PBS洗5分钟，3次

(5)加二抗孵育(PE-cy3标记的羊抗鼠IgG 1∶50)，37℃，90分钟

(6)PBS洗5分钟，3次，甘油缓冲液封片，甘油优选优级纯的。

(7)镜检

结果如图1，图中边缘黄绿色为小麦矮腥黑粉菌，暗褐色边缘不带亮色荧光的小麦网腥黑穗病菌。

Claims (5)

1.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为：CGMCC No.5270。

2.一种小麦矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)的单克隆抗体，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的得。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测小麦矮腥黑粉菌中的应用。

4.一种检测小麦矮腥黑粉菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于酶标板上直接或间接包被有权利要求2所述的单克隆抗体。

5.一种小麦矮腥黑粉菌的酶联免疫荧光检测方法，步骤如下：

(1)用水溶解待测孢子5×10⁵孢子/毫升，加入粘片剂，涂于载玻片上，晾干，备用；

(2)玻片用PBS洗2次，各5分钟；

(3)在玻片上加权利要求2所述的单克隆抗体作为一抗，4℃，孵育过夜；

(4)复温10分钟，PBS洗5分钟，3次；

(5)在玻片上加PE-cy3标记的羊抗鼠IgG二抗孵育37℃，90分钟，PE-cy3标记的羊抗鼠IgG 1∶50；

(6)PBS洗5分钟，3次，甘油缓冲液封片；

(7)镜检，显示边缘黄绿色为小麦矮腥黑粉菌，暗褐色边缘不带亮色荧光的为小麦网腥黑穗病菌。

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