CN104221648B - 室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明“室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法”，属于小麦矮腥黑粉菌防治领域。包括以下步骤：（1）制备小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子（2）制备用于接种矮腥黑粉菌的小麦种子：（3）小麦的人工接种，（4）室内培养发病植株。本发明小麦矮腥黑粉菌发病植株的室内培养方法，能在室内条件下获得稳定的小麦矮腥黑穗病发病率，有助于在室内隔离条件下进行小麦矮腥黑粉菌生物学研究，避免在室外进行研究时出现病菌扩散的情况，从而有利于从各方面加强对小麦矮腥黑穗病的防治。
Description
技术领域
本发明涉及一种室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法，属于小麦矮腥黑粉菌防治领域。
背景技术
小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK)引起的重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难，一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。据Hoffmann报告，在流行年份，因TCK引起的损失率一般为20％～50％，最高可达75％～90％。除了产量损失外，被侵染的小麦出粉率也会随着感染严重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子而极大地影响品质。目前该病害已在欧洲、北美、南美、大洋洲、亚洲、非洲等约49个国家发生。这些发病地点均在北纬30°和南纬30°以上的中纬度地区。TCK的寄主范围很广，危害小麦、大麦、黑麦等禾本科18个属的70多种植物，其中，对小麦危害最严重。小麦矮腥黑粉菌对我国的小麦生产存在潜在危机，该病在栽培条件下的主要寄主为冬小麦，我国常年小麦种植面积约2300万hm2，其中冬小麦占绝大部分，西北、黄淮海等广大冬麦区均适合小麦矮腥黑粉菌的定殖和发生危害，随着我国加入WTO及与TCK疫区国家-美国小麦贸易的增加，TCK传入我国的可能性日益增大，因此，必须加强对小麦矮腥黑粉菌生物学特性、发生危害规律和防控技术的研究，对小麦矮腥黑穗病进行早期预警及检疫检测，为病害防治提供技术储备。
目前国内关于TCK冬孢子人工接种试验的相关研究较少，在大连、北京、天津等地室外采用将TCK冬孢子撒在土壤表面的接种方法得到了大量TCK病株，但在室外条件下进行研究时容易出现病菌扩散的情况，造成严重后果。由于在室内条件下不易培养发病植株，因此国内关于小麦矮腥黑粉菌完成侵染循环过程的研究受到限制，不能明确小麦矮腥黑穗病病害循环过程中各阶段的环境条件。
发明内容
本发明提供了一种室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法，可在室内成功获得TCK发病植株，以下概括本发明要求保护的内容：
室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法，包括完全在室内完成的如下步骤：
（1）制备小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子：
从小麦病穗中取菌瘿，进行表面消毒后制备成用于接种的小麦矮腥黑粉菌冬孢子悬浮液；
将配制好的冬孢子悬浮液加入盛于培养皿中的培养基平板上，均匀涂抹，盖上培养皿盖并封口膜封好后倒置放于5℃的光照培养箱中培养，光照强度为600lx，培养15d之后开始镜检观察，以菌丝长到冬孢子直径的1/2时视为萌发，约70%的冬孢子萌发后用于小麦的人工接种；
（2）制备用于接种矮腥黑粉菌的小麦种子：
小麦种子表面消毒杀死种子表面可能携带的小麦矮腥黑粉菌和小麦网腥黑粉菌孢子，然后浸种催芽，胚芽鞘长度为1～3mm时用于接种萌发的冬孢子；
（3）小麦的人工接种：
在所述培养皿盖中铺上水润湿的滤纸，将步骤（2）制备的小麦种子铺放在所述滤纸上；
将步骤（1）制备得到的承载有小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子的培养皿倒扣到铺放有小麦种子的所述培养皿盖中，使承载着小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子的一面与所述小麦种子接触，置于4-6℃的温度条件下进行春华处理直到苗长到3～5cm；将幼苗移入土壤中种植至植株成熟；（4）室内培养发病植株：
将接种了小麦矮腥黑粉菌的幼苗种植到装有灭菌土壤塑料盆中，置于白天30℃，夜晚18℃的人工气候培养箱中，进行常规管理，定期观察小麦生长状况，将植株种植至成熟。
步骤（1）中所述表面消毒的方法优选如下：从病穗中取1粒菌瘿，置于2mL离心管中，加入适量蒸馏水浸泡菌瘿，静置30min，然后将菌瘿捣碎并充分振荡，用150目网筛过滤后，将滤液放在室温下培养24h，低速离心后弃去上清液，加0.25%NaClO水溶液并在室温下放置1min，用灭菌水洗3次。
步骤（2）中所述小麦种子表面消毒优选采用30%NaOCl水溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次。
步骤（4）中所述灭菌土壤，优选将营养土放入高压灭菌锅内，加热到60～100℃，持续30～60min。
所述用于接种的小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子悬浮液的浓度优选为(50～130)×104个/mL。
所述培养基指土壤浸提液培养基，配方为：1000mL培养基中含有20g琼脂、5mg80万IU青霉素、75g土壤。
本领域中，在室外制备获得TCK病株的报道为数不少，在大连、北京、天津等地室外采用将TCK冬孢子撒在土壤表面的接种方法得到了大量TCK病株，但在室外条件下进行研究时容易出现病菌扩散的情况，造成严重后果。由于在室内条件下不易培养发病植株，难以明 确小麦矮腥黑穗病病害循环过程中各阶段的环境条件，总体上限制了对小麦矮腥黑穗病的系统研究。
本发明通过系统地控制各个环节的操作方法以及参数，得到一套适用于完全在室内实施从而成功获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法。克服了目前为止本领域一直存在的难以在室内获得发病植株的技术难题。本发明的成果有助于在室内隔离条件下进行小麦矮腥黑粉菌生物学研究，包括病菌不同小种的致病性、小麦品种抗病性研究等，防止在室外条件下进行研究时出现病菌扩散的情况，造成严重后果，进而从各方面加强对该病的防治。
本发明小麦矮腥黑粉菌发病植株的室内培养方法，每一个步骤及其参数都与其它步骤密切配合，都对最后是否能成功获得TCK病株并提高病株发病率具有决定性作用。其中，将承载有小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子的培养皿倒扣到铺放有小麦种子的所述培养皿盖中，使培养基上承载着萌发冬孢子的一面与小麦种子接触，并置于5-10℃的温度条件下培育，萌发的矮腥黑粉菌冬孢子在侵入小麦的过程中始终处于培养基上，培养基能够提供冬孢子生长所需的营养物质和最适湿度，提高冬孢子的侵染活性。在侵染的同时进行低春化处理，不用单独对小麦种子进行纯化处理，不仅提高了矮腥黑粉菌冬孢子对小麦的侵染率，还节约了单独进行春化的时间。当苗长到3-5cm时，将麦苗移栽至土壤中种植至植株成熟。
采用本发明的方法，移栽植株中，发病植株占7%。本发明中，对于菌瘿的表面消毒方法进行了优选。
本发明的方法中，对小麦进行表面消毒进行了优选，采用该方法，能保证杀死种子表面可能携带的小麦矮腥黑粉菌和小麦网腥黑粉菌孢子，同时不影响种子的生活力。
本发明的方法中，还对土壤消毒的条件进行了优化，采用本发明要求的优选方案吗，能避免杀死能分解肥料的有益微生物，影响土壤肥效；同时，可将大部分细菌、真菌、线虫和昆虫杀灭，并使土壤中的大部分杂草种子丧失活力。本发明中，还对小麦矮腥黑穗病冬孢子的接种浓度进行了优选，发现(50～130)×104个/mL的接种浓度萌发率最高。
小麦矮腥黑粉菌冬孢子在不同培养基中的萌发特性和萌发率有差异，在土壤浸提液培养基中的萌发效果最好，能够提高矮腥黑粉菌冬孢子对小麦的侵染活力，从而提高小麦发病率。在一些实施例中，也可以选用营养琼脂或水琼脂作为冬孢子萌发培养基，而本发明优选土壤浸提液培养基。所述土壤浸提液培养基的配方为：琼脂20g/L、80万IU青霉素5mg/L、土壤75g/L。
通过设计小麦矮腥黑粉菌冬孢子的浓度梯度对冬孢子萌发过程的系统观察和分析表明，小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子在培养基上的接种浓度为(50-130)×104个/mL时萌发率较高，在浓度为(100-105)×104个/mL时，萌发率达到最高。因此，在室内培养小麦矮腥黑粉菌发病 植株的过程中，需要较高的冬孢子萌发率，以确保病菌能够侵入小麦体内，并在寄主体内进一步扩展，引起小麦发病。所以，制备萌发冬孢子时，应选择合适的冬孢子浓度，年代较近的菌株以及控制温度和湿度等环境条件，以确保冬孢子有较高的萌发率。
综上所述，本发明小麦矮腥黑粉菌发病植株的室内培养方法，能在室内条件下获得稳定的小麦矮腥黑穗病发病率，避免了在室外进行研究时出现病菌扩散的情况，能够进一步通过小麦矮腥黑粉菌的鉴别寄主来确定不同病菌小种的致病性，以及目前我国现有主栽小麦品种对致病性高的病菌小种的抗病性，有助于有效评估小麦矮腥黑粉菌对我国小麦生产的风险及加强对小麦矮腥黑穗病的控制。
附图说明
图1.TCK不同冬孢子浓度对萌发的影响。
图2.TCK冬孢子萌发过程中不同阶段的形态（10×），
其中a.具有多个萌发孔的萌发冬孢子;b.丝状初生担孢子;c.H体;d.腊肠状次生担孢子。
图3.小麦矮腥黑粉菌侵染小麦的循环示意图，
其中A.TCK冬孢子，B.萌发的TCK冬孢子，C.初生小孢子（即担孢子），D.次生担孢子和侵染菌丝F.叶片上出现清晰的黄色病斑，F.叶片上出现清晰的黄色病斑，G.TCK菌丝体穿透正在发育的麦粒并形成冬孢子H.充满TCK冬孢子的成熟腥黑穗病孢子堆I.充满冬孢子的TCK菌瘿。
具体实施方式
下面参考具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅作为解释和说明，而不能理解为对本发明的限制。
小麦品种：‘东选3号’。
小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn）菌株：本发明所有的TCK菌株为现有文献L.GAO et al.Development of a SCAR Maker by inter-simple sequence repeat for dignoisis of Dwarf Bunt of Wheat and Detection of Tilletia controversa Kühn.Folia Microbiol.55(3),258–264(2010)所记载，参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。另外也记载在L.GAO et al.AnISSR-based Approach for the Molecular Detection and Diagnosis of Dwarf Bunt of Wheat,Caused by Tilletia controversaKu¨hn.J Phytopathol159:155–158(2011)，为其中材料与方法部分记载的Dr Blair Goates所提供的TCK菌株。本实验室亦有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
试剂：30%NaOCl溶液、70%乙醇
实验耗材：塑料盆、9cm培养皿、镊子、玻璃棒、蛭石
仪器设备：人工气候生长箱（LT-36VLC8，PERCIVAL）、光学显微镜（BH2-RFCA，OLYMPUS）、高压灭菌锅（MAC-350P，SANYO）
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。
实施例1TCK冬孢子浓度对萌发的影响研究
材料与方法
供试菌株为2011年从口岸截获，，电镜检测为小麦矮腥黑粉菌。发明人实验室有保存，可自申请日起二十年内先公众发放用于验证试验。本发明的方法对于菌株无特别要求，其它小麦矮腥黑粉菌菌株也可以用于验证本发明。
从病穗中取1粒菌瘿，置于2mL离心管中，加入适量蒸馏水浸泡菌瘿，静置30min，然后将菌瘿捣碎并充分振荡，用150目网筛过滤后，将滤液放在室温下培养24h，低速离心后弃去上清液，加0.25%NaClO水溶液并在室温下放置1min进行表面消毒，用灭菌水洗3次，利用血球计数板将冬孢子在灭菌水中调至不同浓度：(5～10)×104，(25～30)×104，(50～55)×104，(75～80)×104，(100～105)×104，(125～130)×104，(150～155)×104，(175～180)×104个/mL。
将配制好的冬孢子悬浮液加入预先做好的土壤浸提液培养基平板(1000mL培养基中含有20g琼脂、5mg80万IU青霉素、75g土壤)上，每皿加冬孢子悬浮液0.25mL，并用无菌三角玻璃棒均匀涂抹培养基表面，每个浓度重复3次。用封口膜封好后倒置放于5℃的光照培养箱中培养，光照强度为600lx。
从培养15d之后开始，每5d镜检观察1次，每个培养皿观察400个孢子。以先菌丝长到冬孢子直径的1/2时视为萌发，记录萌发起始时间、萌发数目及生长情况。
结果与分析
不同浓度下参试菌株冬孢子的萌发率变化如图1所示。由图1可以看出，TCK菌株冬孢 子在最适温度5℃下，不同冬孢子浓度下的菌株起始萌发时间最短为15～20d，大部分菌株为25d。通过对TCK冬孢子萌发过程的系统观察发现，TCK冬孢子萌发后先长出先菌丝，在琼脂培养基上，有的菌株先菌丝在产生初生担孢子前大量生长，先菌丝长短差异较大（图2a）。有的菌株可在冬孢子上观察到多个萌发孔，在同一冬孢子上产生多条先菌丝（图2a）。丝状的初生担孢子是从先菌丝顶部开始生长，形成密集的一束（图2b），起初先菌丝没有隔膜，正常萌发的冬孢子在培养35d以后先菌丝一端开始产生隔膜，并可观察到先菌丝的顶端长出初生担孢子和冬孢子融合后形成的H体和接合钉（图2c）。45d左右开始有少量的初生担孢子顶端长出腊肠状的次生担孢子（图2d）。
从图1中还可以看出，不同浓度的参试菌株在45～50d达到最高萌发率，约为60%～75%。利用SAS（8.0）进行方差分析结果表明，在45～50d参试菌株在浓度达到(100～105)×104个/mL时，与高浓度参试菌株的萌发率差异达到显著水平，随着浓度的升高，萌发率差异不显著（见表1）。
表1.45d和50d时不同浓度下TCK冬孢子的萌发率
1）：数据后标有的小写字母表示在0.05水平上差异显著
实施例2小麦矮腥黑粉菌发病植株的室内培养
1、制备小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子
（1）小麦矮腥黑粉菌冬孢子的表面消毒处理：从病穗中取1粒菌瘿，置于2mL离心管中，加入适量蒸馏水浸泡菌瘿，静置30min，然后将菌瘿捣碎并充分振荡，用150目网筛过滤后， 将滤液放在室温下培养24h，低速离心后弃去上清液，加0.25%NaClO水溶液并在室温下放置1min进行表面消毒，用灭菌水洗3次，利用血球计数板将冬孢子在灭菌水中调至(50～130)×104个/mL。
（2）小麦矮腥黑粉菌冬孢子的萌发：将配制好的冬孢子悬浮液加入预先做好的土壤浸提液培养基平板(1000mL培养基中含有20g琼脂、5mg80万IU青霉素、75g土壤)上，每皿加入冬孢子悬浮液0.25mL，并用无菌三角玻璃棒均匀涂抹培养基表面，用封口膜封好后倒置放于5℃的光照培养箱中培养，光照强度为600lx。从培养15d之后开始，每5d镜检观察1次，每个培养皿观察400个孢子。以先菌丝长到冬孢子直径的1/2时视为萌发。当约70%的冬孢子萌发时（约40～50d）进行小麦的人工接种。
2、制备用于接种矮腥黑粉菌的小麦种子
接种前，将小麦种子用30%NaOCl水溶液表面消毒5min，无菌水冲洗3次，以便杀死种子表面可能携带的小麦矮腥黑粉菌和小麦网腥黑粉菌孢子。然后将小麦种子浸种催芽，待胚芽鞘长度为1～3mm时备用。
3、用小麦矮腥黑粉菌侵染小麦种子
将种子放在培养皿盖中的湿滤纸上，然后将皿底盛有一层承载萌发孢子的土壤浸提液培养基倒置过来，使培养基上承载萌发冬孢子的一面与小麦种子接触，放在5℃的培养箱中培育，并可通过这段时间的低温对小麦进行春化处理，直到苗长到3～5cm。
4、发病植株的室内培养
（1）土壤灭菌：将营养土放入高压灭菌锅内，加热到60～100℃，持续30～60min（加热时间不宜太长，以免杀死能分解肥料的有益微生物，影响土壤肥效），可将大部分细菌、真菌、线虫和昆虫杀灭，并使大部分杂草种子丧失活力。
（2）室内培养：将接种了小麦矮腥黑粉菌的幼苗种植到装有灭菌土壤的直径为24cm的塑料盆中，置于白天30℃，夜晚18℃的人工气候培养箱中，进行常规管理，定期观察小麦生长状况，将植株种植至成熟。
5、小麦发病情况
（1）发病率：对发病小麦和健康小麦进行统计，获得了7%的发病植株。
(2)发病特征：对小麦不同生长时期病害症状进行系统观察(图1)发现，在小麦生长初期，病叶片上表现为微小、不清晰或清晰的黄斑和/或条纹(图3F)。受侵染的植株易产生异常矮化分蘖，病穗的茎秆通常缩短(表1)。受侵染的小花未成熟子房呈深绿色，而健康的子房则呈浅绿色。发育完全的孢子团一般呈籽粒状，但比正常籽粒圆且大，这使得内外稃张开，使病穗呈现特征形态(图3G)。成熟孢子团由冬孢子组成并被薄而修饰过的子房壁包被(图3I)。孢子团散发出与鱼腥味相似的强烈气味。
表2.小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子接种小麦后株高情况
Claims (5)
1.小麦矮腥黑粉菌发病植株的室内培养方法，包括完全在室内完成的如下步骤：
(1)制备小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子：
从小麦病穗中取菌瘿，进行表面消毒后制备成用于接种的小麦矮腥黑粉菌冬孢子悬浮液；所述冬孢子悬浮液的浓度为(50～130)×104个/mL；
将配制好的冬孢子悬浮液加入盛于培养皿中的培养基平板上，均匀涂抹，盖上培养皿盖并封口膜封好后倒置放于5℃的光照培养箱中培养，光照强度为600lx，培养15d之后开始镜检观察，以菌丝长到冬孢子直径的1/2时视为萌发，约70％的冬孢子萌发后用于小麦的人工接种；
(2)制备用于接种矮腥黑粉菌的小麦种子：
小麦种子表面消毒杀死种子表面可能携带的小麦矮腥黑粉菌和小麦网腥黑粉菌孢子，然后浸种催芽，胚芽鞘长度为1～3mm时用于接种萌发的冬孢子；
(3)小麦的人工接种：
在所述培养皿盖中铺上水润湿的滤纸，将步骤(2)制备的小麦种子铺放在所述滤纸上；
将步骤(1)制备得到的承载有小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子的培养皿倒扣到铺放有小麦种子的所述培养皿盖中，使承载着小麦矮腥黑粉菌萌发冬孢子的一面与所述小麦种子接触，置于5℃的温度条件下进行春化处理直到苗长到3～5cm；将幼苗移入土壤中种植至植株成熟；(4)室内培养发病植株：
将接种了小麦矮腥黑粉菌的幼苗种植到装有灭菌土壤塑料盆中，置于白天30℃，夜晚18℃的人工气候培养箱中，进行常规管理，定期观察小麦生长状况，将植株种植至成熟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面消毒的方法如下：从病穗中取1粒菌瘿，置于2mL离心管中，加入适量蒸馏水浸泡菌瘿，静置30min，然后将菌瘿捣碎并充分振荡，用150目网筛过滤后，将滤液放在室温下培养24h，低速离心后弃去上清液，加0.25％NaClO水溶液并在室温下放置1min，用灭菌水洗3次。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述小麦种子表面消毒采用30％NaOCl水溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次。
4.根据权利要求1所述的室内培养方法，其特征在于，步骤(4)中所述灭菌土壤指将营养土放入高压灭菌锅内，加热到60～100℃，持续30～60min。
5.根据权利要求1～4任一所述的方法，所述培养基指土壤浸提液培养基，配方为：1000mL培养基中含有20g琼脂、5mg 80万IU青霉素、75g土壤。
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