CN105660222A - 一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法。首先在小麦抽穗后，对小麦穗部进行剪壳处理以及对去壳后的小麦穗部进行杂菌隔离；将小麦黑胚病致病菌接种于含有PDA培养基的培养皿中进行暗培养，得到培养后的致病菌菌落；冲洗得到的致病菌菌落，经过滤、离心、调整孢子浓度后得到孢子悬浮液备用；在小麦籽粒满仁时，将孢子悬浮液喷洒在剪壳处理的穗子上，并用塑料袋将穗子罩上保湿；接菌后观察接种处理籽粒上病菌的侵染情况以及籽粒黑胚病症状的形成；小麦成熟时统计黑胚率，作为小麦黑胚病鉴定的结果。本发明方法不仅可以及时观察症状的产生情况，而且使鉴定结果更稳定可靠；并且根据浸染情况可以及时对小麦作出合理防治。

Description

一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法

技术领域

本发明属于农作物病害检测技术领域，具体涉及一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法。

背景技术

小麦黑胚病是指小麦籽粒表面有不同形状和程度的黑色、褐色等症状，该病不仅降低小麦籽粒的外观品质，使小麦在市场上的出售级别降低而影响农民收入，而且降低种子发芽率，影响面粉品质，给小麦生产带来严重的危害。

小麦黑胚病病因复杂，受致病菌、环境因素及品种特性的影响，其严重程度随品种、地点、年份及防治措施等因素的不同而变化，各国报道的发病率一般在0.3～66.7%之间变化（参见：1、LiQY,QinZ,JiangYM,ShenCC,DuanZB,andNiuJS.Screeningwheatgenotypesforresistancetoblackpointandtheeffectsofdiseasedkernelsonseedgermination.JPlantDisProtect,2014,121(2):79-88；2、Fernandez,M.R.,Sissons,M.,Conner,R.L.,Wang,H.,amdClarke,J.M.2011.Influenceofbioticandabioticfactorsondarkdiscolorationofdurumwheatkernels.CropSci.51:1205-1214；3、代君丽，于巧丽，袁虹霞，邢小萍，张猛，孙炳剑，李洪连.河南省小麦黑胚病菌的分离鉴定及致病性测定.植物病理学报,2011,41(3),225-231.）。

小麦黑胚病是籽粒病害，在籽粒灌浆期发生发展，因为籽粒外有颖壳包被，不能及时观察黑胚病的症状形成情况，如果去掉颖壳又会对籽粒生长造成严重伤害甚至造成籽粒脱落，这给小麦黑胚病抗病机理研究、菌与寄主互作、病害防治等研究工作带来了一定的困难。目前，针对小麦黑胚病接菌鉴定方法的报告，都是在小麦穗部直接喷洒接菌，进行或者不进行保湿处理，成熟后统计发病率（参见：3、代君丽，于巧丽，袁虹霞等.植物病理学报,2011,41(3),225-231；4、康业斌，刘顺通，成玉梅，段爱菊.小麦对黑胚病的抗性及黑胚对产量损失的影响，植物保护，1999，3:25-27）。因为颖壳的阻隔，这些鉴定方法都无法及时的直接观察接菌后籽粒症状形成情况，而且由于没有直接将菌接在籽粒上，降低了致病菌的侵染效果，从而影响实验的准确性。因此，非常有必要探索一种小麦黑胚病接菌鉴定的方法，使致病菌直接侵染小麦籽粒、提高侵染效果确保实验结果稳定真实可靠，又能直接观察黑胚病的症状形成情况。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：针对直接喷洒接菌方法不能及时观察症状产生，以及菌与籽粒由于颖壳阻隔导致鉴定结果准确性降低的不足，本发明提供一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法。本发明首先在小麦抽穗后、籽粒未发育前将颖壳剪掉一部分，待籽粒满仁后再喷洒接菌套袋保湿鉴定，不仅使喷洒的致病菌孢子可以直接与籽粒接触，而且可以及时观察籽粒上黑胚病症状发生的情况，同时根据该浸染情况可以及时对小麦作出合理的防治措施。由此，本发明首次提供了一种剪壳接菌鉴定小麦黑胚病的方法，不仅可以及时观察症状的产生情况，而且使鉴定结果更稳定可靠；并且根据浸染情况可以及时对小麦作出合理防治。

为了解决上述问题，本发明采取的技术方案为：

本发明提供一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，所述接种鉴定方法包括以下步骤：

a、小麦穗部剪壳处理及杂菌隔离：在小麦抽穗后，用镊子将小麦穗上部及下部的小穗各去掉3个，用剪刀将剩下小穗的颖壳从上面剪去1/2，并将麦芒剪掉，然后用硫酸纸袋将去壳的小麦穗罩上以隔离杂菌；

b、小麦黑胚病致病菌的培养：将小麦黑胚病致病菌接种于含有PDA培养基的培养皿中，在25℃条件下暗培养12天；

c、小麦黑胚病致病菌孢子悬浮液的制备：用蒸馏水冲洗步骤b培养得到的致病菌菌落，然后经过滤、离心、调整孢子浓度后得到孢子悬浮液，于4℃冰箱保存备用；

d、喷洒接菌及套袋保湿：在小麦籽粒满仁时，将步骤c制备的孢子悬浮液摇匀后均匀喷洒在步骤a中剪壳处理的穗子上，喷洒后用塑料袋将穗子罩上保湿5天；

e、小麦黑胚病症状观察：接菌后每天观察步骤d接种处理籽粒上病菌的侵染情况以及籽粒黑胚病症状的形成；

f、鉴定结果记录：小麦成熟时收获晾干，将步骤d接种处理的穗子手工脱粒，统计黑胚病籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病鉴定的结果。

根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤b中所述小麦黑胚病致病菌为小麦根腐平脐蠕孢菌，狗牙根平脐蠕孢菌，蟋蟀草平脐蠕孢菌和草茎点霉菌中的至少一种。

根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤b中所述将小麦黑胚病致病菌接种于含有PDA培养基的培养皿中，具体操作过程为：首先将PDA培养基进行灭菌，然后冷却至50～55℃时，在无菌条件下加入氨苄青霉素钠，每100mLPDA培养基中氨苄青霉素钠用量为100μL，摇匀后倒平板；待培养基凝固冷却后，用手术刀片将小麦黑胚病致病菌菌落切成3mm²的小块儿，放于平板的中央，1块/皿。

根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，PDA培养基进行灭菌时的温度为121℃，灭菌时间为20分钟；所述氨苄青霉素钠的浓度为100mg/mL。

根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤c中小麦黑胚病致病菌孢子悬浮液的制备过程为：

首先用无菌蒸馏水（每皿中加入25mL无菌蒸馏水）冲洗步骤b中PDA平板上培养得到的致病菌菌落，然后用纱布过滤至50mL的离心管中，在4℃、4000r/min的条件下离心5min，去上清液；接着加入10mL无菌蒸馏水摇匀再离心，去上清液；然后再加入5mL无菌蒸馏水，用血球计数板测定孢子浓度，根据测定的孢子浓度按比例加入无菌蒸馏水，调整至孢子浓度为3×10⁵个／mL，得到小麦黑胚病致病菌孢子悬浮液。

根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤d中所述小麦籽粒满仁时，是指小麦籽粒发育为满仁，即小麦籽粒有1/3～1/4伸出未剪掉颖壳的时间。

根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤e中接菌后每天观察步骤d接种处理籽粒上病菌的侵染情况以及籽粒黑胚病症状的形成，根据浸染情况对小麦作出及时防治。

根据上述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，步骤e中所述观察采用两种方法：一种是直接用肉眼观察；另一种是分时间段取样，制作切片用光学显微镜或扫描或透射电镜观察，以明确黑胚病致病菌的侵染途径与小麦籽粒组织与菌互作时形态结构的变化。

本发明的积极有益效果：

1、本发明技术方案是在小麦抽穗后，从上部剪掉小穗颖壳的1/2，然后套硫酸纸袋隔离杂菌，随着籽粒逐渐发育，当籽粒的1/3-1/4伸出颖壳时，进行致病菌孢子悬浮液喷洒接菌，塑料袋保湿5天处理，接菌后可以每天观察籽粒上菌丝的定殖、生长以及黑胚病的产生情况。本发明鉴定方法与直接在穗部喷洒孢子液鉴定相比，可以及时、直接的观察到籽粒的发病情况，而且增强了鉴定的准确性。

2、本发明技术方案中，首先将小麦穗部颖壳剪掉一部分，待籽粒伸出颖壳后再喷洒接菌，既能保证小麦籽粒正常发育，又使黑胚病致病菌与籽粒直接接触，保证了鉴定结果的准确性，而且籽粒有一部分漏在颖壳外，可以直接观察籽粒的发病情况；根据及时观察到的浸染情况，可以对小麦作出及时合理的防治措施。

3、小麦黑胚病是小麦生产区的常发病害，其病原复杂，严重程度还受环境影响。在没有准确鉴定品种抗性的情况下，无法就小麦对不同病原的专化抗病性进行研究。本发明所述接菌鉴定方法，首次采用剪掉部分颖壳、可以将孢子液直接喷洒在籽粒表面进行鉴定，使致病菌与籽粒直接接触，充分保证了接菌效果，提高了鉴定的准确性与稳定性，从而保证了筛选的抗病材料的真实可靠。

4、本发明方法剪掉一部分颖壳，既保证籽粒可以正常发育成熟，又可以使发育中的籽粒伸出颖壳外，避免了观察时颖壳阻隔的影响，可以直接观察接菌小麦籽粒上致病菌孢子的生长情况与黑胚病的发生情况，为小麦抗黑胚病机理研究及菌与寄主植物互作提供了良好的方法。

5、本发明方法能够及时观察到小麦籽粒上菌的生长与黑胚病症状的出现，为黑胚病的及时防治提供了依据，抓住有利时期防治，既提高了防治效果，又节省了人力物力。

综上所述，本发明技术方案可用于小麦对不同黑胚病致病菌抗性的鉴定，能准确、高效地筛选抗、感病品种和进行分离群体的表型鉴定，便于小麦抗黑胚病遗传与基因/QTL定位、分子标记开发等研究，特别有利于推进小麦黑胚病抗性机理研究及菌与寄主互作的研究，同时也有利于小麦生产中病害的及时发现与防治。

附图说明：

图1温室条件下本发明方法接菌处理不同时间穗部生长情况；

图1中，A：小麦抽穗期剪壳，不接菌、不套袋保湿条件下（自然条件），近满仁期籽粒发育情况；B：小麦抽穗期剪壳、用小麦根腐平脐蠕孢菌孢子悬浮液接菌、套袋保湿处理，接菌5天后，孢子萌发的菌丝在籽粒及冠毛上发育（B中右面黑色箭头所示），颖壳上也有孢子萌发侵染的症状（B中左面黑色箭头所示）；C：小麦抽穗期剪壳、用小麦根腐平脐蠕孢菌孢子悬浮液接菌、套袋保湿处理，接菌30天后，黑胚症状明显的籽粒（黑色箭头所示）；D：不接菌、不套袋保湿条件下（自然条件），近成熟期籽粒发育情况。试验中所用小麦品系为漯麦4号。

由图1可以表明，剪壳处理不影响小麦籽粒的生长发育（图1A与图1D），剪壳处理可以及时观察致病菌在籽粒上的发育情况（图1B），不用破坏颖壳，就可以看到籽粒上明显的黑胚病症状（图1C）。

图2温室条件下用本发明方法进行根腐平脐蠕孢菌的鉴定结果；

图2中，A：剪壳、小麦根腐平脐蠕孢菌孢子液喷洒接菌、套袋保湿5天处理；B：剪壳、喷洒灭菌蒸馏水、套袋保湿5天处理，即对照；C：剪壳、不接菌也不喷洒灭菌蒸馏水、不套袋保湿处理；D、E、F分别是与A、B、C对应的不剪壳处理。鉴定试验中所用小麦品系为漯麦4号。

由图2可以表明，无论剪壳与否，不接菌不保湿处理基本没有黑胚病发生（C与F），保湿处理有一定的发病率（B与D），而接菌处理黑胚率明显增加（A与F）；与穗部直接喷洒根腐平脐蠕孢菌（F）相比，剪壳处理喷洒接菌（A）的方法由于使菌能够直接侵染籽粒，发病率高而且症状明显，说明本发明方法能够进一步提高鉴定的效率与准确性。

图3温室条件下，用本发明方法进行不同小麦黑胚病致病菌的鉴定结果；

图3中：A接种草茎点霉菌处理，B与C用蟋蟀草平脐蠕孢菌处理，D与E用狗牙根平脐蠕孢菌处理，F用根腐平脐蠕孢菌处理；数字1表示剪壳、喷洒接菌、套袋保湿处理，数字2表示不剪壳、喷洒接菌、套袋保湿处理。鉴定试验中所用小麦品系为漯麦4号。

由图3可以表明，每个菌处理中，不同小麦黑胚病菌的致病性有差异，剪壳处理（数字1所示）的发病率比不剪壳（数字1所示）高而且症状明显，说明本发明方法适用于不同的小麦黑胚病致病菌的接菌鉴定。

图4大田条件下，利用本发明方法及时发现黑胚病症状后的防治效果；

图4中：表中CK、自然CK、敌力脱分别表示用本发明方法剪壳发现黑胚病症状（花后15～18天）后，分别喷洒蒸馏水处理、自然环境、喷洒敌力脱药物处理条件下统计的结果。实验中所用小麦材料为漯麦4号与豫麦18，均为感病材料，每品种喷洒的面积为0.2m²（单行1米长，行距0.2m），三次重复，成熟时每处理收获50穗脱粒，统计黑胚率；柱形图上不同大写字母表示在0.01水平上差异显著。

由图4可以表明，黑胚病症状及时发现并进行药物处理（敌力脱）与喷洒蒸馏水处理(CK)后与不做任何处理的自然环境（自然CK）相比，黑胚率显著下降，说明及时防治的效果明显。

具体实施方式：

以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1：

本发明能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，该接种鉴定方法的详细步骤如下（本实施例采用的致病菌为小麦根腐平脐蠕孢菌）：

a、在河南农业大学国家小麦工程技术研究中心温室盆栽的小麦抽穗后，用镊子将小麦穗子上部与下部的3个小穗去掉，然后用剪刀将剩下小穗的颖壳从上面剪去1/2，并将麦芒剪掉；接着采用25×17mm的硫酸纸袋将剪壳的小麦穗部套袋以隔离杂菌（每袋罩5个发育状况一致的穗子）；

b、小麦黑胚病致病菌的培养：首先将PDA培养基进行灭菌（灭菌温度为121℃，灭菌时间为20分钟），然后冷却至50～55℃时，在无菌条件下加入氨苄青霉素钠（氨苄青霉素钠浓度为100mg/mL，每100mLPDA培养基中氨苄青霉素钠用量为100μL），摇匀后倒平板；待培养基凝固冷却后，用手术刀片将小麦根腐平脐蠕孢菌菌落切成3mm²的小块儿，放于平板的中央，1块/皿；然后在25℃条件下暗培养12天；

c、孢子悬浮液的制备：首先用无菌蒸馏水（每皿中采用25mL无菌蒸馏水）冲洗步骤b中PDA平板上培养得到的小麦根腐平脐蠕孢菌菌落，然后用纱布过滤至50mL的离心管中，在4℃、4000r/min的条件下离心5min，去上清液；接着加入10mL无菌蒸馏水摇匀再离心，去上清液，然后再加入5mL无菌蒸馏水，用血球计数板测定孢子浓度，根据测定的浓度按比例加入蒸馏水，调整至孢子浓度为3×10⁵个／mL，得到小麦根腐平脐蠕孢菌孢子悬浮液，于4℃冰箱保存备用；

d、喷洒接菌及套袋保湿：在小麦籽粒发育为满仁时，即小麦籽粒有1/3～1/4伸出未剪掉颖壳的时间；将步骤c制备的孢子悬浮液摇匀后均匀喷洒在步骤a中剪壳处理的穗子上，喷洒后用塑料袋将穗子罩上保湿5天；

e、小麦黑胚病症状观察：接菌后每天观察步骤d接种处理籽粒上病菌的侵染情况以及籽粒黑胚病症状的形成；另外可以分时间段取样，制作切片用光学显微镜或扫描或透射电镜观察，以明确黑胚病致病菌的侵染途径与小麦籽粒组织与菌互作时形态结构的变化；

f、鉴定结果记录：小麦成熟时收获晾干，将步骤d接种处理的穗子手工脱粒，统计黑胚病籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病鉴定的结果。

试验结果表明，小麦抽穗后剪去小穗1/2的颖壳对籽粒正常发育影响不大（由图1A与图1D所示），在籽粒伸出颖壳1/3～1/4时，接种小麦根腐平脐蠕孢菌的孢子悬浮液，5天后用肉眼就能看到在小麦籽粒背侧及冠毛处有成团的菌丝，表明致病菌孢子在籽粒表面萌发生长（由图1B右面黑色箭头所示），当然小穗留存的颖壳上也有孢子萌发，致病菌侵染现象明显（图1B左面黑色箭头所示）。接菌后30天，籽粒上黑胚症状已经非常明显，不用处理颖壳，就可以观察籽粒的黑胚症状（图1C所示），没有接菌的对照（用蒸馏水代替孢子液处理）没有出现黑胚症状。如果做抗病机理或者做菌与寄主植物互作研究，就可以及时的观察致病菌在籽粒上的侵染过程与黑胚症状的形成过程。小麦根腐平脐蠕孢菌是河南小麦黑胚病的强致病菌，不剪壳情况下其接菌鉴定的黑胚率在35%～40%，而剪壳后不仅发病率增加（50%～55%），而且症状加重（病斑颜色深），表明本发明方法通过剪壳处理，使菌能够直接侵染籽粒，进一步提高了鉴定的效率与准确性（详见附图2所示）。

实施例2：与实施例1基本相同，不同之处在于：

本发明方法能够用于多种小麦黑胚病菌的接种鉴定，并能及时观察黑胚病症状，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：

步骤b中：采用的小麦黑胚病致病菌为小麦根腐平脐蠕孢菌、狗牙根平脐蠕孢菌、蟋蟀草平脐蠕孢菌与草茎点霉菌。

试验结果表明，4个不同的小麦黑胚病致病菌株接种后，致病性有一定的差异，但是剪壳处理鉴定的黑胚率比不剪壳处理的高，而且症状也更明显（详见图3所示），表明本发明方法可以适用于不同的小麦黑胚病致病菌的接菌鉴定。

实施例3：

本发明能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，本实施例是在大田种植条件下，接种四种小麦黑胚病致病菌进行鉴定并及时观察小麦黑胚病症状，其详细步骤为：

a、穗部剪壳处理：在荥阳育种田（荥阳市豫龙镇）种植的小麦抽穗后，用镊子将小麦穗子上部与下部的3个小穗去掉，然后用剪刀将剩下小穗的颖壳从上面剪去1/2，并将麦芒剪掉；然后采用25×17mm的硫酸纸袋将剪壳的小麦穗部套袋以隔离杂菌（每袋罩5个发育状况一致的穗子），每品种每菌株套3袋；

b、小麦黑胚病致病菌的培养：首先将PDA培养基进行灭菌（灭菌时的温度为121℃，灭菌时间为20分钟），然后冷却至50～55℃时，在无菌条件下加入氨苄青霉素钠（氨苄青霉素钠的浓度为100mg/mL，每100mLPDA培养基中氨苄青霉素钠的用量为100μL），摇匀后倒平板；待培养基凝固冷却后，用手术刀片将小麦根腐平脐蠕孢菌菌落切成3mm²的小块儿，放于平板的中央，1块/皿；然后在25℃条件下暗培养12天，用于制作孢子悬浮液；

本步骤采用的致病菌为：小麦根腐平脐蠕孢菌、狗牙根平脐蠕孢菌、蟋蟀草平脐蠕孢菌与草茎点霉菌；其培养过程重复步骤b；

c、小麦黑胚病致病菌孢子悬浮液的制备：用无菌蒸馏水（每皿采用25mL无菌蒸馏水）冲洗PDA平板上培养得到的致病菌菌落后，分别用纱布过滤至50mL的离心管中，在4℃、4000r/min的条件下离心5min，去上清液，加入10mL无菌蒸馏水摇匀再离心，去上清液，再加入5mL无菌蒸馏水，用血球计数板测定孢子浓度，根据测定的浓度按比例加入蒸馏水，调整至孢子浓度为3×10⁵个／mL，得到的孢子悬浮液，于4℃冰箱保存备用；

各种小麦黑胚病致病菌孢子悬浮液的制备重复步骤c；

d、喷洒接菌、套袋保湿：当小麦籽粒有1/3-1/4伸出未剪掉颖壳时，将步骤c制备的孢子悬浮液摇匀后分别均匀喷洒在步骤a中处理的穗子上，喷洒后用塑料袋将穗子罩上保湿5天；

e、黑胚病症状观察：接菌后每天观察步骤d接种处理籽粒上病菌的侵染情况以及籽粒黑胚病症状的形成；同时也分时间段取样，制作切片用光学显微镜或扫描或透射电镜观察，以明确黑胚病致病菌的侵染途径与小麦籽粒组织与菌互作时形态结构的变化；

f、鉴定结果记录：小麦成熟时收获晾干，将步骤d接种处理的穗子手工脱粒，统计黑胚病籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病鉴定的结果。

大田种植情况下的鉴定结果详见表1，实验结果表明，在不同的实验环境条件下，用本发明方法对于不同品系接不同菌株鉴定得到的结果与温室的结果一致。从表1中也可以看出，接菌鉴定的发病率比自然环境条件下要高，例如石家庄8号在2015年的自然发病率为0，本发明方法接种小麦根腐平脐蠕孢菌后该品系黑胚率超过20%），表明如果给予适宜环境，一些在自然条件下鉴定为抗病的材料可能不是真正抗病的，所以用本发明方法采用剪颖壳处理后接菌，筛选出的抗病品种更可靠，所以本发明方法不仅可以应用于小麦黑胚病抗病机理与菌与植物的互作研究，而且可以应用于小麦抗病育种中抗黑胚病材料的筛选，保证所筛选材料的真实可靠。

。

(1)表1中，A、B、C、D分别表示用根腐平脐蠕孢菌、狗牙根平脐蠕孢菌、蟋蟀草平脐蠕孢菌与草茎点霉接菌处理；

(2)表1中CK与自然CK分别表示用本发明方法剪壳处理、喷洒蒸馏水代替致病菌孢子液、套袋保湿5天处理与不做任何处理在自然环境下统计的结果；

(3)用黑胚率表示不同致病菌对四个不同品系鉴定的结果；

(4)鉴定试验中所用的三个小麦品系，根据大田黑胚率调查结果，其中一个（漯麦4号）为感病材料，两个（矮丰68和石家庄8号）为抗病材料。

实施例4：

本发明能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法：该实施例是在大田种植条件下，及时发现黑胚病症状，并采取药物及时防治，取得了显著的防治效果，其详细步骤如下：

a、穗部剪壳处理：在荥阳育种田（荥阳市豫龙镇）种植的小麦抽穗后，用镊子将小麦穗子上部与下部的3个小穗去掉，然后用剪刀将剩下小穗的颖壳从上面剪去1/2，并将麦芒剪掉，每品种剪15穗；

b、黑胚病症状观察：开花5天后每天观察步骤a处理穗子的籽粒上黑胚病症状的出现，同时制作切片用光学显微镜观察籽粒上的菌丝生长情况，当籽粒上有黑胚病症状出现时施以药剂处理；

c、药剂处理：根据步骤b的观察效果，发现黑胚病症状时用25%敌力脱乳油处理，将药剂稀释1000倍后，用喷壶均匀喷洒小麦穗部，同时以喷洒清水处理为对照；

d、防治效果统计：小麦成熟时收获晾干，将步骤c药剂处理的穗子手工脱粒，统计黑胚病籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，用来比较病害防治的结果。

试验结果表明，剪壳后籽粒症状的出现可以及时观察，有利于抓住适宜时间进行黑胚病的防治，两个感病品种及时喷洒农药后，其黑胚率显著下降（图4所示），如果不剪颖壳就发现不了症状。表明本发明方法也可以应用于小麦黑胚病的大田防治工作，能够抓住关键时期及时进行防治，从而提高防治效果。

Claims (8)

1.一种能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，其特征在于，所述接种鉴定方法包括以下步骤：

a、小麦穗部剪壳处理及杂菌隔离：在小麦抽穗后，将小麦穗上部及下部的小穗各去掉3个，将剩下小穗的颖壳从上面剪去1/2，并将麦芒剪掉，然后用硫酸纸袋将去壳的小麦穗罩上以隔离杂菌；

b、小麦黑胚病致病菌的培养：将小麦黑胚病致病菌接种于含有PDA培养基的培养皿中，在25℃条件下暗培养12天；

c、小麦黑胚病致病菌孢子悬浮液的制备：用蒸馏水冲洗步骤b培养得到的致病菌菌落，然后经过滤、离心、调整孢子浓度后得到孢子悬浮液，于4℃冰箱保存备用；

d、喷洒接菌及套袋保湿：在小麦籽粒满仁时，将步骤c制备的孢子悬浮液摇匀后均匀喷洒在步骤a中剪壳处理的穗子上，喷洒后用塑料袋将穗子罩上保湿5天；

e、小麦黑胚病症状观察：接菌后每天观察步骤d接种处理籽粒上病菌的侵染情况以及籽粒黑胚病症状的形成；

f、鉴定结果记录：小麦成熟时收获晾干，将步骤d接种处理的穗子手工脱粒，统计黑胚病籽粒占籽粒总数的百分比即为黑胚率，作为小麦黑胚病鉴定的结果。

2.根据权利要求1所述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，其特征在于：步骤b中所述小麦黑胚病致病菌为小麦根腐平脐蠕孢菌，狗牙根平脐蠕孢菌，蟋蟀草平脐蠕孢菌和草茎点霉菌中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，其特征在于，步骤b中所述将小麦黑胚病致病菌接种于含有PDA培养基的培养皿中，具体操作过程为：首先将PDA培养基进行灭菌，然后冷却至50～55℃时，在无菌条件下加入氨苄青霉素钠，每100mLPDA培养基中氨苄青霉素钠用量为100μL，摇匀后倒平板；待培养基凝固冷却后，将小麦黑胚病致病菌菌落切成3mm²的小块儿，放于平板的中央，1块/皿。

4.根据权利要求3所述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，其特征在于，PDA培养基进行灭菌时的温度为121℃，灭菌时间为20分钟；所述氨苄青霉素钠的浓度为100mg/mL。

5.根据权利要求1所述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，其特征在于，步骤c中小麦黑胚病致病菌孢子悬浮液的制备过程为：

首先用无菌蒸馏水冲洗步骤b中PDA平板上培养得到的致病菌菌落，然后用纱布过滤至50mL的离心管中，在4℃、4000r/min的条件下离心5min，去上清液；接着加入10mL无菌蒸馏水摇匀再离心，去上清液；然后再加入5mL无菌蒸馏水，用血球计数板测定孢子浓度，根据测定的孢子浓度按比例加入无菌蒸馏水，调整至孢子浓度为3×10⁵个／mL，得到小麦黑胚病致病菌孢子悬浮液。

6.根据权利要求1所述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，其特征在于，步骤d中所述小麦籽粒满仁时，是指小麦籽粒发育为满仁，即小麦籽粒有1/3～1/4伸出未剪掉颖壳的时间。

7.根据权利要求1所述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，其特征在于：步骤e中接菌后每天观察步骤d接种处理籽粒上病菌的侵染情况以及籽粒黑胚病症状的形成，根据浸染情况对小麦作出及时防治。

8.根据权利要求1所述的能够及时观察小麦黑胚病症状的接种鉴定方法，其特征在于，步骤e中所述观察采用两种方法：一种是直接用肉眼观察；另一种是分时间段取样，制作切片用光学显微镜或扫描或透射电镜观察，以明确黑胚病致病菌的侵染途径与小麦籽粒组织与菌互作时形态结构的变化。