CN111549094A - 一种室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性的方法 - Google Patents

一种室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性的方法。首先对小麦种子进行表面灭菌，将灭菌后的小麦种子进行幼苗培养；制备小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液，得到孢子悬浮液；将孢子悬浮液摇匀，喷洒在幼苗培养生长至一叶一心的小麦叶片上进行接菌培养，接菌培养第10天记录小麦幼苗第一片叶的病斑面积占总叶片面积的百分比，即为病斑面积百分率；根据方程计算出小麦黑胚率，然后利用黑胚率评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢黑胚病的抗性。本发明鉴定方法与现有大田鉴定方法相比，缩短鉴定时间、简化鉴定环节，大大提高了鉴定的效率，并提高了鉴定结果的准确性与可靠性。

Description

一种室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢黑胚病抗性的 方法
一、技术领域：
本发明属于农作物病害检测技术领域，具体涉及一种室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法。
二、背景技术：
黑胚病是小麦的常见病害，是指小麦籽粒表面有不同形状和程度的黑色、褐色等病斑。小麦黑胚病不仅影响小麦籽粒外观品质导致小麦收购级别的降低，而且影响小麦的出苗率与幼苗生长，更严重的是一些黑胚病致病菌会产生毒素、严重影响人类健康。小麦黑胚病的严重程度随品种、地点、年份及防治措施等因素的不同而变化，发病率一般在0.1～70.0％之间变化(参见：1、Li QY,Xu QQ,Jiang YM,et al.The correlation betweenwheat black point and agronomic traits in the North China Plain.Crop Prot,2019,119：17-23；2、Liu JD,He ZH,Wu L,et al.Genome wide linkage mapping of QTLfor black point reaction in bread wheat(Triticum aestivum L.).Theor ApplGenet,2016,129：2179-2190.3、杨共强，宋玉立，何文兰，等.13种杀菌剂对小麦黑胚病的防治效果。植物保护，2012，38：171-173)。各国对小麦种子黑胚率有严格的限制，我国小麦国家标准(GB 1351-2008)规定，三等以上小麦不完善粒≤6％，其中，黑胚粒是小麦不完善粒的6种组分之一。黄淮冬麦区是我国小麦生产的核心产区，小麦种植面积和年产量占全国的50％以上，而该区目前推广利用的小麦品种普遍感黑胚病，在2000年，仅河南省小麦黑胚病发病面积达3300多千公顷，商品粮普遍降低1-2个等级，全省农民因小麦黑胚病损失高达l0亿多元(王会伟，河南省小麦黑胚病预警与防治决策专家系统的开发.河南农业大学硕士学位论文.2006，郑州)。可见，小麦黑胚病已成为小麦生产上急待解决的问题之一。
培育和种植抗病小麦品种是防治黑胚病最经济有效的手段，而黑胚病抗性鉴定技术是抗病育种和病害防治的基础。由于小麦黑胚病在籽粒灌浆期形成与发展，所以小麦对黑胚病的抗性鉴定只能在灌浆期进行。目前，小麦品种对黑胚病抗性的鉴定主要是基于大田自然发病率，也有通过接种致病菌、在控制环境下进行鉴定的。不管哪种鉴定方法都是在小麦籽粒灌浆期开始、籽粒收获后才能进行黑胚率调查与抗性评价(康业斌,刘顺通,成玉梅,等.小麦对黑胚病的抗性及黑胚对产量损失的影响.植物保护,1999,3：25-27.Li QY,XuQQ,Jiang YM,et al.The correlation between wheat black point and agronomictraits in the North China Plain.Crop Prot,2019,119：17-23)。所以，一个小麦生育期(在黄淮麦区约220天，跨两个自然年度)只能鉴定一次，不仅持续时间长，还要经过接菌、保湿、脱粒等过程，耗费大量的财力与劳动力。另外，小麦黑胚病的发生发展受病原种类与环境条件等多种因素的影响，同一品种在不同年度、不同地点的发病程度变化很大。所以，基于大田条件评价品种抗性的稳定性较差。
小麦黑胚病抗性鉴定存在的费时、费力、结果不稳定的问题严重影响着黑胚病抗病育种、抗病机理等研究的进展。小麦根腐平脐蠕孢(Bipolarissorokiniana)是小麦黑胚病的主要致病菌(Xu KG,Jiang YM,Li YK,et al.Identification and pathogenicity offungal pathogens causing black point in wheat on the North China Plain.IndianJ Microbio.2018,58(2),159-164)，该病菌不仅引起黑胚病(症状比其它致病菌严重：除籽粒黑变外，还引起穗粒数减少、籽粒皱缩、千粒重降低而导致的减产，感病籽粒有毒素残留等)，也是小麦叶枯病的主要致病菌，即其感染小麦籽粒引起黑胚病，侵染叶片会引起小麦叶枯病。Bipolaris sorokiniana侵染小麦叶片引起的叶枯病在苗期也能发生，将Bipolaris sorokiniana引起的苗期叶枯病与籽粒黑胚病进行相关性分析，在二者存在显著相关的基础上进行回归分析，通过回归方程，用苗期叶枯病的病斑百分率计算黑胚率，不仅缩短小麦黑胚病抗性鉴定的时间、而且减少套袋隔离杂菌、脱粒等环节；另外，由于实验在室内进行，实验条件更容易控制从而使实验结果更稳定，使小麦黑胚病抗性鉴定结果更加快捷且结果稳定。
三、发明内容：
本发明要解决的技术问题是：根据目前小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病抗性鉴定方法存在费时、费力和结果不稳定等不足之处，本发明从小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana引起的苗期叶枯病病斑百分率与黑胚率之间存在显著相关性为切入点，提供了一种通过室内鉴定苗期小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana叶枯病病斑百分率来计算黑胚率的方法；即本发明提供一种室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病抗性的方法。本发明鉴定方法与现有大田鉴定方法相比，缩短鉴定时间、简化鉴定环节，大大提高了鉴定的效率，并提高了鉴定结果的准确性与可靠性。
为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：
本发明提供一种室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，所述快速鉴定方法包括以下步骤：
a、小麦种子表面灭菌：挑选健康、饱满的小麦种子浸泡于酒精中，浸泡后采用灭菌蒸馏水进行冲洗；
b、小麦幼苗培养：将步骤a中经表面灭菌处理后的小麦种子放于培养皿中，然后置于培养箱中进行培养，培养时间为10天；
c、小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液的制备：将4℃冰箱保存备用的小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana单孢菌切成0.3cm2的块状，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在25℃条件下暗培养，然后用载玻片从培养好的菌落上将孢子轻轻刮下，采用蒸馏水冲洗、纱布过滤，得到孢子悬浮液；
d、接菌鉴定：将步骤c所得小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液摇匀，摇匀后喷洒在步骤b中培养生长至一叶一心的小麦叶片上，然后用透明塑料罩子罩上，置于培养箱中，25℃条件下培养10天；
e、鉴定结果记录：接菌培养第10天记录步骤d中小麦幼苗第一片叶的病斑面积占总叶片面积的百分比，即为病斑面积百分率；
f、小麦黑胚率计算：利用方程y＝-1.0037x+66.1360，由鉴定的叶枯病病斑面积百分率计算小麦黑胚籽粒百分率即黑胚率；方程中y与x分别为黑胚率与病斑面积百分率；
g、抗病性评价：根据步骤f计算的黑胚率评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana黑胚病的抗性。
根据上述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，步骤a中所述酒精的体积百分含量为70％，浸泡于酒精中的时间为2min；采用灭菌蒸馏水进行冲洗的次数是3次。
根据上述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，步骤a中采用灭菌蒸馏水进行冲洗时：每次加蒸馏水后轻轻摇晃5秒钟，(让残留在种子表面的酒精溶于水中，防止酒精对小麦种子萌发产生抑制作用)。
根据上述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，步骤b中小麦幼苗培养的具体方法：
a、放置小麦种子于直径9cm的培养皿中，培养皿中提前加2层灭菌的滤纸和4mL的灭菌蒸馏水，每个培养皿放置5个小麦品系，每品系15粒；
b、将放好种子的培养皿置于25℃培养箱中暗培养3天，将发芽势不一致的小麦籽粒挑选出去，然后在每个培养皿中补充10mL灭菌蒸馏水，将培养皿的盖子去掉；
c、3天后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“21℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养7天。
根据上述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，步骤c中小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana在25℃条件下暗培养7天，7天后观察孢子产生情况，若菌落颜色发灰表明产孢量过少，需要把培养皿的封口膜去掉培养，待菌落颜色深黑、有大量孢子产生时取出培养皿。
根据上述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，步骤c中所述采用蒸馏水冲洗、纱布过滤的具体过程为：采用灭菌蒸馏水冲洗培养皿2～3次，并用四层纱布过滤得到B.sorokiniana孢子悬浮液，然后采用血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为1×105个/mL。
根据上述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，步骤d所述置于培养箱中进行培养过程中：首先24小时要暗培养，然后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“25℃、黑暗、13小时”交替进行；在培养过程中，每天早、晚两次用喷壶在罩子里面均匀喷3mL的灭菌蒸馏水，以保持小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana侵染与叶枯病斑发展所需的高湿度。
根据上述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，步骤g中小麦对黑胚病的抗性评价具体方法为：无病粒，属于免疫，计为I；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为SS；黑胚率为15.0～30.0％，属于中感，计为MS；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS。
本发明技术方案中所用公式y＝-1.0037x+66.1360：将抗、感小麦幼苗期Bipolaris sorokiniana叶枯病的病斑百分率与黑胚率进行相关性分析，在叶枯病病斑百分率与黑胚率具有显著相关性的基础上进行回归分析所得。本发明方法中小麦幼苗期Bipolaris sorokiniana叶枯病的病斑百分率与黑胚率的相关系数(r)为-0.95，根据病斑面积百分率计算黑胚率的公式的决定系数(r2)为0.90
本发明技术方案是将小麦种子表面灭菌后，置于培养箱中培养至一叶一心期，然后喷洒Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液并套袋保湿，10天后调查叶枯病的病斑面积百分率，通过叶枯病病斑病斑面积百分率与黑胚率的回归方程，计算黑胚率，再根据计算的黑胚率进行小麦对Bipolaris sorokiniana黑胚病的抗性评价。本发明鉴定方法与现有大田鉴定方法相比，缩短鉴定时间、简化鉴定环节，大大提高了鉴定的效率，并提高了鉴定结果的准确性与可靠性。
本发明技术方案中，利用小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana引起小麦苗期叶枯病与籽粒黑胚病的内在联系，首次提出了用B.sorokiniana引起的叶枯病病斑百分率计算黑胚率。本发明从孢子液浓度与调查时间两个发病因素入手，优化了小麦苗期接菌所用的孢子液浓度(1×105)与小麦苗期叶枯病病斑面积调查的时间(接菌后10天)，既为小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana致叶枯病提供适宜条件，又尽量缩短鉴定的时间。
本发明的积极有益效果：
小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana是小麦黑胚病的主要病原菌，广泛存在于小麦生产区。在没有准确鉴定品种抗性的情况下，无法就小麦对这种病原的专化抗病性进行研究和开展抗病育种工作。目前常规的鉴定方法只能在小麦灌浆期开始、籽粒收获后调查，持续一个月，且一年进行一次，由于当年鉴定的结果要在收获后调查，所以鉴定出的抗病材料，次年才能做上杂交，耗费可贵的科研及育种时间；且大田环境尤其是人类无法控制的气象条件多变，年度间抗病性鉴定结果会因环境影响存在偏差；另外，常规的小麦黑胚病抗性大田鉴定方法，包括种植、杂菌隔离、接菌、套袋、收获、脱粒、调查等等繁琐的环节，需要耗费大量的人力物力。与常规大田鉴定方法相比，本发明以苗期的B.sorokiniana叶枯病病斑面积计算黑胚率进行B.sorokiniana黑胚病抗性鉴定，其突出的有益效果如下：
1、鉴定时间不受季节限制：大田黑胚病抗性鉴定只能在籽粒灌浆期(黄淮麦区为4月底至5月上旬)进行，而本发明方法不受季节的限制。培养箱培育小麦幼苗一年四季均可进行，B.sorokiniana菌一年四季均可培养，只要有适宜的温度与湿度，小麦B.sorokiniana叶枯病就可以发生。本发明方法在培养箱中进行控温、通过塑料罩子保湿，叶枯病病斑诱导所需的温度与湿度都能够满足，故本发明鉴定方法一年四季均可进行。
2、时间短：从种子萌发到鉴定结束，整个操作过程仅仅20天就可完成，一年可以进行15次以上，与大田一年一次相比较，大大缩短了鉴定时间、提高了鉴定效率，相对于大田鉴定，育种中的杂交能够提前一年进行。所以，能快速鉴定是本发明方法最显著的创新性及有益效果。
3、结果稳定：本发明在室内进行，温度、湿度等条件容易控制，相对于大田的开放环境中黑胚率在不同年度、不同地点间变化较大而导致的不同品系鉴定结果不稳定的情况相比，本发明方法的鉴定结果更稳定。
4、节省人力物力：相对于大田鉴定的种植、杂菌隔离、接菌、套袋、收获、脱粒、调查等等繁琐的环节，本发明方法仅需要培养幼苗、接菌鉴定、保湿、调查环节，节省了大量的人力物力。
综上所述，本发明技术方案采用苗期B.sorokiniana叶枯病病斑面积百分率计算黑胚率，能够快速的进行小麦对B.sorokiniana黑胚病的抗性鉴定，节省了宝贵的科研实践与大量的人力物力，且鉴定结果的一致性较好。因此，本发明能够用于小麦对B.sorokiniana黑胚病的抗性鉴定，能准确、高效地筛选抗、感病品种和进行分离群体的表型鉴定，便于小麦抗B.sorokiniana黑胚病遗传与基因/QTL定位、分子标记开发等研究，有利于推进小麦抗蠕孢黑胚病的遗传研究和抗病育种工作。
本发明不同保湿时间与B.sorokiniana孢子浓度条件下叶枯病斑面积百分率情况，详见表1。
表1 不同保湿时间与B.sorokiniana孢子液浓度条件下叶枯病斑面积
Figure BDA0002454828210000071
注明：
(1)表中天数为本发明技术方案步骤d中记载的接菌处理后的天数(即小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液摇匀喷洒在培养生长至一叶一心的小麦叶片上，然后用透明塑料罩子罩上，置于培养箱中培养的天数)，鉴定结果用病斑面积百分比表示，同一列数据后的大写字母不同表示在0.01水平上差异显著；
(2)不同浓度的孢子液接菌处理后，病斑面积随孢子液浓度的增加而增加，当孢子液浓度高于1×105个/mL时，病斑面积增加程度减缓，故本发明选择B.sorokiniana孢子液浓度为1×105个/mL作为鉴定所用浓度；
(3)不同孢子液浓度下，病斑面积均随着保湿时间的延长而升高，在处理12天后的病斑面积显著增高而与处理15天之间差异不明显，所以以10天作为抗病鉴定处理所需时间；
(4)综合叶枯病斑面积情况，选择1×105个/mL孢子液浓度，接菌处理10天作为本发明鉴定小麦对黑胚病抗性的条件。
本发明54个小麦品系B.sorokiniana黑胚率与叶枯病斑百分率回归分析结果，详见附图1。
四、附图说明：
图1本发明技术方案中54个小麦品系B.sorokiniana黑胚率和叶枯病斑百分率的回归分析结果；
图1中：黑胚率与叶枯病斑百分率呈显著的负相关关系，相关系数(r)为-0.95，二者的回归方程为y＝-1.0037x+66.1360，决定系数(r2)为0.90，公式中y与x分别为黑胚率与病斑面积百分率。
图2本发明技术方案中54个小麦品系B.sorokiniana黑胚率与大田鉴定黑胚率回归分析；
图2中：本发明计算的黑胚率与大田鉴定的黑胚率呈显著的正相关关系，相关系数(r)为0.96。
图3利用本发明技术方案筛选的典型抗感B.sorokiniana黑胚病小麦品系；
图3中：上面为接B.sorokiniana后叶枯病病斑情况，下面为接B.sorokiniana后黑胚病发病情况；A为感黑胚病小麦品系驻麦6097，B为抗黑胚病小麦品系山农530070；CK为喷蒸馏水对照，Bs为喷B.sorokiniana孢子悬浮液处理。
五、具体实施方式：
以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明技术方案保护的范围。
实施例1：
2016年冬季，采用本发明室内快速鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病抗性的方法，对54个在荥阳收获的小麦品系进行黑胚病抗性鉴定，其详细步骤如下：
a、小麦种子表面灭菌：挑选54个小麦品系健康、饱满小麦种子浸于70％(体积比)的酒精中2min，然后用灭菌蒸馏水冲洗3次，每次加入蒸馏水后轻轻摇晃5秒钟，让残留在种子表面的酒精充分溶于水中，防止酒精对小麦种子萌发产生抑制作用；
b、小麦幼苗培养：将步骤a中经表面灭菌处理后的小麦种子放于直径9cm的培养皿中，每个培养皿中提前加2层灭菌的滤纸和4mL的灭菌蒸馏水，每个培养皿放置5个小麦品系，每品系15粒；然后将培养皿放在25℃培养箱中暗培养3天，将发芽势不一致的小麦籽粒挑选出去，然后在每个培养皿中补充10mL灭菌蒸馏水，将培养皿的盖子去掉；3天后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“21℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养7天；
c、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana孢子悬浮液制作：将4℃冰箱保存备用的小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana单孢菌切成0.3cm2的块状，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，在25℃条件下暗培养7天，观察孢子产生情况，若菌落颜色发灰表明产孢量过少，需要把培养皿的封口膜去掉培养，待菌落颜色深黑、有大量孢子产生时取出培养皿；用灭菌载玻片将孢子轻轻刮下，用灭菌蒸馏水冲洗培养皿3次，并用四层纱布过滤得到B.sorokiniana孢子悬浮液，然后借助血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为1×105个/mL；
d、接菌鉴定：将步骤c中制备的B.sorokiniana孢子悬浮液摇匀，摇匀后喷洒在步骤b中培养生长至一叶一心的小麦叶片上，然后用透明塑料罩子罩上，放置在培养箱中，25℃条件下暗培养24小时；24小时后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“25℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养9天；每天早、晚两次用喷壶在罩子里面均匀喷3mL的灭菌蒸馏水，以保持小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana侵染与叶枯病斑发展所需的高湿度；
e、鉴定结果记录：接菌培养第10天记录步骤d中小麦幼苗第一片叶的病斑面积占总叶片面积的百分比即病斑面积百分率；
f、小麦黑胚率计算：利用方程y＝-1.0037x+66.1360，由鉴定的叶枯病病斑面积百分率计算小麦黑胚籽粒百分率(即黑胚率)，公式中y与x分别为黑胚率与病斑面积百分率；
g、抗病性评价：根据步骤f计算的黑胚率评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病的抗性(小麦对黑胚病的抗性评价具体方法为：无病粒，属于免疫，计为I；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为SS；黑胚率为15.0～30.0％，属于中感，计为MS；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS)。
54个小麦品系鉴定结果详见表2与附图1。从附图1可知，小麦苗期B.sorokiniana叶枯病斑面积越大，大田灌浆期B.sorokiniana黑胚率越低，即苗期叶枯病斑面积与大与黑胚率呈显著的负相关关系，相关系数达到-0.95，经回归分析，决定系数为0.90；利用本发明对54个小麦品系进行抗性评价与大田接菌鉴定结果的比较表明，54个小麦品系中，50个品系的鉴定结果一致，仅有4个品系的抗感鉴定结果不一致(见表2)；根据叶枯病斑面积计算的黑胚率与大田实际鉴定的黑胚率显著相关，相关系数达到0.96。上述结果表明，采用本发明技术方案能够较好的评价小麦对B.sorokiniana黑胚病的抗性。
表2 2016年收获的54个小麦品系大田接菌鉴定结果与本发明抗性鉴定结果比较
Figure BDA0002454828210000101
Figure BDA0002454828210000111
注明：
(1)叶枯病斑为本发明2016年冬季室内接种B.sorokiniana的鉴定结果，黑胚率为2016年小麦灌浆期大田接种B.sorokiniana鉴定的结果，大田黑胚病抗性鉴定方法参照国家发明专利(ZL 2015105396457)；
(2)抗性评价中：I表示免疫(黑胚率为0％)，HR表示高抗(0.1～1.9％)，R为抗(2.0～4.9％)，SS为轻感(5.0～14.9％)，MS为中感(15.0～30.0％)，HS为高感(黑胚率＞30％)。鉴定结果为免疫、高抗与抗者为抗病品系，而轻感、中感与高感者为感病品系。
实施例2：
采用本发明室内快速鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病抗性的方法，对10个抗病小麦品系进行连续3年的鉴定，并与大田鉴定结果进行比较，其详细步骤如下：
a、小麦种子表面灭菌：挑选健康、饱满的小麦种子浸于70％(体积比)的酒精中2min，然后用灭菌蒸馏水冲洗3次，每次加入蒸馏水后轻轻摇晃5秒钟，让残留在种子表面的酒精充分溶于水中，防止酒精对小麦种子萌发产生抑制作用；
b、小麦幼苗培养：将步骤a中经表面灭菌处理后的小麦种子放于直径9cm的培养皿中，每个培养皿中提前加2层灭菌的滤纸和4mL的灭菌蒸馏水，每个培养皿放置5个小麦品系，每品系15粒；然后将培养皿放在25℃培养箱中暗培养3天，将发芽势不一致的小麦籽粒挑选出去，然后在每个培养皿中补充10mL灭菌蒸馏水，将培养皿的盖子去掉；3天后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“21℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养7天；
c、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana孢子悬浮液制作：将4℃冰箱保存备用的小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana单孢菌切成0.3cm2的块状，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，在25℃条件下暗培养7天，观察孢子产生情况，若菌落颜色发灰表明产孢量过少，需要把培养皿的封口膜去掉培养，待菌落颜色深黑、有大量孢子产生时取出培养皿；用灭菌载玻片将孢子轻轻刮下，用灭菌蒸馏水冲洗培养皿3次，并用四层纱布过滤得到B.sorokiniana孢子悬浮液，然后借助血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为1×105个/mL；
d、接菌鉴定：将步骤c中制备的B.sorokiniana孢子悬浮液摇匀，摇匀后喷洒在步骤b中培养生长至一叶一心的小麦叶片上，然后用透明塑料罩子罩上，放置在培养箱中，25℃条件下暗培养24小时；24小时后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“25℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养9天；每天早、晚两次用喷壶在罩子里面均匀喷3mL的灭菌蒸馏水，以保持小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana侵染与叶枯病斑发展所需的高湿度；
e、鉴定结果记录：接菌培养第10天记录步骤d中小麦幼苗第一片叶的病斑面积占总叶片面积的百分比即病斑面积百分率；
f、小麦黑胚率计算：利用方程y＝-1.0037x+66.1360，由鉴定的叶枯病病斑面积百分率计算小麦黑胚籽粒百分率(即黑胚率)，公式中y与x分别为黑胚率与病斑面积百分率；
g、抗病性评价：根据步骤f计算的黑胚率评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病的抗性(小麦对黑胚病的抗性评价具体方法为：无病粒，属于免疫，计为I；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为SS；黑胚率为15.0～30.0％，属于中感，计为MS；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS)。
本发明连续三年对10个小麦品系进行抗B.sorokiniana黑胚病鉴定与大田种植情况下的鉴定结果比较详见表3与附图3，表3的结果表明：三年中，用本发明方法鉴定的10个品系对B.sorokiniana黑胚病的抗性评价结果一致；而大田环境条件下，受小麦灌浆期气象因子温度、湿度、日照长度等因素的影响，10个品种中有9个的抗性评价在年度间不一致，如国麦2号三年的黑胚率在0.9％～9.1％之间变动，抗性评价结果分别为R、HR、SS，这种结果将导致对同一小麦品系抗性评价出现偏差；而采用本发明的鉴定方法，则在三年中的鉴定结果一致，保证了抗性评价的一致性。
表3 本发明连续三年对小麦进行抗B.sorokiniana黑胚病鉴定结果与大田鉴定结果比较
Figure BDA0002454828210000131
注明：
(1)三年的大田抗性鉴定试验分别在荥阳育种田(荥阳市豫龙镇)完成，大田黑胚病抗性鉴定方法参照国家发明专利(ZL 2015105396457)；
(2)抗性评价中I、HR、R、SS分别表示免疫、高抗、抗、轻感。
(3)用本发明方法鉴定，三年10个品系对B.sorokiniana黑胚病的抗性评价一致；而大田环境条件下，10个品系中的9个品系的抗性评价结果在年度间不完全一致。
实施例3：
采用本发明室内快速鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病抗性的方法，2018年3月份从10个F4与F5高代系中鉴定到2个抗病品系，四月份大田做杂交，比大田鉴定，提前1年做杂交，提高育种效率，其详细步骤如下：
a、小麦种子表面灭菌：挑选10个F4与F5小麦高代系的健康、饱满种子浸于70％(体积比)酒精中2min，然后用灭菌蒸馏水冲洗3次，每次加入蒸馏水后轻轻摇晃5秒钟，让残留在种子表面的酒精充分溶于水中，防止酒精对小麦种子萌发产生抑制作用；
b、小麦幼苗培养：将步骤a中经表面灭菌处理后的小麦种子放于直径9cm的培养皿中，每个培养皿中提前加2层灭菌的滤纸和4mL的灭菌蒸馏水，每个培养皿放置5个小麦品系，每品系15粒；然后将培养皿放在25℃培养箱中暗培养3天，将发芽势不一致的小麦籽粒挑选出去，然后在每个培养皿中补充10mL灭菌蒸馏水，将培养皿的盖子去掉；3天后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“21℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养7天；
c、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana孢子悬浮液制作：将4℃冰箱保存备用的小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana单孢菌切成0.3cm2的块状，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，在25℃条件下暗培养7天，观察孢子产生情况，若菌落颜色发灰表明产孢量过少，需要把培养皿的封口膜去掉培养，待菌落颜色深黑、有大量孢子产生时取出培养皿；用灭菌载玻片将孢子轻轻刮下，用灭菌蒸馏水冲洗培养皿3次，并用四层纱布过滤得到B.sorokiniana孢子悬浮液，然后借助血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为1×105个/mL；
d、接菌鉴定：将步骤c中制备的B.sorokiniana孢子悬浮液摇匀，然后加入吐温-20摇匀，吐温-20的加入量占B.sorokiniana孢子悬浮液体积的0.02％，摇匀后用喷壶均匀喷洒在步骤b中培养生长至一叶一心的小麦叶片上，然后用透明塑料罩子罩上，放置在培养箱中，25℃条件下暗培养24小时；24小时后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“25℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养9天；每天早、晚两次用喷壶在罩子里面均匀喷3mL的灭菌蒸馏水，以保持B.sorokiniana侵染与叶枯病斑发展所需的高湿度；
e、鉴定结果记录：接菌培养第10天记录步骤d中小麦幼苗第一片叶的病斑面积占总叶片面积的百分比即病斑面积百分率；
f、小麦黑胚率计算：利用方程y＝-1.0037x+66.1360，由鉴定的叶枯病病斑面积百分率计算小麦黑胚籽粒百分率(即黑胚率)，公式中y与x分别为黑胚率与病斑面积百分率；
g、抗病性评价：根据步骤f计算的黑胚率来评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病的抗性(小麦对黑胚病的抗性评价具体方法为：无病粒，属于免疫，计为I；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为SS；黑胚率为15.0～30.0％，属于中感，计为MS；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS)。
2018年3月对10个高代系进行室内黑胚病鉴定的结果见表4，根据室内鉴定结果，从10个高代系中筛选到2个抗黑胚病品系(17YH24与17YQ13)，2018年4月就与高产小麦品种做上了杂交。如果进行大田鉴定，4月底才能进行，杂交只能到2019年才能做。因此，采用本发明方法，使抗黑胚病小麦育种进程提前1年进行。
表4 本发明对10个F4与F5小麦高代系进行抗B.sorokiniana黑胚病鉴定结果
Figure BDA0002454828210000151
注明：
(1)抗性评价中I、HR、R、SS、MS、HS分别表示免疫、高抗、抗、轻感、中感、高感；
(2)字体加粗的为筛选出的用于杂交的2个抗病高代系，感病品系就是淘汰的育种材料，不用再做杂交。
实施例4：
采用本发明室内快速鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病抗性的方法，2018年3月份对小麦生产上大面积种植或正在参加生产试验的105个小麦品系进行室内鉴定，筛选抗病品系3个，节省了50％以上的人力物力，其详细步骤如下：
a、小麦种子表面灭菌：挑选105小麦品系的健康、饱满种子浸于70％(体积比)酒精中2min，然后用灭菌蒸馏水冲洗3次，每次加入蒸馏水后轻轻摇晃5秒钟，让残留在种子表面的酒精充分溶于水中，防止酒精对小麦种子萌发产生抑制作用)；
b、小麦幼苗培养：将步骤a中经表面灭菌处理后的小麦种子放于直径9cm的培养皿中，每个培养皿中提前加2层灭菌的滤纸和4mL的灭菌蒸馏水，每个培养皿放置5个小麦品系，每品系15粒；然后将培养皿放在25℃培养箱中暗培养3天，将发芽势不一致的小麦籽粒挑选出去，然后在每个培养皿中补充10mL灭菌蒸馏水，将培养皿的盖子去掉；3天后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“21℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养7天；
c、小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana孢子悬浮液制作：将4℃冰箱保存备用的小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana单孢菌切成0.3cm2的块状，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，在25℃条件下暗培养7天，观察孢子产生情况，若菌落颜色发灰表明产孢量过少，需要把培养皿的封口膜去掉培养，待菌落颜色深黑、有大量孢子产生时取出培养皿；用灭菌载玻片将孢子轻轻刮下，用灭菌蒸馏水冲洗培养皿3次，并用四层纱布过滤得到B.sorokiniana孢子悬浮液，然后借助血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为1×105个/mL；
d、接菌鉴定：将步骤c中制备的B.sorokiniana孢子悬浮液摇匀，然后加入吐温-20摇匀，吐温-20的加入量占B.sorokiniana孢子悬浮液体积的0.02％，摇匀后用喷壶均匀喷洒在步骤b中培养生长至一叶一心的小麦叶片上，然后用透明塑料罩子罩上，放置在培养箱中，25℃条件下暗培养24小时；24小时后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“25℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养9天；每天早、晚两次用喷壶在罩子里面均匀喷3mL的灭菌蒸馏水，以保持B.sorokiniana侵染与叶枯病斑发展所需的高湿度；
e、鉴定结果记录：接菌培养第10天记录步骤d中小麦幼苗第一片叶的病斑面积占总叶片面积的百分比即病斑面积百分率；
f、小麦黑胚率计算：利用方程y＝-1.0037x+66.1360，由鉴定的叶枯病病斑面积百分率计算小麦黑胚籽粒百分率(即黑胚率)，公式中y与x分别为黑胚率与病斑面积百分率；
g、抗病性评价：根据步骤f计算的黑胚率来评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢B.sorokiniana黑胚病的抗性(小麦对黑胚病的抗性评价具体方法为：无病粒，属于免疫，计为I；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为SS；黑胚率为15.0～30.0％，属于中感，计为MS；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS)。
2018年室内对105个小麦品系鉴定结果见表5，从105个小麦品系中筛选出抗病品系4份，2019年对鉴定出的抗病品系进行了大田接菌鉴定的验证，确定了抗黑胚病小麦品系3个。室内鉴定105份小麦品系只用20天时间、2个培养箱、1个人就可以完成，如果在大田则需要种植至少105行、一个小麦生育期200多天的时间、2～3个人合作才能完成，所以本发明室内鉴定小麦对B.sorokiniana黑胚病抗性的方法，节省了至少50％以上的人力物力。
表5 本发明对105个小麦品系抗B.sorokiniana黑胚病鉴定结果
Figure BDA0002454828210000171
Figure BDA0002454828210000181
注明：
(1)本实施例的目的是为抗病育种及抗黑胚病机理研究提供典型抗病及感病材料，因为大田接菌鉴定受生育期时间限制，为减轻工作量，室内鉴定不是抗病或高感的品系即不是典型抗、感病的材料不再进行大田鉴定；
(2)抗性评价中R、SS、MS、HS分别表示抗、轻感、中感、高感；
(3)加黑字体为鉴定的3个抗病品系。
以上各实施例中采用的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基培养致病菌B.sorokiniana，其配方及其配制方法如下：
PDA培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g和自来水1000mL，自然pH；其配制步骤：将马铃薯洗净去皮切成厚约0.2mm的小片，水沸后放入煮至土豆片用玻璃棒能戳烂，然后用四层纱布过滤、去掉土豆块，加入葡萄糖和琼脂粉，继续加热搅拌混匀，冷却后再补足水分至1000mL；分装至150mL三角瓶中(90mL/瓶)，121℃灭菌20分钟；冷却至50℃左右倒入直径9cm的培养皿中，(10mL/皿)，冷却后用于培养B.sorokiniana。

Claims (8)

1.一种室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，其特征在于，所述快速鉴定方法包括以下步骤：
a、小麦种子表面灭菌：挑选健康、饱满的小麦种子浸泡于酒精中，浸泡后采用灭菌蒸馏水进行冲洗；
b、小麦幼苗培养：将步骤a中经表面灭菌处理后的小麦种子放于培养皿中，然后置于培养箱中进行培养，培养时间为10天；
c、小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液的制备：将4℃冰箱保存备用的小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana单孢菌切成0.3cm2的块状，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在25℃条件下暗培养，然后用载玻片从培养好的菌落上将孢子轻轻刮下，采用蒸馏水冲洗、纱布过滤，得到孢子悬浮液；
d、接菌鉴定：将步骤c所得小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana孢子悬浮液摇匀，摇匀后喷洒在步骤b中培养生长至一叶一心的小麦叶片上，然后用透明塑料罩子罩上，置于培养箱中，25℃条件下培养10天；
e、鉴定结果记录：接菌培养第10天记录步骤d中小麦幼苗第一片叶的病斑面积占总叶片面积的百分比，即为病斑面积百分率；
f、小麦黑胚率计算：利用方程y＝-1.0037x+66.1360，由鉴定的叶枯病病斑面积百分率计算小麦黑胚籽粒百分率即黑胚率；方程中y与x分别为黑胚率与病斑面积百分率；
g、抗病性评价：根据步骤f计算的黑胚率评价小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana黑胚病的抗性。
2.根据权利要求1所述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana黑胚病抗性的方法，其特征在于：步骤a中所述酒精的体积百分含量为70％，浸泡于酒精中的时间为2min；采用灭菌蒸馏水进行冲洗的次数是3次。
3.根据权利要求1所述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana黑胚病抗性的方法，其特征在于，步骤a中采用灭菌蒸馏水进行冲洗时：每次加蒸馏水后轻轻摇晃5秒钟，让残留在种子表面的酒精溶于水中，防止酒精对小麦种子萌发产生抑制作用)。
4.根据权利要求1所述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana黑胚病抗性的方法，其特征在于，步骤b中小麦幼苗培养的具体方法：
a、放置小麦种子于直径9cm的培养皿中，培养皿中提前加2层灭菌的滤纸和4mL的灭菌蒸馏水，每个培养皿放置5个小麦品系，每品系15粒；
b、将放好种子的培养皿置于25℃培养箱中暗培养3天，将发芽势不一致的小麦籽粒挑选出去，然后在每个培养皿中补充10mL灭菌蒸馏水，将培养皿的盖子去掉；
c、3天后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“21℃、黑暗、13小时”交替进行，再继续培养7天。
5.根据权利要求1所述的快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性的方法，其特征在于，步骤c中小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana在25℃条件下暗培养7天，7天后观察孢子产生情况，若菌落颜色发灰表明产孢量过少，需要把培养皿的封口膜去掉培养，待菌落颜色深黑、有大量孢子产生时取出培养皿。
6.根据权利要求1所述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana黑胚病抗性的方法，其特征在于，步骤c中所述采用蒸馏水冲洗、纱布过滤的具体过程为：采用灭菌蒸馏水冲洗培养皿2～3次，并用四层纱布过滤得到B.sorokiniana孢子悬浮液，然后采用血球计数板检测孢子悬浮液的浓度，调整至孢子浓度为1×105个/mL。
7.根据权利要求1所述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana黑胚病抗性的方法，其特征在于，步骤d所述置于培养箱中进行培养过程中：首先24小时要暗培养，然后培养箱的温光周期为“25℃、光照、11小时”与“25℃、黑暗、13小时”交替进行；在培养过程中，每天早、晚两次用喷壶在罩子里面均匀喷3mL的灭菌蒸馏水，以保持小麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana侵染与叶枯病斑发展所需的高湿度。
8.根据权利要求1所述的室内快速鉴定小麦对小麦根腐平脐蠕孢Bipolarissorokiniana黑胚病抗性的方法，其特征在于：步骤g中小麦对黑胚病的抗性评价具体方法为：无病粒，属于免疫，计为I；黑胚率为0.1～1.9％，属于高抗，计为HR；黑胚率为2.0～4.9％，属于抗，计为R；黑胚率为5.0～14.9％，属于轻感，计为SS；黑胚率为15.0～30.0％，属于中感，计为MS；黑胚率＞30％，属于高感，计为HS。
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