CN107365829B

CN107365829B - 一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法

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Publication number: CN107365829B
Application number: CN201710693727.6A
Authority: CN
Inventors: 时焦; 王钢; 张保全; 王聪; 王海波; 李正鹏
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-08-14
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2037-08-14
Also published as: CN107365829A

Abstract

本发明公开了一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法，其中，按照下列步骤操作：a、培育不同种质的烟苗；b、分别收集不同种质的根系分泌物；c、将根系分泌物灭菌后与燕麦培养基混合，并倒入培养皿中；d、接种黑胫病菌菌饼；e、十字交叉法测量菌落直径；f、根据菌落直径大小鉴定抗性水平，从而鉴定获得抗病种质。本发明将烟草根系分泌物加入到培养基中，可以在实验室中完成烟草种质对黑胫病的抗性鉴定，比常规田间病圃鉴定省去了大面积带菌试验地（田间病圃）的设置，又不需要一个生长季节的烟草种植，节省了人力、物力与时间。该发明使烟草种质对黑胫病的抗性鉴定不受生长季节的限制，并且在短时间内可以完成大量烟草种质的筛选。

Description

一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法

技术领域：

本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法。

背景技术：

烟草黑胫病是烟草的重要病害之一。烟草黑胫病又称烟草疫病，俗称 “黑杆疯”、“腰烂”、“猪屎斑”，“黑膏药”等，是由Phytophthora parasitica var nicotianae 引起的，该病可造成烟株快速死亡，全世界各主要产烟区均有不同程度的发生，发病率一般为5％～15％，重病区发病率可达30％以上，能给烟草生产造成毁灭性的打击，是世界性的烟草重要病害。近年来，随着烟草连作种植年限的延长，全国各烟区病情日趋严重。由于生产上栽培烟草品种对黑胫病抗性较差或综合抗性不足，黑胫病的防治目前仍然依赖于化学防治。防治烟草黑胫病的主要农药为甲霜灵锰锌和霜霉威，药剂种类较为单一，且均已有十几年甚至几十年的使用历史，病菌对化学农药产生抗药性，导致防治效果下降，防治成本增加，环境污染加剧。因此减少农药使用，促进安全优质烟叶生产，对改善农业生态环境具有重要意义。抗病品种的应用是植物病害防治最安全有效与经济的方法。

为了不断提高烟草品种的抗病性，需要不断的筛选新的可利用的抗源。烟草黑胫病抗病种质筛选的传统方法是首先建立病圃（即几亩至几十亩农田，农田中含有大量的黑胫病菌），人工培育烟苗，将烟苗种植在病圃中，待烟株生长至成熟期，根据发病情况进行鉴定，通常还需人工接种。这种常规方法如现有技术CN101671720A公开了一种病圃中烟草黑胫病的生理小种的鉴定方法：一、测定鉴别寄主在田间的抗病反应：在病圃中栽培鉴别寄主，在烤烟烟叶采收后挖根调查，对鉴定品种进行分级和抗性评价，集合烟草黑胫病0. 1.2和3号小种的寄主反应判断生理小种类型；二、测定菌株在TTC固体培养基中的颜色变化：从病圃中随机采集不同品种的病株，分离纯化病原并鉴定后，进行TTC法测定，根据颜色变化判断烟草黑胫病生理小种类型；三，综合上述两种鉴定结果，鉴别寄主在田间的抗病反应和TTC测定结果判断生理小种类型。这种传统的鉴定方法不仅耗时长，而且需要建立病圃，并且鉴定结果受天气条件的影响很大。

再如现有技术中，CN106665328A公开了一种烤烟抗黑胫病定向培育方法，选育流程：种质资源的筛选-亲本选配-F1病圃鉴定-F2-3代病圃筛选-F4-6大田鉴定-品系鉴定-品系比较实验-区域实验-生产实验-品种审定。这种筛选方法仍然通过建立病圃的方式，虽然缩短品种后期病害的鉴定时间，但整体时间仍然过长。

又如现有技术中，CN 104745672 A公开了一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，包括以下步骤：步骤一、烟草黑胫病菌培养：将烟草黑胫病菌0 号小种；接种于燕麦培养基上在28℃条件下培养7-10 天，待菌丝长满整个皿后，用接种环除去菌皿表面附着的菌丝，留菌皿备用；步骤二、取待测烟草种子表面消毒：取待测均匀饱满烟草种子，置于无菌培养皿中，用75% 的酒精浸泡3 分钟，再用10% 的次氯酸钠浸泡5 分钟，随后用无菌水反复清洗3 次，减少消毒液残留；步骤三、发芽率，发病率统计，并进行抗病性评价：分别将步骤二中消毒烟草种子无菌条件下转移到步骤一培养的烟草黑胫病菌皿和没有接种烟草黑胫病菌的燕麦培养基上，保持在相对湿度80%- 90%、光照强度1000lx-2000lx、温度25-28℃、3-7天后开始观察种子发芽情况，根据发病率判断供试材料的抗性，发病率≥ 50% 为感病品种，15% ≤发病率＜ 50% 为中抗品种，发病率＜ 15% 为抗病品种。这种方式缩短了时间，但是鉴定效果不足。该方法需要额外2次打开灭菌的培养皿，第一次打开是当培养皿中的黑胫病菌长满培养皿时将生长的菌丝去掉；第二次打开是将待鉴定的烟草种子放入去掉菌丝的培养皿中时。即使在超净工作台上操作，培养皿每打开一次就增加一次污染的机会，在用培养皿进行无污染培养过程中，即使中间不打开培养皿都有一定的污染机率，打开2次，还向其中加入灭菌的种子（正常情况下种子灭菌后在培养基中无菌培养也有一定的污染机率），因此该鉴定过程很容易出现污染，无法完成鉴定。

另外，烟草种子从发芽到受到培养基中黑胫病菌产生的毒素危害致死（该种鉴定的机理），至少需要4周以上的时间，一般都需要5周以上的时间。在漫长的5周时间内很容易污染。并且培养皿中生长的黑胫病菌的菌丝，用移菌环去掉之后，仍然会继续生长，黑胫病菌与烟草种子同时在培养皿中生长，种子很难成活，影响鉴定结果。

鉴于上述技术问题，需要发明一种快速、有效，且鉴定效果好的一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种快速、有效，且鉴定效果好的一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法。本方法利用烟草植株的根系分泌物制作含根系分泌物的培养基，并在此培养基上培养烟草黑胫病菌，从而能够快速、经济、方便、可靠的直接筛选出烟草抗黑胫病的种质，本方法能够替代田间筛选试验，在实验室中即可完成烟草抗黑胫病的种质材料筛选。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

a、培育不同种质的烟苗；

b、分别收集不同种质的根系分泌物浸提液；

c、将收集好的根系分泌物浸提液定容至200 mL，然后取根系分泌物浸提液和乙酸乙酯各100 mL混入分液漏斗中萃取，合并萃取液；

d、取萃取液有机相用旋转蒸发仪在40℃水浴下旋蒸浓缩至浸膏，随后用去离子水洗瓶定容至1 mL，无水硫酸钠除水，装入1.5 mL样品瓶中，获得根系分泌物萃取液，并用0.22 µm微孔膜过滤；

e、将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的燕麦培养基（每100 mL培养基含1%氯霉素抑菌剂0.3 mL)以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；

f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，于28℃恒温培养箱黑暗培养；

g、每24 h十字交叉法测量菌落直径，共测量4次；

h、根据菌落直径大小鉴定抗性水平，从而鉴定获得抗病种质。

步骤b进一步包括根系分泌物浸提液的收集：

将移栽2周后的烟苗从土壤中取出，用去离子水反复冲洗根部，随后单株浸入盛有250 mL去离子水的烧杯中，并遮光，用杯中水收集各处理根系分泌物浸提液36 h。

步骤e进一步包括配制燕麦培养基：

称取燕麦片30 g（河北西麦食品有限公司生产），加入到1000 mL去离子水中煮沸15 min左右，加入15 g琼脂煮沸，双层纱布过滤，定容至1000 mL，121℃灭菌20 min。

步骤f、进一步包括黑胫病菌菌饼的制作：

于燕麦琼脂培养基上培养黑胫病菌，待病菌接近长满培养皿时，在菌落的边缘取直径0.5 cm的烟草黑胫病菌菌饼用于步骤f接种。

本发明相对于现有技术，具有以下特点：

1.利用根系分泌物鉴定，可以在实验室中完成烟草种质对黑胫病的抗性鉴定，比常规鉴定试验省略了田间病圃的设立，常规鉴定试验需要大面积带菌试验地（田间病圃），节省了人力、物力与时间。

2.使烟草种质对黑胫病的抗性鉴定不受生长季节的限制，任何季节都能开展鉴定工作。并且在短时间内可以完成大量种质资源的筛选，大量节省了鉴定时间，因为田间鉴定需要一个生长季节的时间。

3.鉴定结果更准确，不会像田间鉴定，在自然条件下由于病害不发生，不能完成鉴定；为了创造田间发病的条件，进行人工接种，开展大面积的田间接种，接种体分布往往不均匀，从而出现接种强度不一致的现象，造成鉴定误差。

4.采用此种方法与已知抗感品种在大田中对黑胫病的抗性表现一致。

附图说明：

图1为本发明筛选方法的流程示意图。

具体实施方式：

下面结合附图，对发明进行说明

实施例一、筛选方法如下

a、培育不同种质的烟苗；b、分别收集不同种质的根系分泌物浸提液；c、将收集好的根系分泌物浸提液定容至200 mL，然后取根系分泌物浸提液和乙酸乙酯各100 mL混入分液漏斗中萃取，合并萃取液；d、取萃取液有机相用旋转蒸发仪在40℃水浴下旋蒸浓缩至浸膏，随后用去离子水洗瓶定容至1 mL，无水硫酸钠除水，装入1.5 mL样品瓶中，获得根系分泌物萃取液，并用0.22 µm微孔膜过滤；e、将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的马铃薯培养基（每100 mL培养基含1%氯霉素抑菌剂0.3 mL)以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，于28℃恒温培养箱黑暗培养；g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；h、根据菌落直径大小鉴定抗性水平，从而鉴定获得抗病种质。

步骤e将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的马铃薯培养基（每100 mL培养基含1%氯霉素抑菌剂0.3 mL)以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；马铃薯培养基制备具体为：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（北京陆桥技术有限公司生产）40.1 g ，加入到1000 mL蒸馏水中煮沸3 min左右，定容至1000 mL，121℃灭菌20min。步骤f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，进一步包括培养黑胫病菌菌饼的获得：于燕麦琼脂培养基上培养黑胫病菌，待病菌接近长满培养皿时，在菌落的边缘取直径0.5 cm的烟草黑胫病菌菌饼用于步骤f接种。步骤g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；共测量4次；

鉴定结果如下表:

表1 黑胫病不同抗性种质根系分泌物对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响（mm）

通过表1烟草黑胫病菌菌丝生长的直径得出，Florida301和革新3号为抗病种质。

实施例2、筛选方法如下

a、培育不同种质的烟苗；b、分别收集不同种质的根系分泌物浸提液；c、将收集好的根系分泌物浸提液定容至200 mL，然后取根系分泌物浸提液和乙酸乙酯各100 mL混入分液漏斗中萃取，合并萃取液；d、取萃取液有机相用旋转蒸发仪在40℃水浴下旋蒸浓缩至浸膏，随后用去离子水洗瓶定容至1 mL，无水硫酸钠除水，装入1.5 mL样品瓶中，获得根系分泌物萃取液，并用0.22 µm微孔膜过滤；e、将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的查彼培养基（每100 mL培养基含1%氯霉素抑菌剂0.3 mL)以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，于28℃恒温培养箱黑暗培养；g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；h、根据菌落直径大小鉴定抗性水平，从而鉴定获得抗病种质。

步骤e将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的查彼培养基（每100mL培养基含1%氯霉素抑菌剂0.3 mL)以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；查彼培养基制备具体为：

NaNO₃ 2 g

K₂HPO₄ 1 g

KCl 0.5 g

MgSO₄ 0.5 g

FeSO₄ 0.01 g

蔗糖 30 g

琼脂 18-20 g

水 1000 mL

pH 自然。

将上述成分混匀煮沸3 min左右，定容至1000 mL，121℃灭菌20 min。步骤f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，进一步包括培养黑胫病菌菌饼的获得：于燕麦琼脂培养基上培养黑胫病菌，待病菌接近长满培养皿时，在菌落的边缘取直径0.5 cm的烟草黑胫病菌菌饼用于步骤f接种。步骤g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；共测量4次；

筛选结果如下表

表2 黑胫病不同抗性种质根系分泌物对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响（mm）

通过表2烟草黑胫病菌菌丝生长的直径得出，Florida301和革新3号为抗病种质。

实施例3、筛选方法如下

a、培育不同种质的烟苗；b、分别收集不同种质的根系分泌物浸提液；c、将收集好的根系分泌物浸提液定容至200 mL，然后取根系分泌物浸提液和乙酸乙酯各100 mL混入分液漏斗中萃取，合并萃取液；d、取萃取液有机相用旋转蒸发仪在40℃水浴下旋蒸浓缩至浸膏，随后用去离子水洗瓶定容至1 mL，无水硫酸钠除水，装入1.5 mL样品瓶中，获得根系分泌物萃取液，并用0.22 µm微孔膜过滤；e、将浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的孟加拉红培养基以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，于28℃恒温培养箱黑暗培养；g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；h、根据菌落直径大小鉴定抗性水平，从而鉴定获得抗病种质。

步骤e将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的孟加拉红培养基以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；孟加拉红培养基制备具体为：

蛋白胨5.0 g，孟加拉红0.033 g，葡萄糖10.0 g，氯霉素0.1 g，磷酸氢二钾1.0 g，琼脂20 g，硫酸镁（无水）0.5 g，水1000 mL。

筛选结果如下表

表3 黑胫病不同抗性种质根系分泌物对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响

通过表3烟草黑胫病菌菌丝生长的直径得出，Florida301和革新3号为抗病种质。

实施例4、筛选方法如下

a、培育不同种质的烟苗；b、分别收集不同种质的根系分泌物浸提液；c、将收集好的根系分泌物浸提液定容至200 mL，然后取根系分泌物浸提液和乙酸乙酯各100 mL混入分液漏斗中萃取，合并萃取液；d、取萃取液有机相用旋转蒸发仪在40℃水浴下旋蒸浓缩至浸膏，随后用去离子水洗瓶定容至1 mL，无水硫酸钠除水，装入1.5 mL样品瓶中，获得根系分泌物萃取液，并用0.22 µm微孔膜过滤；e、将浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的燕麦培养基以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，于28℃恒温培养箱黑暗培养；g、每24h十字交叉法测量菌落直径；h、根据菌落直径大小鉴定抗性水平，从而鉴定获得抗病种质。

步骤f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，进一步包括培养黑胫病菌菌饼的获得：于燕麦琼脂培养基上培养黑胫病菌，待病菌接近长满培养皿时，在菌落的边缘取直径0.5 cm的烟草黑胫病菌菌饼用于步骤f接种。步骤g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；共测量4次；

筛选结果如下表

表4 黑胫病不同抗性种质根系分泌物对烟草黑胫病菌菌丝生长的影响

通过表4 烟草黑胫病菌菌丝生长的直径得出，Florida301和革新3号为抗病种质。

烟草对黑胫病抗性的田间鉴定与本发明根系分泌物鉴定的比对：

一、田间常规鉴定试验

1.试验地点

试验在中国农业科学院烟草研究所试验田内进行。试验地为沙质壤土，肥力中等,排灌方便。田间设计采用顺序排列，3 次重复，4 行区，行长15 m，行距1.0 m，株距0.5 m。小区面积60 m²。测土施肥，每公顷施入烟草专用复合肥600 kg，硫酸钾187.5 kg, 硝酸钾37.5 kg, 重钙75 kg，硫酸锌22.5 kg，芝麻饼225 kg，N∶P∶K 为1∶1 .5∶3，移栽前一次施入。3月8日播种，5月3日移栽，栽后田间管理措施按优质烟要求进行。

诱发鉴定方法

7月1日, 烟株进入旺长期至开花现蕾期, 通过人工诱发补充接菌。首先人工制作菌谷，将谷子10 kg，用水煮熟，然后装入1000 mL的三角瓶中，湿热灭菌40 min，而后在超净工作台上，每个三角瓶中接种适量的黑胫病菌，而后于28℃恒温培养箱黑暗培养7-10 d，待整瓶长满病菌，将病菌谷取出，用于人工接种。按每株施用3 g，施于烟株的茎基部, 随时培土, 及时灌溉, 连灌3 次水，造成容易发病的条件，诱发黑胫病的发生。

3. 调查方法

人工补充接种后, 当各品种发病最重时进行黑胫病调查, 按分级标准逐株记载各烟株的病级数, 并计算各品种的病株率、病情指数, 然后以病情指数为主要依据，评价各品种的抗病能力。

4.病害分级标准(以整株为单位)

0 级: 全株无病;

1 级: 茎部病斑不超过茎围1/2, 或半数以下叶片轻度凋萎, 或下部少数叶片出现病斑；

2 级: 茎部病斑超过茎围的1/2, 或半数以上叶片调萎;

3 级: 茎部病斑环绕茎围, 或2/3 以上叶片凋萎;

4 级: 病株全部叶片凋萎或枯死。

5.病情指数计算

病情指数=Σ(各级病株数×该病级值)/调查总株数×最高级值×100

6.评价标准

高抗:病情指数0～5, 用HR 表示;

抗:病情指数5.01～25, 用R 表示;

中抗:病情指数25.01～50, 用MR 表示;

中感:病情指数50.01～75, 用MS 表示;

感:病情指数75 以上, 用HS 表示。

7. 12 个品种(系)对烟草黑胫病抗性鉴定结果

8. 鉴定所需时间：3月8日播种，5月3日移栽，7月1日人工接种，7月20日调查，7月27日再次调查，7月30日得出鉴定结果（如果遇到7月干旱的年份，不适合黑胫病的发生，就难以完成鉴定。

9.用工：所需试验田3.5亩，试验地需要整地、施肥、起垄，常年保持病圃内有黑胫病菌，不能种植其他作物，并且移栽时还需要大量的移栽用水，烟草田间移栽，及移栽后的田间管理都是重体力劳动。因此，从苗床播种到试验数据调查结束，直至最终收获采收烘烤需要1个大田工人工作7-8个月的时间。移栽与灌溉还需要增加劳动用工。还需要科研人员在实验室中制作菌谷(繁琐与耗时的过程)，逐株人工接种，然后培土（3.5亩地需要10人干1天）、田间大量灌水等繁琐工作。

二、根系分泌物试验室鉴定

3月8日播种，3月29日假植，4月29日移栽至小花盆中，5月20日进入实验室试验，6月3日能够鉴定结束。所用试剂费用，远低于3.5亩烟田的管理与菌谷制作费用。

与现有技术的比较实验，

背景技术中CN101671720A记载方法为组一，

背景技术中CN106665328A记载方法为组二，

背景技术中CN 104745672A记载方法为组三，

本发明的根系分泌物培养基进行筛选测定的方法为组四。

鉴定烟草对黑胫病菌抗性的4种方法比较表*

*注：表中费用与用地按照鉴定10份种质计算。

综上所述，本发明利用烟草根系分泌物，可以在实验室中完成烟草种质对黑胫病的抗性鉴定，比常规鉴定试验省略了栽培烟草的繁琐、耗时与费工。并且常规鉴定试验需要大面积带菌试验地（田间病圃），该发明比常规鉴定试验省略了田间病圃的设立,节省了人力、物力与时间。另外该发明使烟草种质对黑胫病的抗性鉴定不受生长季节的限制，任何季节都能开展鉴定工作；并且在短时间内可以完成大量种质资源的筛选，大量节省了鉴定时间，因为常规田间鉴定需要一个生长季节的时间。该种鉴定方法结果更准确，不会像田间鉴定，在自然条件下由于病害不发生，不能完成鉴定，为了创造田间发病的条件，进行人工接种，开展大面积的田间接种，接种体分布往往不均匀，从而出现接种强度不一致的现象，造成鉴定误差。采用此种方法与已知抗感品种在大田中对黑胫病的抗性表现一致。所以，本发明能利用烟草根系分泌物，在实验室中完成烟草种质对黑胫病的抗性鉴定，是一种快速、经济、方便、可靠的抗烟草黑胫病种质的鉴定方法。

Claims

1.一种实验室中筛选烟草抗黑胫病种质的方法，其特征在于，按照下列步骤操作：

a、培育不同种质的烟苗；

b、分别收集不同种质的根系分泌物浸提液；

e、将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的马铃薯培养基以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；

g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；

h、根据菌落直径大小鉴定抗性水平，从而鉴定获得抗病种质；

步骤e将灭菌浓缩的根系分泌物滤液与已灭菌并冷却至45℃的马铃薯培养基以1: 10比例混匀，然后倒入直径8.5 cm的培养皿中，静置冷却备用；马铃薯培养基制备具体为：马铃薯葡萄糖琼脂40.1 g ，加入到1000 mL蒸馏水中煮沸3 min左右，定容至1000 mL，121℃灭菌20 min；步骤f、于每个培养皿中心接种一个直径0.5 cm的黑胫病菌菌饼，进一步包括培养黑胫病菌菌饼的获得：于马铃薯培养基上培养黑胫病菌，待病菌接近长满培养皿时，在菌落的边缘取直径0.5 cm的烟草黑胫病菌菌饼用于步骤f接种；步骤g、每24 h十字交叉法测量菌落直径；共测量4次；

本方法需时：2个月，费用：0.6万元，准确率：98%以上，不易污染，不用地，实验室中完成。