CN112980717B - 一种固体芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固体芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法，涉及肥料技术领域，解决了现有技术中的固体芽孢杆菌微生物菌剂中有效活菌数不高的技术问题。本发明固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法包括如下步骤：将芽孢杆菌菌种接种到液体培养基中培养制得接种液；将接种液在灭菌液体培养基A的环境下进行一次发酵得到发酵液A；将发酵液A在灭菌液体培养基B的环境下进行二次发酵得到发酵液B；将发酵液B进行浓缩离心制得菌种浓缩液；将菌种浓缩液进行喷雾干燥制得芽孢杆菌菌粉，并且芽孢杆菌菌粉中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g。本发明制得的固体芽孢杆菌微生物菌剂中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g，相比于现有技术中的产品明显提高。

Description

一种固体芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及肥料技术领域，尤其涉及一种固体芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
随着农业的迅速发展，微生物功能菌剂在农业生产中的应用越来越广泛，其具有促进作物生长、防治作物上的病虫害、提高作物抗逆性、改良作物种植土壤环境、发酵腐熟有机物料等作用。在微生物菌剂使用过程中，有效菌含量是微生物菌剂的主要指标。然而，申请人发现，采用现有工艺制得的固体芽孢杆菌微生物菌剂存在微生物菌剂中有效活菌数不高的问题。
因此，对固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备工艺进行改良，以提升物生物菌剂中的有效活菌数成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的其中一个目的是提出一种固体芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法，解决了现有技术中的固体芽孢杆菌微生物菌剂中有效活菌数不高的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：
将芽孢杆菌菌种接种到液体培养基中培养制得接种液；
将接种液在灭菌液体培养基A的环境下进行一次发酵得到发酵液A；
将发酵液A在灭菌液体培养基B的环境下进行二次发酵得到发酵液B；
将发酵液B进行浓缩离心制得菌种浓缩液；
将菌种浓缩液进行喷雾干燥制得芽孢杆菌菌粉，并且所述芽孢杆菌菌粉中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g。
根据一个优选实施方式，所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌；其中，解淀粉芽孢杆菌，其编号为WSWFJ45，保藏登记号为CGMCC No.20148；枯草芽孢杆菌，其编号为WSWFJ34，保藏登记号为CGMCC No.20141；地衣芽孢杆菌，其编号为WSWFJ47，保藏登记号为CGMCC No.20149。
根据一个优选实施方式，将芽孢杆菌菌种接种到液体培养基中培养制得接种液包括如下过程：将准备好的芽孢杆菌菌种，按照3‰～5‰的比例接种到液体LB培养基中，在35℃～38℃条件下振荡培养24h后得到接种液，并使接种液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×108CFU/mL。
根据一个优选实施方式，将接种液在灭菌液体培养基A的环境下进行一次发酵得到发酵液A包括如下过程：将制备的接种液接种到发酵罐中，加入占发酵罐体积60％～70％的灭菌液体培养基A，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵17h～20h后得到发酵液A，并使发酵液A中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×108CFU/mL。
根据一个优选实施方式，所述液体培养基A包括如下重量份的组分：黄豆粉5g/L，玉米粉5g/L，蔗糖12g/L，蛋白胨10g/L，鱼粉7g/L，碳酸钙4g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸锰1g/L，硫酸铵1.2g/L。
根据一个优选实施方式，将发酵液A在灭菌液体培养基B的环境下进行二次发酵得到发酵液B包括如下过程：将发酵液A导入发酵罐中，加入占发酵罐体积60％～70％的灭菌液体培养基B，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵23～25h后得到发酵液B，并使发酵液B中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×109CFU/mL。
根据一个优选实施方式，所述液体培养基B包括如下重量份的组分：黄豆粉14g/L，玉米粉4g/L，蔗糖3g/L，蛋白胨2g/L，鱼粉2g/L，碳酸钙6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，氯化钠0.3g/L，硫酸铵0.5g/L，氢氧化钠0.25g/L。
根据一个优选实施方式，将发酵液B进行浓缩离心制得菌种浓缩液包括如下过程：将发酵液B导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液，得到菌种浓缩液，并使菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1010CFU/mL。
根据一个优选实施方式，将菌种浓缩液进行喷雾干燥制得芽孢杆菌菌粉包括如下过程：将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入10％～13％的辅料，通过0.9Pa的压力将所述菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g的芽孢杆菌微生物菌粉；其中，所述辅料包括如下重量份的组分：硅藻土55～65份，碳酸钙15～25份，淀粉15～25份。
本发明的固体芽孢杆菌微生物菌剂，是本发明任一技术方案所述的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法制得的。
本发明的固体芽孢杆菌微生物菌剂可通过蘸根、灌根、浇施和叶面喷施中的一种或多种方法向作物施用；或者是与肥料进行配伍制成生物肥料作为底肥施用；或者是作为发酵菌种用于有机废弃物发酵腐熟。
本发明的固体芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法至少具有如下有益技术效果：
本发明的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其是通过对芽孢杆菌菌种进行三级培养后制得固体芽孢杆菌微生物菌剂，进行三级培养可促使芽孢杆菌菌种产生大量芽孢，从而可有效保证微生物菌剂中芽孢杆菌的有效活菌数，保证菌种活性，进而得到高效微生物菌剂。具体的，本发明的制备方法制得的固体芽孢杆菌微生物菌剂中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g，相比于现有技术中的产品明显提高，解决了现有技术中的固体芽孢杆菌微生物菌剂中有效活菌数不高的技术问题。
此外，本发明优选技术方案还可以产生如下技术效果：
本发明优选技术方案的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，将芽孢杆菌菌种进行三级培养后得到的发酵液进行浓缩离心，再将浓缩离心后得到的菌种浓缩液进行喷雾干燥，使得制得的芽孢杆菌微生物菌粉的体积大大缩小，仅为原发酵液的2％，可以有效降低运输成本，同时可以降低农户在种植过程中的施用量，从而可降低农户使用成本，提高固体芽孢杆菌微生物菌剂的使用效益。
本发明优选技术方案的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，将浓缩离心后得到的菌种浓缩液进行喷雾干燥的过程中，使用的辅料包括硅藻土55～65份，碳酸钙15～25份，淀粉15～25份，该辅料可有效保护菌种芽孢，减少芽孢在喷雾干燥过程中的损耗。具体的，通过该辅料可提供固体载体吸附芽孢，减少干燥中因高温喷雾造成的内壁附着损耗。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面结合实施例1～实施例3对本发明的固体芽孢杆菌微生物菌剂及其制备方法进行详细说明。
实施例1
本实施例提供了一种高效固体解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂。高效固体解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂是通过如下步骤制得的：
步骤1：接种液制备。具体的，将准备好的解淀粉芽孢杆菌菌种，按照3‰的比例接种到1L的液体LB培养基中，在35℃条件下振荡培养24h后得到接种液，通过稀释平板法计数测定有效活菌数，直至接种液中的芽孢杆菌有效活菌数达1×108CFU/mL。
步骤2：发酵液扩繁。将制备的接种液接种到1000L的发酵罐中，加入占发酵罐体积60％的灭菌液体培养基A，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵17h后得到发酵液A，直至发酵液A中的芽孢杆菌有效活菌数达1×108CFU/mL。将发酵液A导入10000L的发酵罐中，加入占发酵罐体积60％的灭菌液体培养基B，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵23h后得到发酵液B，直至发酵液B中的芽孢杆菌有效活菌数达1×109CFU/mL。
步骤3：浓缩离心。将发酵液B导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液(即上清液，约占总发酵液体积的90％)，得到菌种浓缩液，菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数达1×1010CFU/mL。
步骤4：喷雾干燥。将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入10％的辅料，通过0.9Pa的压力将菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g的解淀粉芽孢杆菌菌粉。
本实施例的固体芽孢杆菌微生物菌剂的应用：将本实施例的解淀粉芽孢杆菌菌粉直接作为农用微生物菌剂产品，通过灌根应用在田间种植过程中。
本实施例步骤1中的解淀粉芽孢杆菌具有溶磷解钾促生长的功效。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其编号为WSWFJ45，保藏登记号为CGMCC No.20148，保藏日期：2020年06月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本实施例提供了一种高效固体枯草芽孢杆菌微生物菌剂。高效固体枯草芽孢杆菌微生物菌剂是通过如下步骤制得的：
步骤1：接种液制备。具体的，将准备好的枯草芽孢杆菌菌种，按照5‰的比例接种到1L的液体LB培养基中，在38℃条件下振荡培养24h后得到接种液，通过稀释平板法计数测定有效活菌数，直至接种液中的芽孢杆菌有效活菌数达1×108CFU/mL。
步骤2：发酵液扩繁。将制备的接种液接种到1000L的发酵罐中，加入占发酵罐体积70％的灭菌液体培养基A，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵20h后得到发酵液A，直至发酵液A中的芽孢杆菌有效活菌数达1×108CFU/mL。将发酵液A导入10000L的发酵罐中，加入占发酵罐体积70％的灭菌液体培养基B，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵25h后得到发酵液B，直至发酵液B中的芽孢杆菌有效活菌数达1×109CFU/mL。
步骤3：浓缩离心。将发酵液B导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液(即上清液，约占总发酵液体积的90％)，得到菌种浓缩液，菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数达1×1010CFU/mL。
步骤4：喷雾干燥。将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入13％的辅料，通过0.9Pa的压力将菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g的枯草芽孢杆菌菌粉。
本实施例的固体芽孢杆菌微生物菌剂的应用：将本实施例的枯草芽孢杆菌菌粉与有机肥料进行配伍制成生物有机肥作为底肥施用。
本实施例步骤1中的枯草芽孢杆菌具有防治茄科作物青枯病的功效。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其编号为WSWFJ34，保藏登记号为CGMCCNo.20141，保藏日期：2020年06月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例3
本实施例提供了一种高效固体地衣芽孢杆菌微生物菌剂。高效固体地衣芽孢杆菌微生物菌剂是通过如下步骤制得的：
步骤1：接种液制备。具体的，将准备好的地衣芽孢杆菌菌种，按照4‰的比例接种到1L的液体LB培养基中，在37℃条件下振荡培养24h后得到接种液，通过稀释平板法计数测定有效活菌数，直至接种液中的芽孢杆菌有效活菌数达1×108CFU/mL。
步骤2：发酵液扩繁。将制备的接种液接种到1000L的发酵罐中，加入占发酵罐体积65％的灭菌液体培养基A，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵18h后得到发酵液A，直至发酵液A中的芽孢杆菌有效活菌数达1×108CFU/mL。将发酵液A导入10000L的发酵罐中，加入占发酵罐体积65％的灭菌液体培养基B，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵24h后得到发酵液B，直至发酵液B中的芽孢杆菌有效活菌数达1×109CFU/mL。
步骤3：浓缩离心。将发酵液B导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液(即上清液，约占总发酵液体积的90％)，得到菌种浓缩液，菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数达1×1010CFU/mL。
步骤4：喷雾干燥。将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入12％的辅料，通过0.9Pa的压力将菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g的地衣芽孢杆菌菌粉。
本实施例的固体芽孢杆菌微生物菌剂的应用：将本实施例的地衣芽孢杆菌菌粉作为发酵菌种用于有机废弃物发酵腐熟。
本实施例步骤1中的地衣芽孢杆菌具有发酵腐熟的功效。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其编号为WSWFJ47，保藏登记号为CGMCC No.20149，保藏日期：2020年06月28日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1～实施例3产品的效果实验如下所述：
以实施例1的产品在生菜上的应用为例对实施例1的产品效果进行验证。
在生菜上使用实施例1的解淀粉芽孢杆菌菌粉，考察其对于生菜生育期、农艺性状、产量产值的影响，为扩大推广应用提供科学依据。
1、试验时间及地点
试验时间：2020年7月28日-2020年9月8日。
试验地点：保山市昌宁县温泉基地单元田园镇德禄寨。
2、材料与方法
2.1、供试土壤：田园鸡粪土，质地为壤土，肥效上等，排灌条件较好。
2.2、供试肥料：当地常规施用肥料、实施例1的解淀粉芽孢杆菌菌粉。
2.3、供试品种：意大利生菜。
2.4、试验方法
2.4.1、试验设设计：试验采用随机区组排列试验设计，布置4个处理，3次重复，每重复小区面积为一亩，种植密度为8000株/亩，具体处理如下：
处理1：常规施肥+解淀粉芽孢杆菌菌粉200倍液灌根；
处理2：常规施肥+灭菌解淀粉芽孢杆菌菌粉200倍液灌根；
处理3：常规施肥+等量清水灌根；
处理4：常规施肥。
2.4.2、施肥方法：①常规施肥：播种前，基肥以有机肥300kg/亩施入，要求翻地前撒施，随翻地进入土层；生长期内2次追肥，在发芽后17天、25天用当地的复混肥料以每亩25kg施入。②等量清水：在追肥时，用清水以50kg/亩的量进行灌根，共2次。③解淀粉芽孢杆菌菌粉：在追肥时，以0.25kg/亩(1∶200稀释)进行灌根，共2次。④灭菌解淀粉芽孢杆菌菌粉：经强放射性辐照如放射性同位素60Co灭菌后，以解淀粉芽孢杆菌菌粉的方法进行灌根。
注意事项：解淀粉芽孢杆菌菌粉由高效菌株组成，应避光保存，并现配现用，避免在雨天、烈日下施用，且灌根后三天内不可浇水过多，以免影响施用效果。
生菜从7月28日开始播种，9月8日采收完毕。在整个生育期间，各处理除解淀粉芽孢杆菌菌粉施用不同外，其余施用肥料种类、施用量、田间管理等都一致。
2.5、调查方法
2.5.1、生育期调查：观察记录生菜各阶段生育期。
2.5.2、农艺性状调查：于采收前3天，采用五点取样发，随机选取50株生菜进行农艺性状的检测，其指标为，株高、冠幅、叶片数、地上鲜重、地下鲜重。
2.5.3、产量、产值调查：在采收之后，测量每个处理各小区的亩产量，以当地价格进行产值的折算。
3、结果与分析
3.1、生育期调查
由表1可知，四个处理进入各阶段的时间无差异，从7月28日开始播种，发芽期为9天，幼苗期为13天，莲座期为17天，9月8日采收完毕，生育期为42天，说明施用解淀粉芽孢杆菌菌粉对生菜的生育期没有影响。
表1不同处理对生菜生育期的影响
处理 播种时间 发芽期 幼苗期 莲座期 采收时间 全生育期(天)
1 7.28 7.28-8.5 8.6-8.18 8.19-9.5 9.8 42
2 7.28 7.28-8.5 8.6-8.18 8.19-9.5 9.8 42
3 7.28 7.28-8.5 8.6-8.18 8.19-9.5 9.8 42
4 7.28 7.28-8.5 8.6-8.18 8.19-9.5 9.8 42
3.2农艺性状调查
由表2可知，处理1的株高、冠幅、叶片数、地上鲜重、地下鲜重分别为22.3cm、76.1cn、9.8、76g、8.5g，位于全部处理各指标数据之首，整体来看，使用处理1﹥处理2﹥处理3﹥处理4，说明施用解淀粉芽孢杆菌菌粉能促使生菜壮根健苗，提高生菜品质。
表2不同处理对生菜农艺性状的影响
处理 株高(cm) 冠幅(cm) 叶片数 地上鲜重(g) 地下鲜重(g)
1 22.3 76.1 9.8 76 8.5
2 21.6 74.8 9.4 68 8.1
3 21.3 72.8 9.2 63 8.1
4 21.1 72.8 9.2 61 7.9
3.3经济性状调查
由表3、表4可知，对比4个处理，处理1的平均产值为2916.08kg，较处理2、3、4分别增加59.92kg、142.05kg、192.23kg，以2.00元/kg的均价折算，处理1亩产值达5824.62元，较对照组处理4增加376.92元；经过产量差异多重比较，发现处理1与处理2、3、4之间有明显差异，呈现显著水平。
表3不同处理对生菜经济性状的影响
Figure BDA0002857587360000101
表4处理间产量差异显著性多重比较
处理 平均产量(kg) 5％显著性 1％显著性
1 2916.08 a A
2 2856.16 b B
3 2774.03 c C
4 2723.85 d C
4、总结
综上可知，处理1﹥处理2﹥处理3﹥处理4，则在常规施肥的基础上增施实施例1的解淀粉芽孢杆菌菌粉对生菜具有一定的壮根健苗效果，可提高生菜的品质及产量，增加每亩产值，促进农业经济的发展，可大规模推广使用。
以实施例2的产品在预防烟草青枯病上的应用为例对实施例2的产品效果进行验证。
以烟草为研究作物，将实施例2的枯草芽孢杆菌菌粉用于烟草的种植，考察其对于烟株青枯病发生情况的影响，为形成烟草青枯病生物防治新模式提供科学依据。
1.1、材料与方法
1.1.1、试验地点：云南省微生物发酵工程研究中心有限公司试验大棚。
1.1.2、试验材料
供试作物：烟草，品种为云烟97。
供试肥料：有机肥，复合肥料(N-P2O5-K2O＝15-5-25)。
供试药剂：实施例2的枯草芽孢杆菌菌粉。
试验设5个处理，每个处理种植60株盆栽，试验处理如下所示：
处理1：常规有机肥对照；
处理2：生物有机肥(常规有机肥+1％枯草芽孢杆菌菌粉)；
处理3：生物有机肥(常规有机肥+2％枯草芽孢杆菌菌粉)；
处理4：生物有机肥(常规有机肥+3％枯草芽孢杆菌菌粉)；
处理5：生物有机肥(常规有机肥+4％枯草芽孢杆菌菌粉)；
烟株移栽前每个盆栽中中层环45.45g有机肥或生物有机肥及45.45g复合肥料(N-P2O5-K2O＝15-5-25)，移栽成活后每个盆栽中灌入50ml青枯病病原培养液，每个处理除有机肥菌含量不同以外，其他管理措施均保持一致。
1.1.3、调查的数据及方法
在移栽后50天后，待青枯病情基本稳定后，调查每个处理青枯病发病情况调查。分别记录各处理的各级病株数，计算各处理的发病率、病情指数及防效。
(1)青枯病调查分组标准：
0级：全株无病；
1级：茎部偶有褪绿斑，或在有条斑一侧有少数叶片凋萎；
2级：茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧半数以上叶片凋萎；
3级：茎部黑色条斑到达植物顶部，或病侧三分之二以上叶片凋萎；
4级：病株基本枯死。
(2)病株率(％)＝发病株数/调查总株数×100。
(3)病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级)×100。
(4)防效(％)＝(清水对照区病情指数－处理区病情指数)/清水对照区病情指数×100。
1.2、结果与分析
1.2.1、枯草芽孢杆菌菌粉对烟草青枯病发病情况影响。
由表5烟草青枯病发病情况调查表可以看出，各处理的发病率及病情指数均低于处理1(常规有机肥)，说明枯草芽孢杆菌菌粉与有机肥料相配伍，能有效防治烟草青枯病，降低病害造成的损失；在不同处理中，枯草芽孢杆菌菌粉施用量越大，青枯病防效越高，说明随着枯草芽孢杆菌菌粉使用量的增加，青枯病防治效果提升。
表5烟草青枯病发病情况调查表
处理 发病率％ 病情指数 防效％
处理1 26.67％ 24.17 —
处理2 15.00％ 11.67 51.72％
处理3 11.67％ 7.50 68.97％
处理4 5.00％ 4.17 82.76％
处理5 1.67％ 1.67 93.10％
1.3、结论与讨论
本次试验以烟草为研究作物，将枯草芽孢杆菌菌粉与有机肥料相配伍，制成生物有机肥，开展不同枯草芽孢杆菌菌粉施用量盆栽生防试验，通过跟踪调查烟株的青枯病发生情况，探究烟草青枯病的生物防控技术。根据枯草芽孢杆菌菌粉对烟草青枯病发病情况影响可以看出，枯草芽孢杆菌菌粉能防治烟草青枯病，降低烟草青枯病的危害；随着枯草芽孢杆菌菌粉使用量的增加，青枯病防治效果提升。
以实施例3的产品在腐解油菜秸秆上的应用为例对实施例3的产品效果进行验证。
以油菜秸秆为研究作物，将实施例3的地衣芽孢杆菌菌粉用于腐熟油菜秸秆，考察其作为有机物料腐熟剂在油菜秸秆上的腐熟效果，为作为扩大推广应用和办理有关肥料登记证提供科学依据。
1、试验时间和地点
试验时间：2019年10月13日—2019年12月18日。
试验地点：曲靖市罗平县大水井乡小鸡登村委会下孔也自然村承包地进行，面积3亩，海拔1386m，年平均气温15.1℃，年平均降雨量为1744mm，年相对湿度82％。试验地平整，土质为壤土，肥力中等，前作烤烟，无灌溉条件，距县城18km，交通方便。
2、材料与方法
2.1、供试腐熟剂：实施例3的地衣芽孢杆菌菌粉。
2.2、供试物料：油菜秸秆。
2.3、试验设计：试验以不施腐熟菌剂、施用灭菌腐熟菌、施用腐熟菌三个处理为主，不设重复，每小区面积为1亩。具体处理如下：
处理1：油菜秸秆在常温条件下腐解；
处理2：油菜秸秆+灭菌的地衣芽孢杆菌菌粉在常温条件下腐解；
处理3：油菜秸秆+地衣芽孢杆菌菌粉在常温条件下腐解。
注意：灭菌的地衣芽孢杆菌菌粉需经强放射性辐照如放射性同位素60Co进行彻底灭菌。
2.4试验过程
2.4.1、秸秆还田：采用秸秆粉碎翻压还田的方法进行试验，各小区以每亩2000公斤的油菜秸秆进行粉碎，平铺在田块表面，将60kg腐熟剂(或灭菌腐熟剂)较均匀地撒在平铺秸秆上，湿度控制在50％～60％，之后将秸秆翻入土壤耕作层5cm处进行腐熟。
对照组除不添加腐熟剂外其余步骤与施用腐熟菌剂的处理相同。
2.4.2、取样装袋：每处理用18个30cm×50cm的网袋装入处理好的物料，厚度为2cm，随翻土一起插入5cm耕作层中，呈一字形埋入，埋入之前称出每一袋的重量。
2.5、调查方法
2.5.1、外观检测：每重复采用五点取样法，在第10天(10月25日)、20天(11月5日)、30天(11月15日)、40天(11月25日)、50天(12月5日)、60天(12月15日)时进行物料腐熟的外观检测，统计时需对秸秆的颜色、手摸秸秆的软化程度、秸秆的气味进行定性比较，分别为三个指标定制级别，综合三个指标级别数之和，数值越大的表示该处理的秸秆腐烂越快，腐熟作用越明显。
秸秆颜色定级：中黄、微黄、褐黄、黑黄，分别为1、2、3、4级；
手感软化程度定级：硬、微软、软、腐烂，分别为1、2、3、4级；
秸秆气味定级：霉味、氨味、酒味、腐烂味，分别为1、2、3、4级。
2.5.2、腐熟度检测：在第10天(10月25日)、20天(11月5日)、30天(11月15日)、40天(11月25日)、50天(12月5日)、60天(12月15日)随机抽出3个网装样品检测其重量，计算出失重率。
公式：失重率＝(初始重量－调查时重量)/初始重量×100％
3、结果与分析
3.1物料腐熟外观检测
由表6～8可知，通过不同时间段综合级值的对比，发现处理3的数值≥处理2的数值≥处理1的数值，处理3在10d、20d、30d、40d、50d、60d的综合级值分别为5、7、9、9、10、12，在腐熟60d时，处理3的物料呈黑黄色，手感腐烂，具有腐烂味，表示使用有机物料腐熟剂处理油菜秸秆具有腐熟早、腐熟快、腐解度高的特点。
表6处理1对油菜秸秆还田定性腐熟度的影响
Figure BDA0002857587360000141
Figure BDA0002857587360000151
表7处理2对油菜秸秆还田定性腐熟度的影响
Figure BDA0002857587360000152
表8处理3对油菜秸秆还田定性腐熟度的影响
Figure BDA0002857587360000153
3.2、腐熟程度检测
由表9可知，在不同时间段中，处理3的失重率相较于处理1、处理2的失重率数值较大，表明使用有机物料腐熟剂能有效腐熟油菜秸秆，在10d、20d、30d、40d、50d、60d时的始终率平均分别为19.3％、27.4％、31.9％、37.4％、44.7％、51.7％；再由表10可知，对各处理不同时期的失重率进行差异性分析，发现三个处理间存在差异性，处理1在5％的显著性、1％的显著性下呈现极显著水平。
表9不同处理对油菜秸秆腐熟程度的检测
Figure BDA0002857587360000161
Figure BDA0002857587360000171
表10不同处理间各时间节点腐熟程度显著性分析
Figure BDA0002857587360000172
Figure BDA0002857587360000181
4、总结
由上述结果可知，使用实施例3的地衣芽孢杆菌菌粉作为有机物料腐熟剂处理油菜秸秆，能够用加快腐熟时间，在相同时间下，较施用灭菌地衣芽孢杆菌菌粉的处理和不使用地衣芽孢杆菌菌粉的处理，未灭菌的地衣芽孢杆菌菌粉腐熟度更加彻底，腐解程度较高，可推广使用。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将芽孢杆菌菌种接种到液体培养基中培养制得接种液；
将接种液在灭菌液体培养基A的环境下进行一次发酵得到发酵液A；
将发酵液A在灭菌液体培养基B的环境下进行二次发酵得到发酵液B；
将发酵液B进行浓缩离心制得菌种浓缩液；
将菌种浓缩液进行喷雾干燥制得芽孢杆菌菌粉，并且所述芽孢杆菌菌粉中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g；
将菌种浓缩液进行喷雾干燥制得芽孢杆菌菌粉包括如下过程：
将菌种浓缩液加入搅拌罐中，加入10％～13％的辅料，通过0.9Pa的压力将所述菌种浓缩液压至旋转喷头，并使喷头保持在转速为20000r/min下喷雾，同时在干燥塔中通入150℃、4000m3/h的热风进行干燥，经过喷雾干燥后制得芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1011CFU/g的芽孢杆菌微生物菌粉；
其中，所述辅料包括如下重量份的组分：硅藻土55～65份，碳酸钙15～25份，淀粉15～25份；
所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌；其中，
解淀粉芽孢杆菌，其编号为WSWFJ45，保藏登记号为CGMCC No.20148；
枯草芽孢杆菌，其编号为WSWFJ34，保藏登记号为CGMCC No.20141；
地衣芽孢杆菌，其编号为WSWFJ47，保藏登记号为CGMCC No.20149。
2.根据权利要求1所述的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将芽孢杆菌菌种接种到液体培养基中培养制得接种液包括如下过程：
将准备好的芽孢杆菌菌种，按照3‰～5‰的比例接种到液体LB培养基中，在35℃～38℃条件下振荡培养24h后得到接种液，并使接种液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×108CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将接种液在灭菌液体培养基A的环境下进行一次发酵得到发酵液A包括如下过程：
将制备的接种液接种到发酵罐中，加入占发酵罐体积60％～70％的灭菌液体培养基A，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵17h～20h后得到发酵液A，并使发酵液A中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×108CFU/mL。
4.根据权利要求3所述的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体培养基A包括如下重量份的组分：黄豆粉5g/L，玉米粉5g/L，蔗糖12g/L，蛋白胨10g/L，鱼粉7g/L，碳酸钙4g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸锰1g/L，硫酸铵1.2g/L。
5.根据权利要求1所述的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将发酵液A在灭菌液体培养基B的环境下进行二次发酵得到发酵液B包括如下过程：
将发酵液A导入发酵罐中，加入占发酵罐体积60％～70％的灭菌液体培养基B，保持罐内温度37℃，供氧气量15m3/h，发酵23～25h后得到发酵液B，并使发酵液B中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×109CFU/mL。
6.根据权利要求5所述的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体培养基B包括如下重量份的组分：黄豆粉14g/L，玉米粉4g/L，蔗糖3g/L，蛋白胨2g/L，鱼粉2g/L，碳酸钙6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸锰0.2g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，氯化钠0.3g/L，硫酸铵0.5g/L，氢氧化钠0.25g/L。
7.根据权利要求1所述的固体芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于，将发酵液B进行浓缩离心制得菌种浓缩液包括如下过程：
将发酵液B导入碟式离心机中，在转速6000r/min下离心15min，离心后排除上层菌悬液，得到菌种浓缩液，并使菌种浓缩液中的芽孢杆菌有效活菌数不小于1×1010CFU/mL。
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