CN112391316B - 用于防治烟草白粉病的菌株及其发酵方法、用于防治烟草白粉病的复配剂 - Google Patents

用于防治烟草白粉病的菌株及其发酵方法、用于防治烟草白粉病的复配剂 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于防治烟草白粉病的菌株及其发酵方法、用于防治烟草白粉病的复配剂，菌株为菌株WSWFJ45；所述菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，其保藏登记号为：CGMCC No.20148。该菌株应用于农业生产过程中，可以对烟草白粉病进行有效防控。将菌株繁殖材料与中低毒化学农药复配后，能有效减少化学农药的用量，农药用量仅为其正常用量的一半，能够在很大程度上减少低毒化学农药的使用，减少环境污染，提高作物安全性，同时经过检测该复配剂的防治效果优于单纯使用化学农药。可以对烟草白粉病进行有效防控，能够在很大程度上减少化学农药的施用量，减少环境污染，提高作物安全性。

Description

用于防治烟草白粉病的菌株及其发酵方法、用于防治烟草白 粉病的复配剂
技术领域
本申请涉及一种用于防治烟草白粉病的菌株及其发酵方法、用于防治烟草白粉病的复配剂，属于生物防治技术领域。
背景技术
烟草(学名：Nicotiana tabacum)属于茄科，一年生草本植物，目前，中国种植烟草面积为世界最大。
草白粉病俗称"上灰"、"下霜"、"上硝"。该病多为害于烟草的成熟老叶，感染后症状由下向上发展。其发病率通常达到100％，叶片发病时，初为近圆形的黄褐色小斑，之后斑上现白色粉状小点，使病斑呈毯状，斑块扩大，白粉布满整个叶片，病叶先褪绿变褐后枯死。严重时为害嫩茎，病茎上也布满白粉。病叶烘烤后薄如纸，色暗锈褐色，丧失经济价值。中国各烟区均有发生，危害也较重。除为害烟草外，还可为害葫芦科、菊科等植物。
目前在白粉病防治方面，主要防治手段为大量使用化学农药，如三唑酮、粉唑醇等化学农药，使用后能在烟草上对白粉病产生一定的防治效果。但随着化学农药的长期使用，农药残留及环境污染问题愈发严重。
如何在保持对白粉病防治效果的前提下，减少化学农药用量，一直无法得到较好的解决。
发明内容
本申请提供了一种用于防治烟草白粉病的菌株及其发酵方法、用于防治烟草白粉病的复配剂，用于解决现有技术中存在的烟草白粉病防治需使用大量化学农药，导致环境污染，烟叶农残超标的技术问题。
本申请提供了一种用于防治烟草白粉病的菌株，所述菌株为菌株 WSWFJ45；所述菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，其保藏登记号为：CGMCC No.20148。
该菌株繁殖后的发酵液或其他增殖产品，应用于农业生产过程中，可以对烟草白粉病进行有效防治，能够在很大程度上减少化学农药的施用量，减少环境污染，提高作物安全性。能在减少化学农药使用量的情况下保证对烟叶白粉病的有效防治效果，甚至优于单独使用化学农药的防治效果。
云南省微生物发酵工程研究中心有限公司经对微生物进行特异性筛选，从其菌种库中筛选得到菌株WSWFJ45。
优选地，所述菌株在LB培养基上的菌落为白色近圆形菌落，菌落在培养前期表面褶皱凸起，后期表面较为平整，凸起较小，菌落不透明。
由该菌株繁殖后的菌落形态便于对该菌株的种类进行归属，该菌落形态属于解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
本申请的另一方面还提供了一种用于防治烟草白粉病的复配剂，包括：如上述的菌株的发酵液、低毒化学农药和助剂，低毒化学农药稀释后与混有助剂的发酵液混合后，得到所述复配剂；
低毒化学农药的用量为该农药正常用量减半；
发酵液按使用倍数稀释后加入。
该菌株WSWFJ45能与低毒化学农药减半后复配得到复配剂，将其应用于农业生产过程中，可以对烟草白粉病进行有效防控，能够在很大程度上减少化学农药的施用量，减少环境污染，提高作物安全性。采用该复配剂对白粉病的防治效果优于单独使用低毒化学农药的防治效果，同时通过减少化学农药的用量，能减少农药残留和农药对环境造成的污染。在达到防治白粉病的同时，保护环境。
本申请中的“低毒化学农药”是指将现有农药用量减半并稀释后所得的农药原液含量较低的化学农药试剂。例如包括但不限于15％三唑酮可湿性粉剂、10％宁南霉素可湿性粉剂或70％甲基硫菌灵可湿性粉剂。
本申请中低毒化学农药的用量是指其使用说明中指明用量的一半。
优选地，所述低毒化学农药为15％三唑酮可湿性粉剂、10％宁南霉素可湿性粉剂或70％甲基硫菌灵可湿性粉剂；即其中任一种。
更优选地，所述低毒化学农药为70wt.％的甲基硫菌灵可湿性粉剂。采用菌剂时，复配得到的复配剂对白粉病的防治效果最优。
优选地，所述菌株WSWFJ45的发酵液中有效活菌数在2.0×108cfu/g以上。采用该活菌浓度的发酵液作为原料稀释后进行复配能保证复配剂对白粉病的有效防治。
优选地，所述助剂为润湿助剂，例如为吐温20，所述助剂的加入量为菌株WSWFJ45发酵液质量的千分之一。
通过加入润湿助剂能有效增加施药时，复配液与叶面的浸润速度，加快复配剂发挥效果。按此比例添加后，能提高发酵液与低毒化学农药的混合均匀效率。
本申请的另一方面还提供了一种如上述的用于防治烟草白粉病的菌株的发酵方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：在LB固体培养基上活化12～16h，得到活化菌株；
2)种子液制备：将活化菌株接种至LB液体培养基中，在30～40℃下，并在转速为150～170rpm/min条件下培养20～30h，得种子液；
3)发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1：100～150的比例将种子液接种至发酵料培养基中，在35℃～38℃条件下，转速为100～140rpm/min 条件下培养25～30h，得所述菌株的发酵液。
采用上述发酵方法，能缩短发酵时间，提高发酵后发酵液中活菌含量。
更优选地，该发酵方法包括以下步骤：
步骤一，菌种活化，将-80℃下保存的枯草芽孢杆菌菌株在LB固体培养基上活化12～16h，得活化的菌株；
步骤二，种子液制备，用无菌接种环刮取一环步骤一中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm/min条件下培养24h，得种子液；
步骤三，发酵液制备，按照菌种、培养液体积比为1：120的比例将步骤二所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃—37.5℃条件下，转速为120rpm/min条件下培养25-30h，得发酵液，即为解淀粉芽孢杆菌菌液；菌液的有效活菌数均控制在2.0×108cfu/g以上。
采用上述条件进行发酵，发酵后所得发酵液用于防治白粉病时，防治效果最优。
优选地，LB固体培养基由：细菌学蛋白胨8～12g/L、酵母提取粉3～7g/L、氯化钠8～12g/L、水1L、琼脂粉22～26g组成；
采用该配方制得固体培养基能有利于该菌株恢复繁殖活性。
优选地，所述LB液体培养基由细菌学蛋白胨8～12g/L、酵母提取粉 3～7g/L、氯化钠8～12g/L、水1L组成。
更优选地，所述LB固体培养基由：细菌学蛋白胨10g/L，酵母提取粉 5g/L，氯化钠10g/L，水1L、琼脂粉15g组成；
更优选地，所述LB液体培养基由细菌学蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠10g/L，水1L组成。
优选地，所述发酵料培养基由黄豆粉1.0～1.6重量份、蔗糖0.1～0.5重量份、蛋白胨0.2～0.6重量份、玉米粉0.2～0.6重量份、碳酸钙0.3～0.9重量份、鱼粉0.1～0.3重量份、硫酸铵0.01～0.08重量份、硫酸镁0.02～0.05重量份、磷酸二氢钾0.01～0.04重量份、磷酸氢二钾0.02～0.05重量份、硫酸锰0.01～0.04 重量份、氢氧化钠0.01～0.04重量份、氯化钠0.02～0.03重量份、消泡剂0.5～1.5 重量份组成，并根据配置所得培养基的pH值用盐酸或氢氧化钠调节所述发酵料培养基的PH至6.8～7.5。
本申请的另一方面还提供了一种复配剂施用方法，包括以下步骤：将如上述的用于防治烟草白粉病的复配剂喷雾施用于烟叶叶片正反两面。
按此施用能充分发挥该复配剂的防止效果，减少白粉病的发生几率。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的用于防治烟草白粉病的复配剂，云南省微生物发酵工程研究中心有限公司经对微生物进行特异性筛选，筛选出菌株 WSWFJ45能与低毒化学农药复配后使用，菌株WSWFJ45的保藏登记号为：CGMCC No.20148，该菌株应用于农业生产过程中，可以对烟草白粉病进行有效防控。
2)本申请所提供的用于防治烟草白粉病的复配剂，将菌株繁殖材料与中低毒化学农药复配后，能有效减少化学农药的用量，农药用量仅为其正常用量的一半，能够在很大程度上减少低毒化学农药的使用，减少环境污染，提高作物安全性，同时经过检测该复配剂的防治效果优于单纯使用化学农药。可以对烟草白粉病进行有效防控，能够在很大程度上减少化学农药的施用量，减少环境污染，提高作物安全性。
3)本申请所提供的用于防治烟草白粉病的复配剂，该复配剂在云南省曲靖市宣威市得禄乡烟草白粉病的防治上取得较好的防治效果，采用本发明提供的解淀粉芽孢杆菌WSWFJ45发酵液与低毒化学农药用量减半互配对烟草白粉病进行防控，连续喷施3-5次后具有相对于化学农药较好的防治效果，能有效防治烟草白粉病，提升烟草品质，降低化学农药残留、减少环境污染等问题。
生物保藏证明
用于防治烟草白粉病的菌株为菌株WSWFJ45，建议的分类命名：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，该菌株于2020年06月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏登记号为：CGMCCNo.20148。
附图说明
图1为本申请提供的实施例6中解淀粉芽孢杆菌WSWFJ45发酵液液与低毒化学农药互配实验中各低毒性化学农药与菌株WSWFJ45发酵液复配后的培养结果照片；其中：a)为15％三唑酮可湿性粉剂板的实验结果；b) 为10％宁南霉素可湿性粉剂板的实验结果；c)为70％甲基硫菌灵可湿性粉剂板的实验结果；d)为CK板实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
实施例
如无特别说明，本申请的实施例中的溶剂和助剂均通过商业途径购买，不进行处理。
实施例1解淀粉芽孢杆菌WSWFJ45
解淀粉芽孢杆菌WSWFJ45，其保藏登记号为CGMCC No.20148。从云南省微生物发酵工程研究中心有限公司菌种库中筛选得到的生防菌株。
菌株WSWFJ45形态特征：在LB培养基上白色色近圆形菌落，前期表面褶皱凸起，后期表面较为平整，凸起较小，菌落不透明。鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
实施例2～4解淀粉芽孢杆菌WSWFJ45发酵液样品F1～3制备
菌株WSWFJ45发酵液的制备包括以下步骤：
(1)菌种活化：将在-80℃下保存的解淀粉芽孢杆菌WSWFJ45在LB 固体培养基上活化12h，得活化菌株。
(2)种子液制备：用无菌接种环刮取一环步骤(1)中活化的菌株接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm/min条件下培养24h，得种子液。
(3)发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1：120左右的比例将步骤(2)所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为35℃(可上下浮动0.5℃)，转速为120rpm/min条件下培养28h，得发酵液，即为具有防治烟草白粉病功能的解淀粉芽孢杆菌发酵液，菌液的有效活菌数均控制在2.0×108cfu/g以上。
LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g/L，酵母提取粉5g/L，氯化钠10g/L，水1L，即得液体培养基；在以上物质中再加入琼脂粉24g/L即得固体培养基。
发酵培养基组成为：黄豆粉1.4％、蔗糖0.4％、蛋白胨0.5％、玉米粉0.4％、碳酸钙0.6％、鱼粉0.2％、硫酸铵0.05％、硫酸镁0.04％、磷酸二氢钾0.03％、磷酸氢二钾0.04％、硫酸锰0.03％、氢氧化钠0.03％、氯化钠0.02％、消泡剂 1.0％，根据配置所得培养基的pH值选用盐酸或氢氧化钠调节pH至7。
实施例3～4与实施例2的区别如下表所示，其他未述内容与实施例2相同：
表1 菌株发酵工艺及配方
Figure BDA0002790159730000061
Figure BDA0002790159730000071
实施例5配置复配剂样品P1
复配剂样品P1包括以下组分：解淀粉芽孢杆菌WSWFJ45发酵液样品 F1、润湿助剂吐温20、低毒化学农药70％的甲基硫菌灵可湿性粉剂混合。
润湿助剂吐温20的用量为所得复配剂样品P1质量的千分之一。
复配剂样品P1的制备方法：
1)将发酵液样品F1加水稀释1000倍后润湿助剂吐温20，混合均匀备用；
2)再将70wt.％的甲基硫菌灵可湿性粉剂按说明书指示使用量减少一半剂量后，加水稀释1000倍后备用；
3)将步骤1)～2)中配置好的溶液转入大容器中搅拌均匀后，得到所述复配剂样品P1。
发酵液样品F2～3制成复配剂的方法于此相同，在此不累述。
实施例6解淀粉芽孢杆菌WSWFJ45发酵液与低毒化学农药互配实验
1、材料与方法
1.1、材料
杀菌剂：15％三唑酮可湿性粉剂、10％宁南霉素可湿性粉剂、70％甲基硫菌灵可湿性粉剂；
生防菌剂WSWFJ45。
1.2、方法
1.2.1、将配制好的LB培养基，溶解琼脂后，分装到三角瓶中，每瓶100 毫升。灭菌后冷却至60℃左右，按杀菌剂说明用量称量好，倒入三角瓶里，充分摇匀，溶解；另1个三角瓶作为无杀菌剂的空白对照。每三角瓶倒板4 个(每皿25毫升)，做好各药剂编号(培养皿外边壁)，在超净工作台上风干至无自由水。
1.2.2、配置生防菌。提前一天，在LB液体培养基中培养生防菌剂 WSWFJ45，置于35℃摇床中培养24小时。取已灭菌的三角瓶空瓶，加入10 毫升灭菌水，从培养好的生防菌液三角瓶中，取生防菌液10微升放入加了灭菌水三角瓶中，充分混合后再稀释100倍，取最后稀释倍数的菌液20微升加入到带有低毒化学农药的培养基平板中及未加农药的空白对照板，涂布均匀。
1.2.3、计数调查抑制率。培养24小时后，统计各个平板中的菌落数。
根据下述公式计算其抑制率。
Figure BDA0002790159730000091
2.结果分析
所得结果如表2 所示。
表2 生防菌剂与低毒化学农药互配平板筛选结果
Figure BDA0002790159730000092
注：上述数据均为4次重复的均值，“-”表示无抑制作用。
从表2 中看出，生防菌剂WSWFJ45在含有低毒化学农药70％的甲基硫菌灵可湿性粉剂板上的抑制率为8.63％，在含有15％的三唑酮的培养基板上抑制率为88.83％，在10％的宁南霉素板上抑制率为100％。该菌剂与70％的甲基硫菌灵可湿性粉剂复配后，能较好的保持原菌株的生存率。
由表2 结果可见，本申请提供的枯草芽孢杆菌WSWFJ45可以在含有以上3种低毒性化学农药的培养基表面生存，说明该菌株对低毒化学农药具有一定耐受性，与低毒性化学农药混合后不会影响该菌株的生长。
表2 中对应结果如图1所示。由图中可见，该菌株主要能在70％的甲基硫菌灵可湿性粉剂环境下生长。
实施例7复配剂样品P1的田间施用实验
1、目的：为验证生防菌剂WSWFJ45与低毒化学农药70％甲基硫菌灵减半后互配在田间防治烟草白粉病的效果，特开展以下试验。
1.地点：云南省微生物发酵工程研究中心有限公司温室大棚、云南省曲靖市宣威市得禄乡。
1.试验处理及调查方法
3.1.试验喷施处理：采用18L电动喷雾器，以喷施叶片润湿为度进行处理。试验设置以下4个处理分别为：
a.70％甲基硫菌灵剂量减半(1600倍)+生防菌剂WSWFJ45(稀释100 倍)；
b.全量70％甲基硫菌灵(800倍)；
c.生防菌剂WSWFJ45(50倍)；
d.空白对照。上述每个处理重复3次。
施用方法：间隔3天喷施1次，连续喷施3次。
3.2、调查方法
处理前及处理结束后3、7、10天进行病害调查，按照烟草白粉病病害严重度分级标准调查所有叶片(每个重复10株)，并做好记录。分级标准为：
0级：无病斑
1级：病斑面积占叶片面积的5％以下。
3级：病斑面积占叶片面积的6％～10％。
5级：病斑面积占叶片面积的11％～20％。
7级：病斑面积占叶片面积的21％～40％。
9级：病斑面积占叶片面积的41％以上。
按照上述调查处理前后的病害严重程度，计算其病情指数及防治效果。
公式如下：
Figure BDA0002790159730000101
Figure BDA0002790159730000102
4.0结果
4.1.云南省微生物发酵工程研究中心有限公司温室大棚烟草白粉病统计防效结果
该试验点所得结果列于表3 中。
表3 烟草白粉病生防菌剂与低毒化学农药互配使用防效统计结果(温室大棚)
Figure BDA0002790159730000111
注：上述处理均为三次重复的平均值，“/”表示无防效作用。
从表3 中可以看出，单独喷施生防菌剂及农药均有一定的防治效果，分别为78.41％、73.61％，但将其用量分别减半后混合处理，其防效明显高于单独喷施处理，防效达到87.07％。因此，生防菌剂与农药互配使用能在温室大棚中有效防治白粉病。
4.2.云南省曲靖市宣威市得禄乡烟草白粉病统计防效结果
该试验点所得结果如表4 所示。
表4 烟草白粉病生防菌剂与低毒化学农药互配使用防效统计结果(得禄乡)
Figure BDA0002790159730000112
注：上述处理均为三次重复的平均值，“/”表示无防效作用。
从表4 中可以看出：单独喷施生防菌剂与低毒化学农药在烟草白粉病的防治上均有一定的作用，其防治效果分别为70.89％、79.28％。而利用生防菌剂与低毒化学农药互配使用喷施后，其防治效果达到83.06％，说明互配使用有增效的作用。能达到预期防治效果。
在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”、“优选实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本申请的范围内。
尽管这里参照本申请的多个解释性实施例对本申请进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开说明书和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims (9)

1.一种用于防治烟草白粉病的菌株，其特征在于，所述菌株为菌株WSWFJ45；所述菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），其保藏登记号为：CGMCC No.20148。
2.一种用于防治烟草白粉病的复配剂，其特征在于，包括：如权利要求1所述的菌株的发酵液、低毒化学农药和助剂，低毒化学农药稀释后与混有助剂的发酵液混合后，得到所述复配剂；
低毒化学农药的用量为该农药正常用量减半；
发酵液按使用倍数稀释后加入；
所述低毒化学农药为70%甲基硫菌灵可湿性粉剂。
3.根据权利要求2所述的复配剂，其特征在于，所述菌株WSWFJ45的发酵液中有效活菌数在2.0×108cfu/g以上。
4.根据权利要求2所述的复配剂，其特征在于，所述助剂为润湿助剂；所述助剂的加入量为菌株WSWFJ45发酵液质量的千分之一。
5.一种如权利要求1所述的用于防治烟草白粉病的菌株的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）菌种活化：在LB固体培养基上活化12~16h，得到活化菌株；
2）种子液制备：将活化菌株接种至LB液体培养基中，在30~40℃下，并在转速为150~170rpm/min条件下培养20~30h，得种子液；
3）发酵液制备：按照菌种、培养液体积比为1：100~150的比例将种子液接种至发酵料培养基中，在35℃~38℃条件下，转速为100~140rpm/min条件下培养25~30h，得所述菌株的发酵液。
6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述LB固体培养基由：细菌学蛋白胨8~12g/L、酵母提取粉3~7g/L、氯化钠8~12g/L、水1L、琼脂粉22~26g组成。
7.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述LB液体培养基由细菌学蛋白胨8~12g/L、酵母提取粉3~7g/L、氯化钠8~12g/L、水1L组成。
8.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵料培养基由黄豆粉1.0~1.6重量份、蔗糖0.1~0.5重量份、蛋白胨0.2~0.6重量份、玉米粉0.2~0.6重量份、碳酸钙0.3~0.9重量份、鱼粉0.1~0.3重量份、硫酸铵0.01~0.08重量份、硫酸镁0.02~0.05重量份、磷酸二氢钾0.01~0.04重量份、磷酸氢二钾0.02~0.05重量份、硫酸锰0.01~0.04重量份、氢氧化钠0.01~0.04重量份、氯化钠0.02~0.03重量份、消泡剂0.5~1.5重量份组成，并根据配置所得培养基的pH值用盐酸或氢氧化钠调节所述发酵料培养基的PH至6.8~7.5。
9.一种复配剂施用方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求2~3中任一项所述的用于防治烟草白粉病的复配剂喷雾施用于烟叶叶片正反两面。
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