CN116355809B - 一株暹罗芽孢杆菌bb653菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种暹罗芽孢杆菌BB653菌株及其应用，所述菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，生物保藏号：GDMCC NO:63320。本发明的暹罗芽孢杆菌BB653菌株可以用于防治作物青枯病，对作物青枯病具有较好的防治效果，同时，本发明的菌株暹罗芽孢杆菌BB653菌株对番茄等植株的生长具有促进作用，具有重要的生防应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农业生物防治技术领域，尤其涉及的是一种暹罗芽孢杆菌BB653菌株及其在防治作物青枯病上的应用。
背景技术
由青枯菌复合种（Ralstonia solanacearum species complex，RSSC）侵染引起的作物青枯病是一种世界性的重大病害。RSSC能够侵染50多科的450多种植物，尤其严重为害番茄、马铃薯、茄子、烟草等茄科作物并造成严重的经济损失。引起广东省作物青枯病的优势菌株为RSSC演化型I，即假茄科雷尔氏菌（青枯菌），存在13、14、15、17、18、34、44、57等8个序列变种，不同序列变种对相同的作物品种致病性不同。近年来，青枯菌种群致病性的演变加速，新序列变种和强致病力菌株不断出现，导致作物品种抗性逐渐丧失，市场上缺乏有效的防治药剂，防控技术研发不足，生产上因青枯病导致的减产或绝收现象十分普遍，给生产者造成巨大的经济损失。
目前作物青枯病的防治主要还是依赖化学农药，然而防效好的药剂选择并不多，农户往往几种杀菌剂混合使用，在病害发生高峰几乎每周都要喷施一次化学农药，造成大量的财力物力浪费和环境污染，而且化学农药的长期、大量使用容易引起抗药性风风险。因此，为应对因防治作物青枯病而导致的化学农药污染，需找合适的生物防治方法成为防治作物青枯病的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种暹罗芽孢杆菌BB653菌株及其在防治作物青枯病上的应用，该方法对作物青枯病有较好的防效。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种暹罗芽孢杆菌，命名为暹罗芽孢杆菌BB653，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏日期：2023年4月3日；生物保藏号：GDMCC NO:63320。
本发明的暹罗芽孢杆菌BB653为革兰氏阳性菌，呈杆状在LB固体培养基上30℃培养24h后，菌落形状呈圆形或不规则形状，乳白色，不透明，中间凸起，有褶皱，边缘凹陷，湿润；将菌液按1%接种量接种至LB液体培养基中，30℃静置培养24h后上层有菌膜形成，菌株细胞经革兰氏染色后呈蓝色。
本发明的暹罗芽孢杆菌BB653在50℃下、pH4.0-9.0下、NaCl 1%-14%下均能生长，能使明胶液化和淀粉水解，氧化酶、过氧化氢酶、硝酸盐还原和V-P反应均为阳性，丙二酸盐利用、吲哚产生、柠檬酸盐利用、甲基红试验和脲酶反应均为阴性；可以利用D-葡萄糖、D-木糖、D-核糖、D-纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、山梨醇、棉子糖；不利用D-半乳糖、D-阿拉伯糖醇、L-鼠李糖、D-海藻糖、D-阿拉伯糖、甜醇和赤藓醇。
本发明的另一目的在于提供所述暹罗芽孢杆菌BB653用于抑制植物青枯病。
优选的，作为一个较佳的实施方式，本发明的暹罗芽孢杆菌BB653对假茄科雷尔氏菌8个序列变种菌株均具有较好的抑制作用。
出人意料的，本发明的暹罗芽孢杆菌BB653菌株对作物有促进生长的作用。
优选的，作为一个较佳的实施方式，本发明的暹罗芽孢杆菌BB653菌株对番茄植株具有促生能力，所述促生能力表现为促进番茄株高、根长、鲜重、茎粗和根重点增加。
本发明的另一目的还在于提供一种暹罗芽孢杆菌BB653菌株用于制备作物青枯病的生物制剂中的应用。
本发明的另一目的还在于提供一种暹罗芽孢杆菌BB653菌株的使用方法，所述使用方法为灌根接种法，暹罗芽孢杆菌BB653菌株浓度为1×108cfu/mL，灌根后土壤中菌落含量终浓度为1×108cfu/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的暹罗芽孢杆菌BB653菌株对假茄科雷尔氏菌不同菌株均有较好抑菌作用，抑菌圈直径分别为1.14-1.94 cm。且本发明的暹罗芽孢杆菌BB653具有促进植物生长的作用，暹罗芽孢杆菌BB653菌株对番茄青枯病和辣椒青枯病的防效分别为63.98%和65.33%。
附图说明
图1示出了菌株筛选中对青枯病菌的抑制作用；
图2示出了菌株BB653对不同序列变种青枯菌株抑菌活性测定结果；
图3示出了菌株BB653对番茄植株的促生效果；
图4示出了菌株BB653对番茄青枯病的防治效果；
图5示出了菌株BB653对辣椒青枯病的防治效果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。下面具体的实施方式对本发明作进一步的描述。
如无特殊说明，本发明实施例所使用的试剂和材料均可以通过市售手段购买的得到。
1、菌株的分离
（1）样本采集：在湛江市雷州九龙山红树林国家湿地公园采集的红树林叶片，装袋保存，带回实验室进行菌株分离。
（2）菌株分离：取红树林叶片，经75%酒精浸泡5 min，5%次氯酸钠溶液浸泡5 min表面消毒后，用灭菌ddH2O漂洗3次，置于灭菌研钵中研磨至糊状后，静置0.5 h，待细菌充分溢出后按照10-3、10-4、10-5梯度稀释进行涂板。分别吸取10-3、10-4、10-5土壤菌悬液150μL，用灭菌玻璃珠均匀涂布在15 cm LB、高氏1号、假单胞菌分离琼脂培养基平板上，晾干后于30℃培养箱倒置培养1-3 d，获得单菌落。
2、菌株的筛选
LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，氯化钠10 g，去离子水1000 mL，pH7.0-7.2。
假茄科雷尔氏菌培养基（TTC培养基）：蛋白胨10 g，干酪素裂解物1 g，葡萄糖5 g，去离子水1000 mL，pH 7.0。
以上培养基均为液体培养基，在此基础上按1.5%（w/v）的量加入琼脂粉，则制成固体培养基。
将TTC培养基加热熔化，冷却至约40℃左右时，按照1%TTC指示剂750 μL、青枯菌RS550菌液500 μL的比例依次加入到150 mL培养基（青枯菌终浓度约5×106CFU/mL），后立即倒平板，待培养基凝固后按一定间隔紧贴5 mm灭菌滤纸片至培养基上，置于超净台中晾干备用。
（1）初筛：分离纯化获得的单菌落点接至每个装有10 μL灭菌ddH2O的96孔板中，制成细菌悬液；分别吸取5μL细菌悬液缓慢加到15 cm平板中滤纸片上（每个平板中60-80片滤纸片，每个滤纸片上所加细菌悬液为不同的单菌落），晾干后于30℃培养箱倒置培养36-48h；将菌落周围出现明显透明抑菌圈且抑菌圈直径在1.0 cm以上的细菌接种至液体培养基中，并拍照记录（图1），30℃160 r/min振荡培养，后用50%甘油保存于-80℃冰箱中备用。
（2）复筛：将经过初筛对番茄青枯菌有抑菌效果的菌株进行活化，挑取单菌落于LB培养基中振荡培养，获得细菌菌液；吸取5μL细菌菌液缓慢加到9 cm平板中滤纸片上，每个平板中3片滤纸片，每个滤纸片上所加细菌悬液相同，为同一个单菌落，即1株菌株，3次重复；晾干后于30℃培养箱倒置培养36-48 h；利用十字交叉法测量并记录抑菌圈直径大小，并拍照记录（图1）。选取抑菌圈直径的拮抗菌。
3、菌株BB653的鉴定和保存
3.1 菌株BB653的鉴定
3.3.1形态鉴定
菌株BB653为革兰氏阳性菌，呈杆状在LB固体培养基上30℃培养24h后，菌落形状呈圆形或不规则形状，乳白色，不透明，中间凸起，有褶皱，边缘凹陷，湿润。将菌液按1%接种量接种至LB液体培养基中，30℃静置培养24h后上层有菌膜形成。菌株细胞经革兰氏染色后呈蓝色。
3.3.2生理生化特征
在50℃下、pH4.0-9.0下、NaCl 1%-14%下均能生长，能使明胶液化和淀粉水解，氧化酶、过氧化氢酶、硝酸盐还原和V-P反应均为阳性，丙二酸盐利用、吲哚产生、柠檬酸盐利用、甲基红试验和脲酶反应均为阴性；可以利用D-葡萄糖、D-木糖、D-核糖、D-纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、山梨醇、棉子糖；不利用D-半乳糖、D-阿拉伯糖醇、L-鼠李糖、D-海藻糖、D-阿拉伯糖、甜醇和赤藓醇。
3.3.3 分子鉴定
利用gyrA、16S rDNA、gyrB、fusA和parC 5个基因特异引物，PCR分别扩增出菌株BB653的目的条带，分别对目的片段回收、克隆及测序，结果显示，BB653和BB653的5个基因gyrA、16S rDNA、gyrB、fusA和parC片段大小分别为2460bp、1510 bp、1917 bp、2079 bp和2424 bp。序列在NCBI登录号分别为OQ476218、OQ472335、OQ476220、OQ476216和OQ476222。用MEGA X软件构建系统发育树，菌株BB653与模式菌株暹罗芽孢杆菌KCTC 13613聚类在同一个分支。结合形态学、生理生化特征和分子鉴定，菌株BB653为暹罗芽孢杆菌。
二、菌株BB653抑菌能力测定
活化BB653菌株以及青枯菌菌株RS129、RS180、RS397、RS404、GMI1000、ssf-4、TS-2、SG-2、RS58、SM-GZZC-127、BY-2、GY-2、RS196、RS208和RS210，30℃培养青枯菌2 d、生防菌培养1 d后，挑单菌落到5 mL LB 中，30℃160 r/min揺培获得菌液待用。以青枯菌菌株为指示菌制作含菌的9 cm平板，每个平板中3片滤纸片，吸取5μL BB653菌液缓慢加到9 cm平板中滤纸片上，3次重复；晾干后于30℃培养箱倒置培养36-48 h；利用十字交叉法测量并记录抑菌圈直径大小（表1），并拍照记录（图2）。
由表1和图2可知，BB653对不同寄主来源的青枯菌菌株均具有一定的抑菌活性。BB653对8个序列变种的16株青枯菌株抑菌效果存在差异，其中对8株番茄青枯菌株分属6个序列变种的抑菌圈直径大小分别为1.66-2.88cm；对3株茄子青枯菌株分属3个序列变种的抑菌圈直径大小分别为1.72-2.36cm；对3株辣椒青枯菌株分属3个序列变种的的抑菌圈直径大小分别为2.02-2.43cm；对2株烟草青枯菌株分属2个序列变种的的抑菌圈直径大小分别为1.91cm和2.82cm。
三、菌株BB653对植株的促生能力
1、番茄苗准备
播种新星101番茄种子至泡沫育苗穴盘，待番茄苗在2叶期末移栽至10 cm×12 cm种植杯中，1株/杯，长至4叶期时备用。
2、菌株BB653菌液的制备
从-80℃冰箱取出菌株BB653，活化并于30℃倒置培养1 d后，挑单菌落接种至5 mLLB 液体培养基中，30℃160 r/min揺培12 h，获得种子液；将该种子液按1%接种量接种至含150 mL LB液体培养基三角瓶中，放大培养24 h，用ddH2O将获得的发酵液调至浓度1.0×108CFU/mL。
3、接种及调查
4叶期番茄苗分别灌根接种BB653发酵液50 mL，浓度为1.0×108 CFU/mL。每个处理15株番茄苗，3次重复，设阴性（清水）对照。随机排列于25℃培养室中，光周期12 h/12 h。接种15d后测量番茄植株株高、根长、茎粗、根重和鲜重，拍照记录（图3），并计算促生效果（GPE%）（表2）。
由表2和图3可知，经BB653处理15 d后，番茄植株株高达到31.52 cm，阴性对照番茄植株株高为26.69 cm，BB653对番茄植株株高的促生效果达到18.08%；番茄植株鲜重达到9.43 g，阴性对照番茄植株鲜重为5.60 g，BB653对番茄植株鲜重的促生效果达到68.56%；番茄植株茎粗达到4.19 mm，阴性对照番茄植株茎粗为3.78 mm，BB653对番茄茎粗的促生效果达到10.76%。与对照相比，BB653对番茄植株株高、鲜重和茎粗促生效果显著，BB653对番茄植株株高和鲜重促生效果显著。此外，BB653对番茄植株的根长和根重都有一定的促生效果，但促生效果不显著。
四、菌株BB653对番茄青枯病的防治
1、番茄苗准备
播种新星101番茄种子至泡沫育苗穴盘，待番茄苗在2叶期末移栽至10 cm×12 cm种植杯中，1株/杯，长至4叶期时备用。
2、菌株BB653菌液的制备
从-80℃冰箱取出菌株BB653，活化并于30℃倒置培养1 d后，挑单菌落接种至5 mLLB 液体培养基中，30℃160 r/min揺培12 h，获得种子液；将该种子液按1%接种量接种至含150 mL LB液体培养基三角瓶中，放大培养24 h，用ddH2O将获得的发酵液调至浓度1.0×108 CFU/mL。
3、青枯菌发酵液制备
活化菌株RS550，30℃倒置培养36-48 h后用接种环挑取单菌落划斜面，30℃培养24 h后点接至TTC液体培养基中，30℃ 160 r/min揺培24 h获得发酵液后用ddH2O将发酵液调至浓度1.0×107 CFU/mL。
4、接种及调查
4叶期番茄苗分别灌根接种BB653发酵液50 mL（终浓度1×108 CFU/mL），5 d后分别灌根接种青枯菌发酵液50 mL（终浓度1×107 CFU/mL）。每个处理30株番茄苗，3次重复，设阳性（只接种RS550）对照。各处理随机摆放，温网室温度23.1-37.4℃，湿度42.1-88.2%，观察发病情况并记录发病等级，计算病情指数和防效。
番茄发病的分级标准进行划分：0级：无萎蔫症状；1级：1%-25%叶片出现萎蔫症状；2级：26%-50%叶片出现萎蔫症状；3级：51%-75%叶片出现萎蔫症状；4级：76%-100%叶片萎蔫。
病情指数=100×∑（各处理病级植株数×相应病级）/各处理总植株数×最高病级。
防治效果=100%×（阳性对照处理病情指数-实验处理病情指数）/阳性对照处理病情指数
在接种青枯菌菌株RS550后7 d，只接种青枯菌处理的病情指数达到44.72，而接种生防菌BB653后再接种青枯菌处理的病情指数分别为16.11，防治效果达到63.98%（表3，图4）。
五、菌株BB653对了辣椒青枯病防效
1、辣椒苗准备
播种汇丰1号辣椒种子至泡沫育苗穴盘，待辣椒苗在2叶期末移栽至10 cm×12 cm种植杯中，1株/杯，长至4叶期时备用。
2、菌株BB653菌液的制备
从-80℃冰箱取出菌株BB653，活化并于30℃倒置培养1 d后，挑单菌落接种至5 mLLB 液体培养基中，30℃160 r/min揺培12 h，获得种子液；将该种子液按1%接种量接种至含150 mL LB液体培养基三角瓶中，放大培养24 h，用ddH2O将获得的发酵液调至浓度1.0×108CFU/mL。
3、青枯菌发酵液制备
活化菌株RS550，30℃倒置培养36-48 h后用接种环挑取单菌落划斜面，30℃培养24 h后点接至TTC液体培养基中，30℃ 160 r/min揺培24 h获得发酵液后用ddH2O将发酵液调至浓度1.0×107 CFU/mL。
4、接种及调查
4叶期辣椒苗分别灌根接种BB653发酵液50 mL（终浓度1×108 CFU/mL），5 d后分别灌根接种青枯菌发酵液50 mL（终浓度1×107 CFU/mL）。每个处理30株辣椒苗，3次重复，设阳性（只接种RS550）对照。各处理随机摆放，温网室温度23.1-37.4℃，湿度42.1-88.2%，观察发病情况并记录发病等级，计算病情指数和防效。
辣椒发病的分级标准进行划分：0级：无萎蔫症状；1级：1%-25%叶片出现萎蔫症状；2级：26%-50%叶片出现萎蔫症状；3级：51%-75%叶片出现萎蔫症状；4级：76%-100%叶片萎蔫。
病情指数=100×∑（各处理病级植株数×相应病级）/各处理总植株数×最高病级。
防治效果=100%×（阳性对照处理病情指数-实验处理病情指数）/阳性对照处理病情指数
在接种青枯菌菌株RS550后7 d，只接种青枯菌处理的病情指数达到44.64，而接种生防菌BB653后再接种青枯菌处理的病情指数分别为15.48，防治效果达到65.33%（表4，图5）。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其他方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种暹罗芽孢杆菌BB653的应用，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌BB653保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏日期：2023年4月3日；生物保藏号：CGMCC NO:63320；所述应用为抑制番茄、辣椒青枯病，且可以促进番茄、辣椒的生长。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌BB653的使用方法为灌根接种法。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌BB653菌株浓度为1×108cfu/mL。
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