CN115927047A - 一种种子促生微生物试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种种子促生微生物试剂及其制备方法，该微生物试剂中含有JC‑3jx菌株，该菌株为金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌。经过验证发现，JC‑3jx菌株不仅对多种植物病原真菌均表现出不同程度的抑制作用，对大豆疫霉的抑制率达到50％，而且其发酵上清液对供试的3种病原细菌也表现出明显的抑制活性，其中对革兰氏阴性的大肠杆菌抑制活性最好。同时，促生结果显示，含有JC‑3jx菌株的微生物试剂对玉米种子生根和绿豆发芽有良好的促进作用，体现了非常好的抑菌促生潜力。

Description

一种种子促生微生物试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物试剂的技术领域，具体涉及一种种子促生微生物试剂及其制备方法。

背景技术

内生菌是指整个生活周期或生活史的部分阶段能够生活在宿主植物组织内，且它们的存在并未使植物组织的表型特征和功能有明显改变的菌类，主要包括内生真菌、内生细菌、内生放线菌。近年来，关于植物内生菌对提高植物次级代谢产物、促进植物生长以及增强植物抗逆性等方面作用的研究已广泛开展。

在我国传统医学中，石斛属多种植物的新鲜或干燥茎被收做药用，具有极高的药用价值，如铁皮石斛、霍山石斛、金钗石斛等。金钗石斛作为石斛属重要的成员，已列入中国药典，其内生菌种类丰富，数量众多，为研究微生物提供了较多的资源。金钗石斛内生菌是获得天然抗菌活性物质及开发绿色菌肥的又一重要资源。相对石斛内生真菌而言，石斛内生细菌资源的研宄较少。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种种子促生微生物试剂，含有的JC-3jx菌株对种子生根和发芽有良好的促进作用，体现了非常好的抑菌促生潜力；本发明的目的之二在于提供一种种子促生微生物试剂的制备方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种种子促生微生物试剂，所述微生物试剂含有金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae JC-3jx)，命名为JC-3jx菌株，保藏号为GDMCC No:62384，保藏日期为2022年4月14日，保藏分类命名为皮尔瑞娥类芽孢杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

进一步，所述JC-3jx菌株的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

再进一步，所述微生物试剂中接种金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌的悬液浓度为1.6×10⁴～1.6×10⁶CFU/mL。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

上述的种子促生微生物试剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述JC-3jx菌株进行斜面活化培养，再进行摇瓶种子扩大培养，再转入发酵罐培养，喷雾干燥后，得到种子促生微生物菌剂。

进一步，所述斜面活化培养的具体步骤为：采用NA培养基斜面培养进行活化，接种甘油菌至NA培养基斜面，进行培养后，得到F1代斜面，随后取F1代斜面转接至另一NA斜面培养基，培养后得到活化后的F2代斜面。

再进一步，所述摇瓶种子扩大培养的具体步骤为：将活化培养的斜面菌种加入生理盐水洗脱制备菌悬液，转接于含有种子培养基的摇瓶中，振动混合，再进行培养12h。

具体地，所述种子培养基包括葡萄糖、玉米淀粉、豆粕粉、酵母膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸锰、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和水，调pH值为6.5～7.0，高压灭菌后制得。

进一步，所述发酵罐培养是将摇瓶培养好的种子液接种发酵罐；在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为200～250mL/min，搅拌控制为250～350rpm，温度控制在30-37℃，初始葡萄糖的浓度控制在20～30g/L；前12h控制体系的pH为6.5～7.0，控制溶解氧为25～45％，12h以后pH和溶氧不作限定。

再进一步，发酵周期控制在36h以内，停止发酵，将发酵液升温至60℃并维持一段时间，然后再加入麦芽糊精和氯化钙保护剂，混匀后进行喷雾干燥，喷雾塔的入口温度为160～180℃，出口温度为82～85℃，即得到活菌数＞1×1012CFU/g的种子促生微生物试剂。

具体地，所述发酵罐中的液体培养基包括豆粕粉、麸皮、麦芽糖浆、可溶性淀粉、L-谷氨酸钠、MgSO₄·7H₂O、KCl、KH₂PO₄、FeSO₄、MnSO₄和轻质碳酸钙，调节初始的pH为6.8～7.0，灭菌后得到液体培养基。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明的种子促生微生物试剂中含有JC-3jx菌株，该菌株为金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌。经过验证发现，JC-3jx菌株不仅对多种植物病原真菌均表现出不同程度的抑制作用，对大豆疫霉的抑制率达到50％，而且其发酵上清液对供试的3种病原细菌也表现出明显的抑制活性，其中对革兰氏阴性的大肠杆菌抑制活性最好。同时，促生结果显示，含有JC-3jx菌株的微生物试剂对玉米种子生根和绿豆发芽有良好的促进作用，体现了非常好的抑菌促生潜力。

附图说明

图1为不同浓度的微生物试剂对玉米的促生示意图；

图2为特定浓度的微生物试剂对绿豆的促生示意图；

图3为部分单菌落分离的培养示意图；

图4为不同菌落与指示菌的对峙培养的示意图；

图5为JC-3jx菌落的培养示意图；

图6为JC-3jx菌落的显微镜图；

图7为PCR扩增菌株JC-3jx菌株的电泳结果图；

图8为JC-3jx菌株基于16S rDNA序列的系统进化树；

图9为JC-3jx菌株对拟盘多毛孢霉的平板对峙图；

图10为JC-3jx菌株对尖孢镰刀菌的平板对峙图；

图11为JC-3jx菌株对辣椒疫霉的平板对峙图；

图12为JC-3jx菌株对大豆疫霉的平板对峙图；

图13为JC-3jx菌株对茄链格孢菌的平板对峙图；

图14为JC-3jx菌株发酵上清液对不同病原细菌的抑菌活性。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

本实施例的种子促生微生物试剂含有金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌，命名为JC-3jx菌株，保藏号为GDMCC No:62384，保藏日期为2022年4月14日，保藏分类命名为枯草芽孢杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。其中，所述JC-3jx菌株的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

种子促生微生物试剂的制备方法，包括以下步骤：菌株的斜面活化培养，摇瓶种子扩大培养，发酵罐培养，喷雾干燥，即得到种子促生微生物菌剂。

具体地，所述斜面活化培养是采用NA培养基斜面培养进行活化，接种甘油菌至NA培养基斜面(18×180mm试管斜面)，于30℃培养箱中培养2天，此即为F1代斜面，随后取F1代斜面再次转接至另一NA斜面培养基，30℃培养1天，此即为活化后的F2代斜面。

所述摇瓶种子扩大培养是指将活化培养的斜面菌种，通过5ml无菌生理盐水洗脱制备菌悬液，此时的菌落数约为1×10⁸CFU/mL，转接于含种子培养基摇瓶中，于恒温振荡培养器中，200r/min，30℃培养12h，使得菌落数提高至＞1×10⁹CFU/mL，达到菌株种子扩大培养的目的。

其中，种子培养基包括：葡萄糖5.0g，玉米淀粉10.0g，豆粕粉15.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，硫酸锰0.1g，磷酸二氢钾0.25g、磷酸氢二钾0.55、加自来水1000mL，调pH值为7.0,121℃高压灭菌15min。

所述发酵罐培养是采用摇瓶培养好的种子液接种发酵罐，接种量为10％。在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为230mL/min，搅拌控制为300rpm，温度控制在35℃，初始葡萄糖的浓度控制在250g/L。前12h通过流加20％的氨水溶液控制pH在6.5，控制溶解氧(DO)为30％，12h以后pH和溶氧自然。发酵周期控制在36h以内，停止发酵，将发酵液升温至60℃维持30min，然后再加入20％的麦芽糊精和1％氯化钙保护剂，混匀后进行喷雾干燥，喷雾塔的入口温度为170℃，出口温度为83℃。即得到活菌数＞1×10¹²CFU/g的种子促生微生物菌剂。

其中，发酵罐中的液体培养基包括以下按体积百分比计的原料：豆粕粉4.5％，麸皮2.0％，麦芽糖浆0.5％，可溶性淀粉0.5％，L-谷氨酸钠0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，KCl0.05％，KH₂PO₄ 0.1％，FeSO4 0.015％，MnSO₄ 0.02％，轻质碳酸钙0.6％，用20％氨水调初始pH为6.8-7.0，121℃灭菌20min。

微生物试剂的促生测试

一、玉米种子发芽试验

试验方法：用75％(体积分数)乙醇溶液处理玉米种子2min，用无菌水洗2遍，无菌条件下晾干。采用所选菌株和空白对照进行对比试验：取50粒已消毒的玉米种子转至含有无菌滤纸的方形皿中，每皿接入5ml稀释浓度分别为10^-2、10^-4、10^-6的菌悬液，设置无菌过滤水做对照，在25℃生化培养箱中培养7d，每天浇水适量(每皿的水量相同)，7d后观察种子在不同菌浓下的生根与出芽情况。

设置三个实验组，即分别施用浓度为1.6×10⁸CFU/mL、1.6×10⁶CFU/mL、1.6×10⁴CFU/mL的JC-3jx菌悬液。以及一个CK组(不施用JC-3jx菌悬液)。图1的标注为：A:对照组；B：菌悬液浓度为1.6×10⁸CFU/mL；C：菌悬液浓度为1.6×10⁶CFU/mL；D：菌悬液浓度为1.6×10⁴CFU/mL。

试验结果：具体结果如图1，同CK组相比，施用浓度为1.6×10⁸CFU/mL、1.6×10⁶CFU/mL、1.6×10⁴CFU/mL的JC-3jx菌悬液的玉米根系明显，根长显著增加，分支更多，其中接种菌悬液浓度为1.6×10⁶、1.6×10⁴CFU/mL的玉米株高明显较高，接种菌悬液浓度为1.6×10⁸CFU/mL的玉米株高较矮。对比最明显的是CK组和接种菌悬液浓度为1.6×10⁴CFU/mL的两组。由此可见，接种三种不同浓度菌液对玉米都有促生作用，菌浓并非越高越好，适当稀释能更好促进玉米种子根的伸长及分支。

二、绿豆发芽试验

试验方法：挑选大小均匀的绿豆适量，清洗干净，采用菌株JC-3jx菌悬液和空白对照进行对比试验：取两个培养皿，底物放置灭菌滤纸，绿豆分别用稀释后的菌悬液及无菌过滤水浸泡，在25℃生化培养箱中培养3天，每天浇水适量(每皿的水量相同)，观察绿豆的出芽情况。图2的标注为：A：对照组B：菌悬液浓度为1.6×10⁴CFU/mL。

试验结果：如图2所示，JC-3jx菌株对绿豆发芽的促生情况与玉米类似，加入浓度为1.6×10⁴CFU/mL菌悬液的绿豆能够较对照组提早出芽，而且与CK组相比，发芽芽长明显。

所述微生物试剂中接种金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌的悬液浓度为1.6×10⁴～1.6×10⁶CFU/mL。

一种金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌的培养方法，包括以下步骤：

1)金钗石斛内生细菌的分离：

①在泉州市博森隆农场石斛种植基地采集健康金钗石斛，用自来水冲洗金钗石斛植株表面2小时，滤纸吸干后，分别取根、茎、叶2g，依次用体积分数75％乙醇(根3min、茎2min)、质量体积分数0.1％HgCl₂(叶，1min)，然后使用灭菌生理盐水清洗三次，将最后一次清洗下来的灭菌生理盐水均匀涂抹在NA培养基的平板上，作为表面消毒效果的对照。NA培养基：蔗糖15g，蛋白胨5g，牛肉膏3g，酵母粉1g，琼脂粉20g，蒸馏水1L，pH值7.0–7.2。

②将清洗好的石斛组织，用解剖刀在培养皿中，根切成1cm左右小段，弃去两头，取中间部分，2-3根/皿，茎需用无菌刀片切成0.5cm左右的薄片，弃去两头，选取中间部分，均匀放置3-4片/皿，并放置于30℃恒温培养箱中培养。

③待平板上长出相应的细菌后，如图3所示，进一步用平板划线法连续3-5次进行纯化；

2)抑菌对峙筛选：多次划线纯化共分离出10株内生细菌，以拟盘多毛孢菌为指示菌，将划线分离的单菌落分别点植于对峙平板，30℃，对峙培养5-7天，其中，如图4所示，编号JC-3jx的菌株能够对指示菌形成明显的对峙弧线，将其进行斜面纯培养后，25％甘油洗脱制备菌悬液，保存于-70℃，备用；

3)形态学特征检测：根据步骤2)的筛选结果，选择编号JC-3jx菌株在PDA培养基平板培养24h，如图5所示，菌落呈白色至淡黄色，不透明，圆形，表面光滑、无明显褶皱、稍凸起，边缘整齐，如图6所示，显微镜下观察革兰氏染色结果为紫色，菌体为直杆状，偶见芽孢，可知JC-3jx为G⁺；PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水1L，pH自然。

4)分子鉴定：将JC-3jx菌株接种至含有3mL的LB培养基的试管中；LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1L，pH值7.0-7.2。30℃，200r/min振荡培养过夜。菌液12000r/min离心5min后，去上清，并按照试剂盒说明书进行细菌基因组DNA的提取。并以基因组DNA为模板，进行16S rDNA基因的扩增，如图7所示，电泳结果显示有明显目的大小的条带，琼脂糖凝胶电泳检测并回收目标片段，并送交上海生工进行测序。

将所测序列在NCBI数据库中进行BLAST分析，并构建如图8所示的系统发育进化树；其中，细菌16S rDNA序列PCR扩增特异引物分别为27F和1492R；27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，SEQ ID NO:2；

1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，SEQ ID NO:3；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

测序结果在NCBI网站进行BLAST分析，并选择13条相似性较高的同源序列，2条芽孢杆菌属序列，以及相似度较低的大肠杆菌序列进行系统发育分析。采用邻位相连算法(Neighbor-Joining method)获得分支系统树，并通过自举分析(bootstrap)进行置信度检测，自展数据集为1000次。用MEGA 4.0构建系统进化树。

由图8所示，JC-3jx菌株与类芽孢杆菌属(Paenibacillus)遗传距离最近，聚类为一支，与芽孢杆菌属(Bacillus)也有一定的亲缘关系，但进化距离较远。其中同源性最高的为Paenibacillus peoriae，相似度最高达到99.67％。综合形态学特征和基于16S rDNA的系统发育分析，基本可以确定JC-3jx菌株为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的皮尔瑞娥类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)。同时将菌株JC-3jx保藏于广东省微生物菌种保藏中心(www.gdmcc.net)，保藏编号为：GDMCC62384，相关16S rDNA序列已提交NCBI的基因数据库，并获得Genbank登录号：OM914713。

5)采用平板对峙法和琼脂扩散法检测分离菌株的抑菌活性：

其中，供试病原真菌：拟盘多毛孢菌、大豆疫霉、辣椒疫霉LT1534、尖孢镰刀菌、茄链格孢菌，由福建省农业科学院植物保护研究所赠予。

供试病原细菌：大肠杆菌CICC 10003、金黄色葡萄球菌ATCC25923，产气荚膜梭菌ATCC13124，由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心保存并提供。

①平板对峙法

将供试真菌接种于无菌的PDA平板培养基上，待菌落长满整个培养皿后，用无菌的4mm直径的打孔器在菌落边缘切去大小为4mm的圆形菌饼，放于4℃保存待使用。

在无菌分装的PDA平板中心，划一条直线，距离直线中间点15mm处，点一个点。对照组：在该点接种前述病原真菌菌饼；试验组：在该点处接种病原真菌，同时在平皿划线部位分别划线接种与之对峙的内生细菌。30℃恒温培养5-7天，观察对照组与试验组的病原真菌生长情况。测量菌块及真菌直径，计算抑菌率。抑菌率＝(对照组真菌半径R-实验组真菌半径R)/(对照组真菌半径R-菌块半径)×100％。对供试的5种病原真菌的抑制效果如表1。

表1 JC-3jx菌株对不同病原真菌的抑制活性

由表1可知，JC-3jx菌株对供试的5种病原真菌均有较为明显的抑制效果，其中对大豆疫霉的抑制效果最为明显，抑菌率达到50％，而对番茄早疫的抑制作用最弱，抑菌率只有31％。

②琼脂扩散法

挑取平板单菌落划线斜面培养基，30℃培养24h，斜面加5ml无菌水，刮下菌体，混匀后吸取0.6ml至含有30ml发酵培养基的摇瓶，30℃，220r/min分别培养12h，24h，36h和48h，检测抑菌活性。发酵培养基：玉米淀粉20g，蔗糖15g，酵母膏15g，硫酸胺4.5g，磷酸二氢钾2.0，硫酸锰0.5，碳酸钙3.0g，自来水1L，pH值7.0-7.2。

检验平板制备：采用斜面培养基加热融化后放凉至不烫手(45-50℃)，加入适量金黄色葡萄球菌(G⁺)或者大肠杆菌(G^-)或产气荚膜梭菌(G⁺)，摇匀后倒平板，待冷却凝固后用6mm打孔器打孔。

不同培养时间的发酵液10000rpm离心5min，取上清，过0.22μm滤膜除菌，再取无菌上清液50μl点样至圆孔中，将平板置于4℃冰箱2h，待样品充分渗透后置于30℃，培养16-24h，观察并测量透明圈直径。抑菌圈直径＝透明圈直径-孔径(6.0mm)。如图9～13所示，JC-3jx菌株对供试的5种病原真菌均有较为明显的抑制效果。

图14中的批注为：0:为无菌水；1、2、3、4依次为发酵12h，24h，36h，48h的JC-3jx发酵液；

A：JC-3jx发酵液对大肠杆菌CMCC44103的抑菌圈，CK为硫酸黏杆菌素，2g/L；

B：JC-3jx发酵液对产气荚膜梭菌的抑菌圈，CK为乳酸链球菌素，2.5g/L；

C：JC-3jx发酵液对金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌圈，CK为乳酸链球菌素，2.5g/L。

如图14所示，JC-3jx菌株不同培养时间的的无菌上清液对供试的3种病原细菌均显示了清晰的抑菌圈，体现了较为广谱的抑菌活性，其中对革兰氏阴性病原菌大肠杆菌的抑制效果明显好于革兰氏阳性病原菌，而且均为培养24h的上清液抑菌性能最强，对大肠杆菌的抑菌圈直径达22mm。

由此可见，本发明以金钗石斛为分离基质，通过组织分离法，结合指示菌的对峙培养筛选，首次从金钗石斛中分离到内生细菌JC-3jx，综合形态学及分子标记，鉴定为皮尔瑞俄类芽孢杆菌。对峙培养结果显示，JC-3jx菌株对多种病原真菌具备明显的拮抗活性，并且其无菌发酵上清液展现了对多种病原细菌的抑制活性，特别是培养24h的上清液，其对大肠杆菌的抑菌活性最强。而且不同菌浓悬液对玉米种子生根与绿豆出芽有非常明显的促进作用，体现了较好的促生性能，具备成为优质生防促生菌种资源的潜力。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种种子促生微生物试剂，其特征在于，所述微生物试剂含有金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌，命名为JC-3jx菌株，保藏号为GDMCC No:62384，保藏日期为2022年4月14日，保藏分类命名为皮尔瑞娥类芽孢杆菌，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

2.如权利要求1所述的种子促生微生物试剂，其特征在于，所述JC-3jx菌株的rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的种子促生微生物试剂，其特征在于，所述微生物试剂中接种金钗石斛内生皮尔瑞娥类芽孢杆菌的悬液浓度为1.6×10⁴～1.6×10⁶CFU/mL。

4.权利要求1～3任一项所述的种子促生微生物试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述JC-3jx菌株进行斜面活化培养，再进行摇瓶种子扩大培养，再转入发酵罐培养，喷雾干燥后，得到种子促生微生物菌剂。

5.如权利要求4所述的种子促生微生物试剂的制备方法，其特征在于，所述斜面活化培养的具体步骤为：采用NA培养基斜面培养进行活化，接种甘油菌至NA培养基斜面，进行培养后，得到F1代斜面，随后取F1代斜面转接至另一NA斜面培养基，培养后得到活化后的F2代斜面。

6.如权利要求4所述的种子促生微生物试剂的制备方法，其特征在于，所述摇瓶种子扩大培养的具体步骤为：将活化培养的斜面菌种加入生理盐水洗脱制备菌悬液，转接于含有种子培养基的摇瓶中，振动混合，再进行培养12h。

7.如权利要求6所述的种子促生微生物试剂的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括葡萄糖、玉米淀粉、豆粕粉、酵母膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸锰、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和水，调pH值为6.5～7.0，高压灭菌后制得。

8.如权利要求4所述的种子促生微生物试剂的制备方法，其特征在于，所述发酵罐培养是将摇瓶培养好的种子液接种至发酵罐；在发酵培养起始阶段，控制发酵罐通气量为200～250mL/min，搅拌控制为250～350rpm，温度控制在30-37℃，初始葡萄糖的浓度控制在20～30g/L；前12h控制体系的pH为6.5～7.0，控制溶解氧为25～45％，12h以后pH和溶氧不作限定。

9.如权利要求8所述的种子促生微生物试剂的制备方法，其特征在于，发酵周期控制在36h以内，停止发酵，将发酵液升温至60℃并维持一段时间，然后再加入麦芽糊精和氯化钙保护剂，混匀后进行喷雾干燥，喷雾塔的入口温度为160～180℃，出口温度为82～85℃，即得到活菌数＞1×10¹²CFU/g的种子促生微生物试剂。

10.如权利要求8所述的种子促生微生物试剂的制备方法，其特征在于，所述发酵罐中的液体培养基包括豆粕粉、麸皮、麦芽糖浆、可溶性淀粉、L-谷氨酸钠、MgSO₄·7H₂O、KCl、KH₂PO₄、FeSO₄、MnSO₄和轻质碳酸钙，调节初始的pH为6.8～7.0，灭菌后得到液体培养基。

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