CN115261283B - 一种蜡样芽孢杆菌及其在旱作马铃薯病害防控中的应用 - Google Patents

一种蜡样芽孢杆菌及其在旱作马铃薯病害防控中的应用 Download PDF

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Abstract

一株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，于2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24485。该蜡样芽孢杆菌耐旱、高度耐盐碱、耐较高温度、其繁殖力强、发酵液活性物质有多种细菌素类及有机酸类抑菌物质和植物生长调节化合物、与病原菌竞争占位和遏制病原菌细胞膜蛋白质合成使得细胞膜严重受损，从而达到抑菌的目标。蜡样芽孢杆菌BAC‑1981发酵菌液对疮痂链霉菌、茄青枯劳尔氏菌、硫色镰刀菌等多种病原菌及其引发的旱作马铃薯疮痂病、青枯病、干腐病等病害有较强抑制活性和防控效果。

Description

一种蜡样芽孢杆菌及其在旱作马铃薯病害防控中的应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种蜡样芽孢杆菌及其在旱作马铃薯病害防控中的应用。
背景技术
中国是全世界马铃薯种植面积最大的国家之一，每年种植马铃薯的面积均超过500 万 hm2，占全球种植面积的 1/5 以上，主产区主要分布在相对干旱的西南山区、西北、内蒙古和东北地区，是这些地区农村经济发展的特色产业之一，也是当地农民的主要经济来源之一，马铃薯的种植面积已经是1998 年的一倍多，产量增加了三倍以上。但是，随着马铃薯种植面积的扩大和连作重茬，马铃薯病虫害的发生也越来越严重，目前已知的包括早疫病、晚疫病、黑痣病、枯萎病、干腐病等30 多种真菌病害、腐烂病、青枯病等3种细菌病害和10 多种病毒病害、蛴螬、金针虫、地老虎等7 种地下害虫和 根腐线虫、腐烂茎线虫等4种线虫病害。这些病虫害都给马铃薯生产带来严重危害，影响马铃薯产量和品质。目前，对于这些病虫害的防控主要包括培育抗病品种、农业措施和化学防治等，由于马铃薯抗病品种培育周期长、抗病效果不稳定、品种很少，农业轮作技术经济效益不能保证，硫代氨基甲酸盐类、苯并咪唑类等杀菌剂、多菌灵等化学农药防治仍是生产上控制马铃薯病虫害的主要技术手段，但是由于频繁大量使用化学农药，多数病虫害逐渐产生了适应性和抗药性，需要进一步加大药量才能达到预期的防控效果，如此一来形成恶性循环，环境污染、产品品质下降和病虫害抗药性成为目前生产上急需解决的问题。
生物防治是利用生物物种种间和种内的相互关系，以一种或一类生物控制另一种或另一类生物以减少危害的措施，包括调节病原物种群、保护性排除方法和自身防御等，是在农业生态系统中调节寄主植物的微生物环境，使其利于寄主而不利于病原，或者是植物中寄主和病原物互相作用时，发生有利于寄主而不利于病原菌的影响，从而达到病害防治的目的。生物防治具有不污染环境、对人畜安全、靶标不易产生抗药性、无残留等优点成为缓解目前马铃薯生产中病虫害防控难题的有效技术之一。目前，用于植病生防的因子很多，包括拮抗微生物、抗生素和植物诱导剂等。国内外研究的生防菌种类较多，主要包括真菌、细菌、放线菌和病毒，其中木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等生防真菌和枯草芽孢杆菌、放射性土壤农杆菌和荧光假单胞杆菌等生防细菌，但由于自身的天然缺陷，大多数应用也相对局限。芽孢杆菌是农业生产中应用相对较多的一种生防菌，作为微生态环境的优势种群，具有繁殖力强，理化性质稳定，以及促进植物生长等优点，能够满足农药减量控害增效以及绿色农业可持续发展的要求，但目前应用于生防的芽孢杆菌的抗逆性相对不够理想，尤其抗旱耐盐碱能力不足，导致在旱作农业环境下繁殖慢、定殖难从而应用效果不稳定。而我国的马铃薯绝大对数产区在干旱和半干旱地区，因此，生防微生物的筛选首先要考虑菌种的抗旱、耐盐、抗酸碱等抗逆性能，以及发酵液活性物质丰度等，才能保证其应用效果。本发明针对旱作马铃薯生产中病虫害的发生、危害和防治现状，从当地土壤环境分离抗逆高活性目标功能菌，克服同属生防菌在寒旱、干燥、强紫外线等逆境中的繁衍定殖难和应用效果差的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种蜡样芽孢杆菌，该蜡样芽孢杆菌为耐旱、高度耐盐碱、耐较高温度、繁殖力强、通过与病原菌竞争占位和遏制病原菌细胞膜蛋白质合成使得细胞膜严重受损而达到抑菌目标。
上述蜡样芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，保藏编号为CGMCC No.24485。
所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus是从甘肃白银市武川乡旱作马铃薯根际土壤中分离选育得到的菌株BAC-1981，经过形态观察、生理生化鉴定和16S r DNA分子鉴定最终确定该菌株为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。
所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 6.5 g，牛肉膏5 g，MnSO4·H2O 7.5 mg，琼脂粉适量，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。该分离纯化培养基有利于蜡样芽孢杆菌富集，提高其分离纯化效率。
所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus耐旱，能耐受模拟环境的重度干旱，即PGE6000浓度为150～270g/L均能生长繁殖 。
所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus高度耐盐碱，在NaCL浓度10%～25%或Ph9～Ph13的中度以上模拟盐、碱环境下均能生长繁殖。
所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus的抑菌机理：菌种繁殖力强，扩散快，与病原菌竞争占位；抑制真菌病原菌孢子萌发和菌丝生长；遏制病原菌细胞膜蛋白质合成 ，使得细胞膜受损严重，内容物外渗而导致菌种死亡。
所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus的发酵液制备时的发酵培养基配方为牛肉膏5 g、酵母膏2 g、葡萄糖15 g、蛋白胨 10.0 g、NaCL6.0 g、蒸馏水容至1000 mL，pH7.0。该发酵培养基促进蜡样芽孢杆菌生长繁殖，使其对数生长期提前，培养40h发酵液含菌量即可达到1010cfu/ml以上，培养48h其发酵液抑菌活性显著提高。
所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus的发酵液主要活性物质种类丰富，特有吲哚乙酸、细胞分裂素和氨基酸等植物生长调节剂，促进植物生长发育，异汉防己甲素、乙硫苯威、甲基丙二酸、甲氧基酚、蓖麻油酸等细菌素类和有机酸类抑菌物质。
所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus活菌与发酵液活性物质共同作用，其主要抑菌谱为疮痂链霉菌、茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致病型、环腐棒杆菌、丁香假单胞菌致病型、粉痂菌、尖镰孢菌、硫色镰刀菌和茄链格孢菌。
本发明的目的之二是提供蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus在防控旱作马铃薯病害中的应用，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus发酵菌液能有效防控由疮痂链霉菌、茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致病型、丁香假单胞菌致病型、环腐棒杆菌等病原菌引发的马铃薯疮痂病、青枯病、软腐病、黑胫病、环腐病和等细菌性病害，平均防治效果在90%～95%，对粉痂菌、尖镰孢菌、硫色镰刀菌和茄链格孢菌等病原菌引发的马铃薯粉痂病、灰霉病、枯萎病、干腐病和早疫病等真菌性病害也有较好防效，平均防治效果在80%～92%。均与对照农药在0.05水平上不存在显著性差异。
附图说明
图1为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981菌落形态；
图2为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵生长曲线；
图3为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981占位竞争抑菌；
图4为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；
图5为未用蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；
图6为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵上清液对尖孢镰刀菌菌丝（T1、CK1）和茄青枯劳尔氏菌菌体（T2、CK2）可溶性蛋白质含量影响；
图7为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981抑菌谱；其中病原菌依此为：茄链格孢菌、腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、粉痂菌、疮痂链霉菌、丁香假单胞菌致病型、茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致病型、环腐棒杆菌；
图8为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981耐旱能力；
图9为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981温度耐受能力；
图10为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981耐酸碱能力；
图11为本发明蜡样芽孢杆菌BAC-1981耐盐能力。
具体实施方式
一、蜡样芽孢杆菌BAC-1981的分离和分类鉴定
1 菌株的分离、纯化
1.1 主要培养基
LB 培养基、NA培养基、PDA培养基，均为现有常规配方。
分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 6.5 g，牛肉膏5 g，MnSO4·H2O 7.5 mg，琼脂粉适量，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。
菌株分离纯化
马铃薯花期前,采用五点法取根际土样，采样地点：甘肃省兰州市白银区武川乡旱作马铃薯地块。选长势健康一致的马铃薯植株，轻轻拔出, 将植株自根茎处剪断转入无菌袋中冷藏保存带回实验室。抖落根上松散的附着土,称取根5 g ，置于盛有80 ml 灭菌的0.1 %水琼脂的三角瓶中, 20℃、200 rmp/min匀速 振荡25 min,得到马铃薯根际土壤悬浮液，静置30分钟。
用移液枪吸取1 mL震荡均匀的菌悬液，置入装有9 mL无菌水的试管中，振荡均匀，进行系列稀释至10-8。选取10-8、10-7、10-6、10-4和10-2 5个稀释梯度分别在分离纯化培养基平板上进行涂布，每个浓度梯度重复3次，每平板取稀释液200µl。各试验平板于28℃下倒置培养2～3 d。培养结束后，挑取平板上生长出的特征相异单菌落，28℃下继续进行多次划线纯培养，直至平板上菌落形态单一为止。编号，接种于斜面试管中培养、保藏6个月。活化发酵保藏菌，采用30W ＵＶ和0.02µg/ml ＮＴＧ复合诱变处理选育抑菌活性强、传代稳定的菌株，编号，保藏，备用。
高拮抗菌株筛选
采用琼脂扩散法。将致病型尖刀镰刀菌接种于PDA上活化，加适量无菌水洗脱做成1×108cfu/ml病原菌菌悬液。在无菌PDA平板上加200µl病原菌菌悬液涂抹均匀，室温干燥5 min，在带菌平板中央放置无菌牛津杯，每个牛津杯中注入1.1中分离纯化的菌株发酵液或菌株发酵上清液100μL，以无菌水为对照。每种菌株发酵液或菌株发酵上清液各做 4 个重复。28℃培养7d后观察是否有抑菌圈并测定抑菌直径，判断是否有抑菌作用及其抑菌能力强弱。 病原菌换成茄青枯劳尔氏菌，接种培养基换成LB 培养基，其余不变。
表1：高拮抗菌株筛选结果
注释：表中列出的是拮抗活性最强的前五株1.1.2中分离纯化获得菌；表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
依据表1结果选取拮抗活性最高的菌株1981做进一步分类鉴定。
高拮抗活性菌株1981分类鉴定
1.4.1形态学鉴定
用接种环挑取新鲜菌株1981接于NA培养基中，将其放置于28℃恒温培养箱中培养48h后进行观察菌落形态，并在显微镜下观察菌体的形状、芽孢的有无。
1.4.2生理生化测定
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对接触酶反应、淀粉水解、MR试验、麦芽糖、乳糖、D-葡萄糖和硝酸盐等生理生化指标进行观测。
1.4.3 16S rDNA序列分析
细菌DNA提取采用蛋白酶-SDS法制备，扩增引物：
27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、
1492R: 5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序及同源性分析。
1.4.4鉴定结果
菌株1981的菌落近圆形，白色，表面光滑无光泽，稍隆起，边缘不整齐呈小缺刻状（见图 1）。革兰氏染色呈阳性，短杆状、端生芽孢。接触酶反应、葡萄糖发酵、淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化反应、柠檬酸盐利用试验、果糖发酵、甘露醇水解、麦芽糖发酵和MR试验均为阳性，VP试验、蔗糖发酵和乳糖发酵均为阴性。菌株的 16S r DNA 序列结果通过与NCBI数据比对分析和多株 Bacillus cereus 菌株归于同一簇群，同源性均在99%-100％。综合形态学特征、生理生化特征和 16S rDNA分子鉴定结果，菌株1981为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus），终编号BAC-1981。
二、蜡样芽孢杆菌BAC-1981特性及效果试验：
1 蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液制备方法：将菌株BAC-1981的108cfu/ml菌悬液以8%接种量接于发酵培养基液中，28±1℃、180转∕分恒温震荡培养48h，即得蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液。
上述发酵培养基配方为：牛肉膏5 g、酵母膏2 g、葡萄糖15 g、蛋白胨 10.0 g、NaCL6.0 g、蒸馏水容至1000 mL，pH7.0。
蜡样芽孢杆菌BAC-1981的抑菌机理。
菌株BAC-1981的生长曲线
将菌株BAC-1981的108cfu/ml菌悬液以8%接种量接于发酵培养基溶液中，28±1℃、180转∕分恒温震荡培养，每隔5小时取样，记录发酵液的浓度（菌数），绘出各菌株生长曲线。
从图2可知：蜡样芽孢杆菌BAC-1981在适宜发酵条件下繁殖速度很快，发酵10h菌数即可达到108cfu/ml，20h后菌数可达到109cfu/ml，30h后菌数可达到1010cfu/ml，发酵40h菌数可达到最大5.37×1010cfu/ml，而同属同种的对照菌1.260在发酵25h后菌数才达到108cfu/ml，50h后菌数达到最大值即可达到5.93×109cfu/ml。蜡样芽孢杆菌BAC-1981对数生长期在发酵10小时开始，比同属同种的菌株1.260繁殖速度快一倍，且发酵液最大含菌量也高一个数量级。有利于与病原菌竞争占位，达到抑制病原菌的目的（图3）。
菌株BAC-1981对靶标病原菌菌丝形态的影响
采用双层牛津杯法观察生防菌发酵液对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响。将PDA加热至融化，取15mL倒入培养皿中，待其凝固后再倒入5 mL融化的PDA，并在培养皿中央位置放置牛津杯，待皿内培养基凝固后，在平板上距皿边缘1 cm的对称位置处接种尖孢镰刀菌菌饼(直径5 mm），在牛津杯中加入100 µL目标生防菌发酵液，对照组加等量无菌蒸馏水。将培养皿正放于恒温培养箱中，26℃培养3-5 d后取出培养皿，将尖孢镰刀菌与抑菌圈交界处的尖孢镰刀菌培养物切下置于载玻片上，利用光学显微镜观察菌丝形态，与对照组进行比较。
从图4可知，与未处理的尖孢镰刀菌菌丝形态相比，菌株BAC-1981发酵液使得尖孢镰刀菌菌丝体失水皱缩、弯曲变形、部分断裂、顶端彭大微缩破损，繁殖生长受限。
菌株BAC-1981发酵液对靶标病原菌孢子产生的影响
用菌丝生长速率法测定。将无菌PDA培养液与菌株BAC-1981发酵液以10:9的比例混匀倒平板，再将尖刀廉孢菌的菌饼（直径6mm）置于培养基中央，静置5min ，倒置， 26±1℃培养10d，观察菌落生长状况。用10 mm打孔器在距离菌落边缘打3个菌饼，将菌饼放入装有5 mL无菌蒸馏水的离心管中并将菌饼上的孢子全部洗脱下来，再用血球计数板进行计数，每菌落取3个菌饼，每菌饼的孢子数计数4次，未带菌的PDA培养基平板为对照。将记录并计算菌株A对尖刀廉孢菌孢子产生的抑制率。
抑制率% ＝ （对照平均孢子数－处理平均孢子数）/ 对照平均孢子数
表2：菌株BAC-1981发酵液对靶标病原菌孢子产生的影响
注释：表中同行小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。
从表2结果显示，菌株BAC-1981发酵液抑制尖孢镰刀菌的孢子生产，抑制率为82.46%，与同种菌株存在显著性差异（P≥0.05）。
菌株BAC-1981发酵上清液对尖孢镰刀菌和茄青枯劳尔氏菌的可溶性蛋白质含量影响
取菌株尖孢镰刀菌培养10天的菌饼若干，接入 PDA培养液，每 100 m L ，26℃、180r·min-1 振荡培养72 h 后，制成种子液。将种子液以10%的接种量接入两份新PDA培养液，相同条件培养 48 h后分别加入体积分数90%和0%（空白对照）的菌株BAC-1981发酵上清液，继续培养 120h，6层纱布过滤菌丝，用 p H7.5 的 PBS 冲洗，滤纸吸去水分，取各处理收集的菌丝 3 g，加入 21 m L 0.05 mol·L-1 PH7.8 PBS、1 g 石英砂冰浴研磨至匀浆，4℃、8000 r·min-1离心 10 min，取上清液， -20℃下保存备用。病原菌为茄青枯劳尔氏菌时，在LB培养中发酵培养24小时后同量接种菌株BAC-1981发酵上清液，继续培养48小时，4℃、10000 r·min-1离心 15 min，滤去上清液，合并菌泥，其他同尖孢镰刀菌过程一样制成处理上清液，保存备用。各取上述两类上清液.2 mL加入5 mL考马斯亮蓝染液混匀，室温静置1 min，在λ=595nm处测定吸光值，即OD值。
图6结果显示，菌株BAC-1981发酵上清液处理使得尖孢镰刀菌菌丝体和茄青枯劳尔氏菌菌体的可溶性蛋白质含量大幅度下降。因为菌株BAC-1981发酵上清液抑制了尖孢镰刀菌菌丝体和茄青枯劳尔氏菌菌体细胞膜蛋白质合成，细胞受损内容物外流，从而造成靶标病原菌生长繁殖受限、死亡。
蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液主要活性物质。
采用甲醇（含同位素标记内标混合物）-超声波提取法，提取蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液发酵液活性物质，送上海阿趣生物科技有限公司进行基于LC-MS和GC-TOF-MS非靶标的代谢组学检测分析。结果见表3。
表3: 蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液主要活性物质
表3的结果显示，蜡样芽孢杆菌BAC-1981的发酵液活性物质种类很丰富，其中L-Histidine; L-Glutamic acid; 2-Hydroxyxanthone; 6-Aminopenicillanic acid; 2-Ketobutyric acid;9,10-epoxyoctadecanoic acid ;Indoleacetaldehyde;Methylimidazoleacetic acid; Ricinoleic acid; 3-Phenylpropyl 2-methylpropanoate; Indole; 3-(3,4-Dihydroxy-5-methoxy)-2-propenoic acid;Abscisic acid; alpha-Zearalenol; Emodin; Ethiofencarb; 4-Nitrophenol;Dimethylmalonic acid; Gibberellin A3； L-Lysine;L-Norleucine; L-Glutamine; L-Phenylalanine; L-Serine; L-Threonine和L-Tyrosine是该菌株特有或种类丰富的。有吲哚乙酸、细胞分裂素和大量氨基酸等植物生长调节剂，促进植物生长发育，一些异汉防己甲素、乙硫苯威、硝基苯酚、二甲基丙二酸、甲氧基酚、蓖麻油酸等细菌素类和有机酸类是其特有的抑菌物质。
蜡样芽孢杆菌BAC-1981的主要抑菌谱
通过扩散法中的抑菌圈法（病原菌为细菌、放线菌）或平板对峙法（病原菌为真菌）进行蜡样芽孢杆菌BAC-1981抑菌谱测定。
抑菌圈法：将茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致病型、环腐棒杆菌和丁香假单胞菌致病型等病原细菌在NA培养基，28℃活化培养2-3 d，斜面中加入5 mL含0.3%吐温80的无菌水，将菌苔刮下置于装有无菌玻璃球的50mL锥形瓶内，摇床中充分震荡2小时后，稀释至含菌量为1 ×108 cfu/mL ，备用。将疮痂链霉菌等病原放线菌接于高氏一号斜面， 26℃活化培养10-12 d，斜面中加入5 mL含0.3%吐温80的无菌水，将孢子刮下，将孢子洗脱液置于装有无菌玻璃球的50 mL锥形瓶内，摇床中充分震荡2小时后用4层灭菌的玻璃纸过滤去除菌丝，然后装入离心管置于离心机中，5000 r/min离心10 min，弃上清液，收集孢子沉淀，再用无菌水悬浮孢子，制得孢子浓度大于1 ×108 cfu/mL待测孢子悬浮液，备用。取200 μL病原菌悬液均匀涂布于NA培养基平板中，在平板中心放入无菌钢圈（直径0.6cm），加入100 μL菌株BAC-1981发酵液，无菌水为空白对照，28℃培养2d（放线菌培养10d），观测抑菌圈有无及其大小，判断蜡样芽孢杆菌BAC-1981对其是否有抑菌活性及其强弱。
平板对峙法。将粉痂菌、灰葡萄孢、尖镰孢菌、硫色镰刀菌和茄链格孢菌等病原真菌接种于PDA上活化并打取菌饼若干备用。在无菌PDA平板底划“十”字，病原真菌菌饼置于“十”中央，在距离PDA平板“十”中央1.0cm处打直径0.5cm 孔4个，接菌株BAC-1981发酵液各50µl，无菌水为对照平板，试验重复4次，在28℃培养12d后观察是否有抑菌圈及其大小，判断是否有抑菌作用及其抑菌能力强弱。
从以上抑菌效果（图7）可知，蜡样芽孢杆菌BAC-1981对疮痂链霉菌、茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致病型、环腐棒杆菌、丁香假单胞菌致病型、粉痂菌、尖镰孢菌、硫色镰刀菌和茄链格孢菌等植物病原菌均有较强抑制活性。
、蜡样芽孢杆菌BAC-1981的耐旱能力测定
在灭菌后的 100 mL LB培养基中分别添加经无菌处理过后不同浓度的 PEG6000，使 PEG6000 的终浓度为 0、30、60、90、120、150、180、210、240、270g/L。接入6%的蜡样芽孢杆菌BAC-1981种子培养液，在28℃，200 r/min 的条件下震荡培养 48h 后，用LB液体纯培养基调零，读取 700 nm 处的 OD 值。PEG6000 的浓度为 0-60 g/L 代表轻度干旱，90-150g/L 代表中度干旱，大于 150 g/L 代表重度干旱。
图8结果显示，蜡样芽孢杆菌BAC-1981耐旱能力很强， PGE6000浓度小于270g/L均能生长繁殖，PGE6000浓度越小 ，生长繁殖越好。PGE6000浓度150g/L～270g/L的重度干旱模拟环境下，处理液OD700nm值在0.672～0.102，即表示蜡样芽孢杆菌BAC-1981也能生长繁殖。
、蜡样芽孢杆菌BAC-1981的耐温、耐盐碱能力测定。
用接种环挑蜡样芽孢杆菌BAC-1981菌落接至LB液体培养基中28℃、180r/min培养24h制成种子液，按6%分别接种到ph7.2含有1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、25%NaCL和PH为3、5、7、9、11、13、14的含5g/L NaCL的NA液体培养基，28℃、180r/min摇床培养48h，以及将蜡样芽孢杆菌BAC-1981种子液按6%接种量接种于ph7.2、含5g/L NaCL的NA液体培养基，分别于0、5、10、20、30、37、42、50℃和60℃、180r/min摇床培养48h。用无菌LB液体培养基调零，测各培养液在600nm处的OD值，依此判断蜡样芽孢杆菌BAC-1981的耐温、耐盐碱能力。耐盐能力标准：非耐盐菌株，NaCl 含量小于 1.17%；低耐盐菌株，Na Cl 在 1.17～2.93%；中等耐盐菌株，NaCl 浓度在 2.93%～14.63%，高度耐盐菌株：14.63%～30.4%。耐碱能力标准：耐碱微生物，PH值7～9生长，PH＞9.5不能生长；嗜碱微生物，PH值7～9生长；极端嗜碱微生物，最适生长PH值≥10，PH值低于8.9～9则不生长，为专性极端嗜碱微生物；兼性嗜碱微生物，具有能在两种或两种以上不同环境下生存或繁衍后代的能力。
图9结果显示，蜡样芽孢杆菌BAC-1981在20℃～37℃能正常生长，小于20℃，大于37℃，能生长，但较慢，0℃休眠，60℃死亡。证明蜡样芽孢杆菌BAC-1981能耐受极端温度。图10结果显示，蜡样芽孢杆菌BAC-1981在PH值5～11能正常生长，小于5，大于11，能生长，但较慢，PH14时死亡。证明蜡样芽孢杆菌BAC-1981耐受酸碱能力很强。图11结果显示，蜡样芽孢杆菌BAC-1981在NaCL浓度小于15%时能正常生长，15%～25%也能生长，但逐渐变慢，30%死亡。证明蜡样芽孢杆菌BAC-1981为高度耐盐菌株。
、蜡样芽孢杆菌BAC-1981在防控旱作马铃薯病害中的效果
供试药剂: 蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液为试验药剂，50%多菌灵可湿性粉剂800稀释液为阳性对照（真菌），20%噻唑锌悬浮剂800倍液（细菌），清水处理为空白对照。
病原菌孢子（菌体）悬液制备：分别将疮痂链霉菌、茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致病型、丁香假单胞菌致病型、环腐棒杆菌等病原菌用NA培养基活化72h；将粉痂菌、尖镰孢菌、硫色镰刀菌和茄链格孢菌等病原菌用PDA培养基，26±1℃活化培养10ｄ～15 d；待生成大量菌体或孢子后，用适量无菌水洗脱，制成含孢（菌）量大于108 cfu·ml-1的孢子（菌）悬液，备用。
蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液，，采用上述二之1节中提供的方法。
供试植物准备：挑选大小基本一致、表面干净催好芽马的铃薯原种（陇薯10）足量，切块（用0.2%高锰酸钾溶液消毒切刀），拌草木灰，备用。
将育苗基质灭菌，接体积重量百分比30%的试验药剂、对照药剂和清水（空白对照）于无菌基质，保温（28±1℃）保湿放置3天。再将各病原菌孢子（菌）悬液按体积重量百分比10%接种于混合基质，保温（26±1℃）保湿下放置12天(真菌或放线菌）或3天（细菌），装盆，标记。将供试马铃薯种子点种于盆中，每盆点种5粒，每种病原菌悬液处理12盆，标记，常规管理，备用。再将试验药剂、对照药剂和无菌清水按30ml/株的量灌根处理，所有处理保温（28±1℃）保湿管理。共处理3次，前2次每次间隔3天，后1次每次间隔7天。每天观察记录出苗、植株生长和发病（包括未出苗的，未出苗及时调查病因）情况，出苗后25天（空白对照发病率大于10%）统计发病植株及其发病情况，计算防治效果，计算公式同试验例1。试验结果见表5。
表5：蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液对马铃薯多种病害的防控效果
注释：表中同行小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）；阳性对照为50%多菌灵可湿性粉剂800稀释液（真菌），20%噻唑锌悬浮剂800倍液（细菌）。
表5结果显示，蜡样芽孢杆菌BAC-1981发酵液能有效防控由疮痂链霉菌、茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致病型、丁香假单胞菌致病型、环腐棒杆菌等病原菌引发的马铃薯疮痂病、青枯病、软腐病、黑胫病、环腐病和等细菌性病害，平均防治效果在90%～95%，对粉痂菌、灰葡萄孢、尖镰孢菌、硫色镰刀菌和茄链格孢菌等病原菌引发的马铃薯粉痂病、枯萎病、干腐病和早疫病等真菌性病害也有较好防效，平均防治效果在81%～92%。均与对照农药不存在显著性差异（p≥0.05）。

Claims (7)

1.一株蜡样芽孢杆菌，该蜡样芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，保藏编号为CGMCC No.24485。
2.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 6.5 g，牛肉膏5 g，MnSO4·H2O 7.5 mg，琼脂粉适量，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。
3.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在旱作马铃薯病害防控中的应用。
4.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌的发酵液在旱作马铃薯病害防控中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液制备时的发酵培养基配方为：牛肉膏5 g、酵母膏2 g、葡萄糖15 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl6.0 g、蒸馏水定容至1000 mL，pH7.0。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵液的活性物质有异汉防己甲素、甲基丙二酸、蓖麻油酸、有机酸类抑菌物质，吲哚乙酸、细胞分裂素和氨基酸。
7.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌的发酵液对疮痂链霉菌、茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐致病型、丁香假单胞菌致病型、环腐棒杆菌、粉痂菌、尖镰孢菌、硫色镰刀菌、茄链格孢菌中一种或任两种及以上引发的旱作马铃薯疮痂病、青枯病、软腐病、黑胫病、环腐病、粉痂病、枯萎病、干腐病和早疫病防控中的应用。
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