CN113832071A - Brevibacillus halotolerans菌及其制备生防菌剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菌种编号为Z‑9的Brevibacillus halotolerans的生防菌剂及其应用，通过从新疆图木舒克和阿拉尔棉花和红枣根际土壤分离得到的属于耐盐短芽孢杆菌属中的新菌Brevibacillus halotolerans Z‑9，菌株Z‑9对枣果黑斑病菌和棉花黄萎病菌抑菌圈直径分别为23.32mm和25.68mm，含有儿茶酚型铁载体，且为含异羟肟酸型铁载体为阴性，As/Ar比值最小值为0.682±0.021，产铁能力最高。利用菌株Z‑9制备的生防菌剂应用大田，棉花黄萎病和枣果黑斑病的病情指数均有所降低，分别为7.14和8.34，防治效果高达78.07％。表明本发明提供的菌种Brevibacillus halotolerans Z‑9及其制备的生防菌剂对枣果黑斑病和棉花黄萎病均有高效性，且无毒无致病性等副作用，对于枣果黑斑病和棉花黄萎病的生物防治具有广泛的应用价值。

Description

Brevibacillus halotolerans菌及其制备生防菌剂中的应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体的涉及一株耐盐短芽孢杆菌属中新菌Brevibacillus halotolerans Z-9及其制备的生防菌剂在制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病药物中应用的技术领域。
背景技术
棉花黄萎病1914年首次在美国弗吉尼亚州被报道，随后蔓延到包括中国在内的数十个国家和地区，对棉花产量造成巨大损失，成为棉花高产稳产的主要障碍。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliaeKleb)引起的一种棉花土传病害，棉花黄萎病在棉花整个生育期均可发病，一般在3-5片真叶期开始显症，生长中后期棉花现蕾开花后田间大量发病，发病后常导致棉花蕾铃稀少，棉铃提前开裂，造成减产，新疆是我国最主要的棉花生产基地，产量占全国的85％左右，由大丽轮枝菌引起的黄萎病严重阻碍了新疆棉花产业的可持续发展。棉花黄萎病的主要防治方法是培育抗病品种、化学防治和生物防治等。其中，培育抗病品种由于缺乏有效的抗病源，目前尚无成功栽培的高抗病品种，化学防治没有有效的杀菌剂，且长期使用容易造成环境污染，化学防治受药效和使用方式的限制，难以发挥作用；生物防治已经有很多微生物被证实具有生防效果，有的已逐步走向应用。许多生防微生物可产生多种抗生素、胞外酶等活性物质，加之孢子抗逆性强，在土传病害防治方面具有较好的应用前景。
林忠敏等2001年首次报道了山西省枣果上的一种新病害，命名为枣果黑斑病。枣果黑斑病主要发生在叶子和花器官，并在后期感染果实，枣果上的疾病感染潜伏期长，症状开始出现在8月至9月枣果的白熟期。枣果黑斑病田间典型症状是初期枣果表面腰部或胴部出现深褐色至黑色圆形斑点，随着红枣长大，后病斑不断扩大，成圆形或一些不规则的黑色病斑，病斑一般出现在枣果脐部或顶部，果肉变黑变硬，病变果肉易分离，枣黑斑病的病原物被认为主要由茎点霉属(Phomasp)、链孢属(Alternariasp)以及毛盘孢属(Colletortrichumsp)等真菌引起，一般病果率在30％左右，病重的枣园达80％以上，使枣果产量、品质下降，不能贮存，严重影响了枣果的商品性，给枣农造成重大经济损失，成为生产上亟待解决的难题。枣果黑斑病在早期侵入枣果后在枣果内潜伏侵染，到枣果着色期开始达到发病高峰，因此早期减少病菌对枣花、枣果的侵染对防治该病至关重要。然而新疆红枣花期长达100d左右，在开花期施用化学杀菌剂易导致红枣的落花落果，这给枣果黑斑病的防治造成了一定困难。筛选对枣果黑斑病有良好防效，同时对枣花安全的生物农药对枣果黑斑病的防治具有重要应用价值。
生物防治因具有专化性强、防效高、药效持久性好、并且不存在环境污染问题等优点，近年来受到越来越多的重视。随着对耐盐短芽孢杆菌的深入研究，国内外已有文献对耐盐短芽孢杆菌的新物种进行了报道，目前尚无文献和专利报道有关耐盐短芽孢杆菌在枣果黑斑病和棉花黄萎病防治中的应用。
发明内容
针对现有技术尚未记载有关耐盐短芽孢杆菌在枣果黑斑病和棉花黄萎病防治方面有应用的技术现状，本发明旨在于提供一种耐盐短芽孢杆菌属中新菌Brevibacillushalotolerans Z-9生防菌剂及其应用，通过从新疆图木舒克和阿拉尔棉花和红枣根际土壤分离得到的耐盐短芽孢杆菌属中新菌Brevibacillus halotolerans Z-9，利用Brevibacillus halotolerans Z-9制备生防菌剂，将其应用于制备防治枣果黑斑病和棉花黄萎病的药物中，Brevibacillus halotolerans Z-9对棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌抑菌圈直径分别为23.32mm和25.68mm，含有儿茶酚型铁载体，含异羟肟酸型铁载体为阴性，As/Ar比值最小值为0.682±0.021，产铁能力最高为“++”。Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂经大田试验，棉花黄萎病病情指数均有所降低，病情指数为7.14，对棉花黄萎病的防治效果最好，达78.07％；Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂50倍稀释配施对枣果黑斑病的防治效果较好，病情指数降低至8.34，发病率抑制至9.58％，第3次施药后，防治效果高达78.07％。表明本发明提供的Brevibacillus halotolerans Z-9及其制备的生防菌剂对棉花黄萎病和枣果黑斑病均有高效性，且无毒无致病性等副作用，对于制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病的药物具有广泛的应用价值。
为了达到以上技术目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂，该生防菌剂包括利用耐盐短芽孢杆菌属中新菌种Brevibacillus halotolerans Z-9发酵获得，其中Brevibacillus halotolerans Z-9的活菌数不低于108CFU/mL。
本发明获得新菌种Brevibacillus halotolerans Z-9分离筛选自新疆图木舒克和阿拉尔棉花和红枣根际的土壤，并经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得的芽孢杆菌(Bacillus)范畴内属于耐盐短芽孢杆菌中一株典型的新菌种，该菌种耐盐短芽孢杆菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.15005，保藏日期：2017年12月04日。
上述菌种Brevibacillus halotolerans Z-9的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明中，Brevibacillus halotolerans Z-9的液体发酵培养基为：以质量比计，豆饼粉2.0％，酵母粉3.5％，糖蜜1.0％，NaCl 0.5％，余量为水，pH值为7.0。
同时，本发明提供一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将低温保存的菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans在TSA平板培养基上活化，挑取单菌落在TSA斜面培养基上，于30℃培养箱培养48h，即获得活化的菌株Brevibacillus halotolerans Z-9。
(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株Brevibacillus halotoleransZ-9接种100mL的TSA液体培养基中，在28-32℃、摇床转速为150-180r/min的条件下震荡培养14-16h，获得Brevibacillus halotolerans Z-9种子液，活菌含量不低于1×108cfu/mL，备用。
(3)将步骤(2)所得的Brevibacillus halotolerans Z-9种子液，按照质量体积比为0.5-1.5％的接种量接入到装有100mL液体发酵培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28-32℃，160-200r/min震荡培养48-72h，获得Brevibacillus halotolerans Z-9发酵液。
(4)检测步骤(3)所得发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时，将发酵液放入储罐中，加入质量比为0.1-0.3％的苯甲酸钠，调节pH值至6.0，其活芽孢数为1×108-1×109cfu/mL，即制备获得Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂。
本发明所述一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备方法，所述Brevibacillus halotolerans Z-9种子液的接种量为1％，发酵温度为29℃，发酵时间为56h。
本发明所述一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备方法，所述防腐剂苯甲酸钠按质量比0.2％的加入量加入。
本发明提供一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂在制备防治棉花黄萎病药物中的应用。
本发明提供一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂在制备防治枣果黑斑病药物中的应用。
通过实施本发明提供的上述具体技术方案实施本发明内容，可以得到以下有益效果：
(1)本发明提供一种新菌种Brevibacillus halotolerans Z-9，经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定及菌种的生理生化系统试验验证，证实获得的菌种编号为Z-9属于耐盐芽孢杆菌范畴内一种典型的新菌种，进而有必要进行按照法律要求的保藏。
(2)提供的Brevibacillus halotolerans Z-9及其制备的生防菌剂在制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病药物中应用，本发明提供的Brevibacillus halotolerans Z-9棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌抑菌圈直径分别为23.32mm和25.68mm，含有儿茶酚型铁载体，含异羟肟酸型铁载体为阴性，As/Ar比值最小值为0.682±0.021，产铁能力最高为“++”。Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂经大田试验，棉花黄萎病病情指数均有所降低，病情指数为7.14，对棉花黄萎病的防治效果最好，达78.07％；Brevibacillushalotolerans Z-9生防菌剂50倍稀释配施对枣果黑斑病的防治效果较好，病情指数降低至8.34，发病率抑制至9.58％，第3次施药后，防治效果高达78.07％，对于制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病药物中具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为菌株Z-9基于16S rDNA序列构建系统发育树图。
图2为菌株Z-9菌落形态图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
本发明中所采用的棉花黃萎病病原菌和枣果黑斑病病原菌均为常见菌株，公众可从为常见的菌株，可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)等其它公共渠道购买获得，选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的。
本发明采用Brevibacillus halotolerans Z-9的液体发酵培养基为：以质量比计，豆饼粉2.0％，酵母粉3.5％，糖蜜1.0％，NaCl 0.5％，余量为水，pH为7.0。
实施例1：Brevibacillus halotolerans Z-9的分离、筛选及鉴定
(一)分离、纯化
香梨花2016年采自新疆新疆图木舒克和阿拉尔棉花和红枣根际的土壤，取棉花和红枣根围土壤10g于90mL灭菌水中，150rpm震荡培养32min，制成悬浮液，然后取悬浮液1mL，置于9mL无菌水三角瓶中，以无菌水制备其105、106倍稀释液，在其中各取200ul，涂布TSA培养基平板，每个处理重复3次，将上述培养基置于30℃恒温培养2d，挑取单菌落转至LB培养基划线纯化，纯化菌株于-70℃甘油保存备用。
(二)分类、鉴定
Brevibacillus halotolerans Z-9(以下简称为“菌株Z-9”))16Sr DNA基因的序列测定与分析：
(1)PCR模板DNA的提取
将菌株Z-9接种于TSA培养基中，转速180r/min，30℃震荡培养10h，离心收集菌体，采用新型植物基因组DNA快速提取试剂盒进行基因组DNA提取。
(2)PCR扩增
16Sr DNA的PCR扩增引物：
正向引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
反向引物1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。
反应体系见表1：
表1：反应体系
组成 体积/μL
2XMix 25
27F 1
1492R 1
菌样模板 1
ddH<sub>2</sub>O 22
(3)序列测定
PCR扩增产物经电泳检测和纯化后测序，对菌株Z-9的16S rDNA进行测序，通过DNAstar软件拼接得到其16SrDNA的部分有序序列，其序列如SEQ ID NO:1所示，分别于GenBank进行BLAST同源序列检索(登录号为KP100051)，利用本领域常见采用的MEGA 5.0软件通过Neighbor-Joining方法建立系统进化树(重复抽样100次)，结果参见附图1。经比对分析发现，菌株Z-9的16Sr DNA基因序列与Brevibacillus halotolerans LAM0312(T)(登录号：KJ627768)的同源性最高，相似性为98.79％，以16Sr DNA基因序列构建的系统发育树中，菌株Z-9的16Sr DNA序列与Brevibacillus halotolerans strain LAM0313(登录号为：KT346371)的亲缘关系最近，置信度为98，表明菌株Z-9作为新菌种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性，通过菌种的相似性和同源性的综合判定，经过本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，证实获得的菌种编号为Z-9为芽孢杆菌(Bacillus)属耐盐芽孢杆菌范畴内一种典型的新菌种。
基于以上生物学特征，将上述菌株Z-9鉴定为Brevibacillus halotolerans分支中新菌种。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏日期：2017年12月04日，保藏号为CGMCC No.15005。
实施例2：Brevibacillus halotolerans Z-9生理生化特性测定
菌株Z-9在TSA培养基上生长良好，Z-9其在TSA培养基上培养2d后形态参见附图2所示，菌落边缘圆滑，菌落光滑，光滑，浅棕色，最佳生长温度28-34℃，在30℃的TSA培养基上培养2天后，直径为0.5-3.5mm，细胞呈革兰氏染色阳性，孢子形成杆状，宽度0.2-0.8μm，长度1.5-4.0μm，有周围鞭毛运动，最佳生长温度为30℃，pH为7.0-8.0。
菌株Z-9的生理生化特性情况如表2所示。
表2：菌株Z-9与其相关模式菌株之间生理生化的比较
Figure BDA0003309855210000081
菌株Z-9革兰氏阳性细菌，杆状，能利用阿拉伯糖，但不能利用纤维二糖，能够在没有氯化钠的情况下生长，并能耐受高达12％(w/v)的氯化钠。过氧化氢酶阳性，氧化酶阳性，并将硝酸盐还原为亚硝酸盐。细胞的沃格斯-普罗斯考尔试验呈阳性，但细胞的甲基红试验、蛋黄反应和硫化氢的产生呈阴性。酪蛋白和淀粉的水解反应均呈阳性。V-P试验、接触酶生理生化试验呈阳性，明胶水解试验和脲酶生理生化试验呈阴性，需盐性及耐盐性测试表明，pH值为7～8。通过对菌株Z-9的形态特征、生理生化特性测试，根据《芽孢杆菌属》和《微生物分类学》以及《常见细菌系统鉴定手册》进行分析，这些生理生化特性与革兰氏阳性菌芽孢杆菌具有较大的相似性，将菌株Z-9鉴定为Brevibacillus halotolerans新种。
综合16S rDNA基因的同源性对比分析以及生理化试验对比的结果，本发明提供的菌株Z-9与常见的耐盐短芽孢杆菌(Brevibacillus halotolerans)同属范围内菌种具有鲜明的区别，具有耐盐短芽孢杆菌同属内新菌种的特性。
实施例3：Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备
本实施例在实施例1-2的基础上，Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将低温保存的Brevibacillus halotolerans Z-9在TSA平板培养基上活化，挑取单菌落在TSA斜面培养基上，于30℃培养箱培养48h，即得活化的Brevibacillushalotolerans Z-9菌株。
(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株Brevibacillus halotoleransZ-9接种100mL的TSA液体培养基中，在28-32℃、摇床转速为150-180r/min的条件下震荡培养14-16h，获得Brevibacillus halotolerans Z-9种子液，活菌含量不低于1×108cfu/mL，备用。
(3)将步骤(2)所得的Brevibacillus halotolerans Z-9种子液，按照质量体积比为0.5-1.5％的接种量接入到装有100mL液体发酵培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28-32℃，160-200r/min震荡培养48-72h，获得Brevibacillus halotolerans Z-9发酵液。
(4)检测步骤(3)所得发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时，将发酵液放入储罐中，加入质量比为0.1-0.3％的苯甲酸钠，调节pH值至6.0，其活芽孢数为1×108-1×109cfu/mL，即制备获得Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂。
实施例4：Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备
本实施例在实施例1-3的基础上，提供一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备方法中，Brevibacillus halotolerans Z-9种子液接种量为1％，发酵温度为29℃，发酵时间为56h，防腐剂苯甲酸钠按质量比0.2％的加入量加入。
实施例5：Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备
本实施例在实施例1-3的基础上，提供一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备方法中，Brevibacillus halotolerans Z-9种子液接种量为0.5％，发酵温度为28℃，发酵时间为48h，防腐剂苯甲酸钠按质量比0.1％的加入量加入。
实施例6：Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备
本实施例在实施例1-3的基础上，提供一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备方法中，Brevibacillus halotolerans Z-9种子液接种量为1.5％，发酵温度为32℃，发酵时间为72h，防腐剂苯甲酸钠按质量比0.3％的加入量加入。
实施例7：Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备
本实施例在实施例1-3的基础上，提供一种Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的制备方法中，Brevibacillus halotolerans Z-9种子液接种量为1.2％，发酵温度为30℃，发酵时间为64h，防腐剂苯甲酸钠按质量比0.2％的加入量加入。
实施例8：Brevibacillus halotolerans Z-9对棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌的抑菌作用
(1)菌株Z-9对棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌的平板拮抗试验
采用平板抑菌法，将Brevibacillus halotolerans Z-9在TSA培养基上活化，然后移入50mL的TSA培养液中，在28℃下180rpm振荡培养2d备用，其含菌量不低于5.5×108cfu/mL。
用无菌接种环挑取保存在试管斜面上的大丽轮枝菌(Verticillium dahliaeKleb)和枣果黑斑病菌链格孢(Alternaria alternata)菌落，点接在PDA平板中央，置于恒温培养箱中培养7-10d后，用内径为5mm的打孔器在棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌平板上打孔，挑取15-20个已打孔的菌饼接种到装有已灭菌并冷却的200mL Czapek’s液体培养基的500mL三角瓶中，25℃、150r/min振荡培养7d，此即为棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌发酵母液。用移液器吸取0.5mL发酵母液移入装有4.5mL无菌水的试管中，吹吸数次使其混匀，即成10-1稀释液；吸取10-1稀释液0.5mL，移入装有4.5mL无菌水的试管中，吹吸数次使其混匀，即成10-2稀释液。吸取10-2稀释液0.1mL涂布在PDA培养基平板上，即为病原菌平板。
采用平板对峙法初筛拮抗细菌。把Brevibacillus halotolerans Z-9点接在病原菌平板上，每个平板点接5个，每个处理重复3次，静止20-30min后，置于25℃恒温培养箱中培养5-7d后，观察是否有抑菌圈产生，记录产生抑菌圈的菌株并测量其直径，结果参见表3所示。
表3：Z-9菌株抑菌试验结果
Figure BDA0003309855210000111
由表3结果可知，本发明提供的Brevibacillus halotolerans Z-9对棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌的抑菌圈直径分别为23.32mm和25.68mm，表明Brevibacillushalotolerans Z-9对棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌生长具有明显的抑制作用，在制备防治棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌药物中应用具有非常好的生防潜力。
(2)菌株Z-9细胞壁降解酶平板相关测试
细胞壁降解酶平板检测：按照培养制备检测培养基，倒板后放置2d，在几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶检测培养基上打直径6mm孔，用移液器取100μL拮抗菌发酵液置于孔中，NB培养基代替发酵液做对照，于30℃恒温培养48h，纤维素、葡聚糖检测培养基与培养基用10～15mL浓度为0.1％的刚果红溶液染色20min，反复经NaCl洗3次，用游标卡尺测量酶解圈直径大小，具体结果参见表4所示。
表4：酶解透明圈外径及方差分析
Figure BDA0003309855210000121
注：不同的字母代表同一种酶不同菌种间的差异显著(p<0.05)
由表4数据可知，几丁质酶，蛋白酶，葡聚糖酶，纤维素酶酶解透明圈大小分别为15.23mm，29.12mm，23.97mm和6.32mm。
(3)菌株Z-9细胞壁降解酶酶活测试
称取适量无水葡萄糖、N–乙酰氨基葡萄糖、L–酪氨酸放置于105℃烘箱内干燥至恒重，分别准确称取1.000g，配制成1mg/mL的葡萄糖标准液，1mg/mL N–乙酰氨基葡萄糖标准液，0.1mg/mL的L–酪氨酸标准液，建立细胞壁降解酶酶活标准曲线。
葡萄糖标准液加入量以0起始，0.1mL梯度递增到0.6mL，共7组样品，加入DNS溶液3.0mL，蒸馏水定容至10mL，建立葡萄糖标准曲线。N–乙酰氨基葡萄糖标准曲线的建立同上，N–乙酰氨基葡萄糖标准液起始加入量为0.25mL，0.05mL梯度递增，共7组样品，补充蒸馏水至1.5mL，加入1.5mLDNS定容为7.5mL，建立L–酪氨酸标准曲线。
底物在一定反应条件下(葡聚糖、几丁质、纤维素50℃下水浴30min，酪蛋白37℃水浴20min)与粗酶液反应30min生成1μg葡萄糖/酪氨酸为一个酶活单位。用0.1mol/L醋酸–醋酸钠缓冲液(pH 4.5)溶解0.5％胶体几丁质、0.5％CMC–Na、1％葡聚糖，用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH 7.5)溶解0.5％的酪素。DNS法测反应后葡聚糖含量，调至540nm波长处，记录样品OD值；福林–酚法测定反应后酪蛋白的量，调整至680nm波长处，记录OD值，均以灭活粗酶液代替粗酶液做对照。发酵原液稀释到10-5、10-6、10-7后涂布，于30℃恒温培养24h，统计分析细菌菌落数，测定葡聚糖酶、几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶活。
依据细胞壁降解酶酶活标准曲线，测定Brevibacillus halotolerans Z-9酶活大小分别为几丁质酶3.25IU/ml，蛋白酶16.82IU/ml，葡聚糖酶9.58IU/ml，纤维素酶6.23IU/ml。
(3)菌株Z-9产铁载体类型测试试验
取菌株Z-9发酵4d的MKB发酵液4mL，10000r/min离心10min保留上清液备用。Arnow法与高氯酸铁法鉴定铁载体类型。
取拮抗细菌备用上清液1mL，依次加入1mL浓度为0.5mol/L的HCl，1mL钼酸盐溶液(NaNO210 g，Na2MoO410 g，蒸馏水定容至100mL溶液)变黄，后加入1mL浓度为0.5mol/L的NaOH，溶液由黄变红并保持15min不变色，证明有儿茶酚型铁载体。
高氯酸铁试验检验异羟肟酸型铁载体，取Z-9备用上清液各0.5mL，加入2.5mL5mmol/L的高氯酸铁溶液，颜色变红则有异羟肟酸型铁载体，变黄则无。对照均为灭菌MKB液体培养基。
产铁载体能力判定：吸光度比值As/Ar每减少一个0.2增加一个“+”，对菌株产铁载体的能力进行划分，一般产铁载体能力较高(+++)的细菌其吸光度比值As/Ar低于0.5。
铁载体类型鉴定结果为：菌株Z-9出现变红现象且15min内颜色无变化，对照无变色，表明菌株Z-9含有儿茶酚型铁载体。高氯酸铁试验结果则表明菌株Z-9含异羟肟酸型铁载体为阴性。
在确定产铁载体的基础上，本试验进一步对菌株Z-9产铁载体能力进行检测，由表5数据可知，菌株Z-9的As/Ar比值最小值为0.682±0.021，产铁能力最高为“++”。
表5：Z-9菌株产铁载体能力直观表
Figure BDA0003309855210000141
实施例9：Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂在香梨花腐病菌防治中的应用
(1)对棉花黄萎病防效试验
试验时间、地点：2020年，新疆沙雅县
试验品种：棉花新陆中84号，大田试验棉花播种后随出苗水施入75L·hm-2的Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂，第二次、第三次分别随水施入75L·hm-2的Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂。以相邻不施药剂的棉花为对照，其余田管措施各处理均相同。滴灌施药方式全部采用移动加压滴灌模式，于滴水结束前约2h内进行，将菌剂加入到滴灌系统的配药箱中，随水滴入完成施药。对照分为清水对照组(CK)和常用药剂对照，清水对照以清水进行滴灌处理。
病情分级标准如下：
0级：长势良好未表现病症；1级：叶片轻度变黄；2级：叶片中度或严重变黄，萎蔫状；3级：植株萎蔫，叶片严重卷曲；4级：植株严重萎蔫，茎部维管束开始褐变；5级：整株枯萎，茎部维管束变为黄褐色，植株死亡，试验结果如表6所示。
防治效果(％)＝[(对照的病情指数－防治的病情指数)/对照的病情指数]×100％
表6：Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂对棉花黄萎病的大田防效结果
处理 发病率(％) 病情指数 相对防效(％)
Z-9 8.23 7.14 78.07
对照 39.56 32.56 --
由表6数据可知，清水(对照)处理的棉花黄萎病发病指数为32.56，而生防水剂滴灌处理后，棉花黄萎病病情指数均有所降低，其中生防菌剂施用后棉田的病情指数为7.14，对黄萎病的防治效果最好，达78.07％。
(2)对枣果黑斑病防效试验
试验方法试验时间、地点：2020年在新疆沙雅县
试验品种：骏枣；试验共设生防水剂处理,清水对照,每个处理设3次重复,共6个小区。每小区固定成龄树2株。本试验用喷雾器在8月中旬开始喷施1次Brevibacillushalotolerans Z-9生防菌剂50倍稀释液，以后9月上旬和9月下旬各施药一次，共计3次。施药时对整个植株均匀喷雾，以不流淌药液为准,试验期间水肥管理及农事操作正常进行。试验期间的日平均温度为31℃，相对湿度为68％。土壤为沙壤土，肥沃，施肥充足。
在10月上、中、下旬各调查一次，整个试验调查3次。每小区2株均调查，每株分左右两个方向调查2个枝条的全部果实，记录总果数、病果数、病斑数。分别计算各处理小区的防治效果。在施药期间，观察各处理对枣果有无药害产生，具体结果参见表7。
病害分级方法：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个果实面积5％以下；3级：病斑面积占整个果实面积6％～10％；5级；病斑面积占整个果实面积11％～20％；7级；病斑面积占整个果实面积20％以上。
病情指数及防治效果的计算方法为:病情指数＝[∑(各级病果数×相对级数值)/(调查总果数×9)]×100
防治效果(％)＝[∑(空白对照病指数-药剂处理病指数)/空白对照病指数]×100
表7：Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂对枣果黑斑病病的大田防效
处理 发病率(％) 病情指数 相对防效(％)
Z-9 9.58 8.34 78.07
对照 43.61 37.46 --
由表7数据可知，本发明提供的Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂稀释50倍喷施大田枣树，对枣果黑斑病的防治效果较好，且显著高于对照；第3次施药后，Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂的防治效果高达78.07％。
以上试验表明，从新疆图木舒克和阿拉尔棉花和红枣根际的土壤分离得到的Brevibacillus halotolerans Z-9，利用Brevibacillus halotolerans Z-9制备的生防菌剂，Brevibacillus halotolerans Z-9对棉花黄萎病菌和枣果黑斑病菌抑菌圈直径分别为23.32mm和25.68mm，含有儿茶酚型铁载体，含异羟肟酸型铁载体为阴性，As/Ar比值最小值为0.682±0.021，产铁能力最高为“++”。Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂经大田试验，棉花黄萎病病情指数均有所降低，病情指数为7.14，对黄萎病的防治效果最好，达78.07％；Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂50倍稀释配施对枣果黑斑病的防治效果较好，病情指数降低至8.34，发病率抑制至9.58％，第3次施药后，防治效果高达78.07％。表明本发明提供的Brevibacillus halotolerans Z-9及其制备的生防菌剂对棉花黄萎病和枣果黑斑病均有高防效，且无毒无致病性等副作用，对制备防治棉花黄萎病和枣果黑斑病药物具有广泛的应用价值。
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
序列表
<110> 新疆农业科学院微生物应用研究所（中国新疆—亚美尼亚生物工程研究开发中心）
<120> Brevibacillus halotolerans菌及其制备生防菌剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> Brevibacillus halotolerans Z-9(Brevibacillus halotolerans Z-9)
<400> 1
gggaaagccg gggggctata catgcagacg agcgagggtt atcggaccct agcggcggac 60
gggtgagtaa cacgtaggca acctgcctgt aagactggga taagataggg aaacatatgc 120
taataccgga tagagttttg cttcgcatga agcgaaacgg aaagatggcg caagctatca 180
cttgcagatg gggctgcggc ccattagcta gttggtgagg taaaggctca ccaaggcgac 240
gatgcgtagc cgacctgaga gggtgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtag ggaattttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc 360
cgcgtgaacg atgaaggctt tcgcgtcgta aagttctgtt gttagggaag aaacagtgcc 420
atttaaataa ggtggcacct tgacggtacc taacgagatt gccacggcta actacgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg 540
cgcaggtggc tatgtaagtc tgatgttaaa gcccggggct caacctcggt tcgcattgga 600
aactgcgtag cttgagtgca ggagaggaaa gtggtattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggcctgtaac tgacactgag 720
gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctagg tgttaggggt ttcaataccc ttagtgccgc agctaacgca ataagcactc 840
cgcctgggga gtacgctcgc aagagtgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaggaggt cttgacatcc 960
cactgaccgc tctagagata gagcttgcca tcggggcagt ggtgacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg acatgttggg ttaagtgccg caacgagcgc aacccttatc 1080
tttagttgcc agcattcagt tgggcactct agagagactg ccgtcgacaa gacggaggaa 1140
ggcggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctagacac gtgctacaat 1200
ggttggtaca acgggatgct acttcgcgag aagatgctaa tctcttaaaa ccaatctcag 1260
ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca cgacgggagt 1380
ttgcaacacc cgaagtcggt gaggtaaccg caaggagcca gc 1422

Claims (9)

1.一种菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂，其特征在于，该生防菌剂由属于耐盐短芽孢杆菌属中新菌Brevibacillus halotolerans Z-9经过发酵制备获得。
2.如权利要求1所述的一种菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂，其特征在于，所述Brevibacillus halotolerans Z-9的保藏编号为CGMCC No.15005。
3.如权利要求1所述的一种菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂，其特征在于，所述Brevibacillus halotolerans Z-9的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
4.如权利要求1所述的一种菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂，其特征在于，所述Brevibacillus halotolerans Z-9的液体发酵培养基为：以质量比计，豆饼粉2.0％，酵母粉3.5％，糖蜜1.0％，NaCl 0.5％，余量为水，pH值为7.0。
5.一种菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂的制备方法，其特征在于，该制备方法具体包括如下步骤：
(1)将低温保存的Brevibacillus halotolerans Z-9在TSA平板培养基上活化，挑取单菌落在TSA斜面培养基上，于30℃培养箱培养48h，即得活化的菌株Brevibacillushalotolerans Z-9；
(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株Brevibacillus halotolerans Z-9接种100mL的TSA液体培养基中，在28-32℃、摇床转速为150-180r/min的条件下震荡培养14-16h,获得Brevibacillus halotolerans Z-9种子液，活菌含量不低于1×108cfu/mL，备用；
(3)将步骤(2)所得的Brevibacillus halotolerans Z-9种子液，按照质量体积比为0.5-1.5％的接种量接入到装有100mL液体发酵培养基的三角瓶中进行摇瓶发酵，28-32℃,160-200r/min震荡培养48-72h，获得Brevibacillus halotolerans Z-9发酵液；
(4)检测步骤(3)所得发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的90％时，将发酵液放入储罐中，加入质量比为0.1-0.3％的苯甲酸钠，调节pH值至6.0，其活芽孢数为1×108～1×109cfu/mL，即制备获得Brevibacillus halotolerans Z-9生防菌剂。
6.如权利要求5所述的一种菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂的制备方法，其特征在于，Brevibacillus halotolerans Z-9种子液的接种量为1％，发酵温度为29℃，发酵时间为56h。
7.如权利要求5所述的一种菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中防腐剂苯甲酸钠按质量比0.2％的加入量加入。
8.一种如权利要求1所述菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂在制备防治棉花黄萎病药物中的应用。
9.如一种权利要求1所述菌种编号为Z-9的Brevibacillus halotolerans生防菌剂在制备防治红枣黑斑病药物中的应用。
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