CN111849843A - 暹罗芽孢杆菌b11在预防和/或治疗竹笋干枯病中的应用 - Google Patents

暹罗芽孢杆菌b11在预防和/或治疗竹笋干枯病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种暹罗芽孢杆菌B11在预防和/或治疗竹笋干枯病中的应用。分离得到的暹罗芽孢杆菌B11菌株对竹笋干枯病有特效，对环境适宜性强、亲和性好，适于商品化生产，符合可持续发展的战略要求，具有广阔的市场前景。

Description

暹罗芽孢杆菌B11在预防和/或治疗竹笋干枯病中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种暹罗芽孢杆菌B11在预防和/或治疗竹笋干枯病中的应用。
背景技术
由Anthostomella sp.、Ascotremellopsis sp.、Cercosporidium sp.引起的竹笋干枯病主要危害嫩笋，严重时亦使半成竹或幼竹发病，竹笋成片死亡。竹笋干枯病在苦竹Pleioblastus amarus(Keng)keng、水竹Phyllostachys heteroclada Oliver、白夹竹Phyllostachys bissetii(McClure)、方竹 Chimonobambusa quadrangularis(Fenzi)Makino等品种竹笋均有发现，发病初期在笋上生椭圆形至不规则病斑，病部失去正常的鲜色，逐步发展，幼笋变褐坏死干缩，致最后干枯，病笋笋壳一般较易剥下，笋茎易折断，发病后田间的病土、病死的幼笋或笋壳可再侵染。高温高湿有利其发病，阴雨天多、田间积水、土壤湿度高、偏施氮肥，竹株生长弱则易发病。出笋期雨后及时排水，防止湿气滞留，发现病株及时清除，病穴用以上药液喷淋后用净土压实。不用病株附近的土壤培土和施用未腐熟的沤肥，减少人为传病。重病地块种植后和培土后出笋前喷浇20％萎锈灵乳油2000倍液，或5％井冈霉素水剂1000倍液、2％春雷霉素水剂800倍液、50％甲基立枯磷可湿性粉剂1000倍液、30％苯噻氰乳油1500倍液、30％苯甲丙环唑乳油3000倍液。但目前并未见采用暹罗芽孢杆菌预防和/或治疗竹笋干枯病的报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis，该暹罗芽孢杆菌命名为B11，于2020年6月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19894，该暹罗芽孢杆菌B11可有效预防和/或治疗竹笋干枯病。
当将暹罗芽孢杆菌B11用于预防和/或治疗竹笋干枯病时，可以将暹罗芽孢杆菌B11做成生物制剂，如液态制剂，具体为将暹罗芽孢杆菌B11制成液体发酵液，直接喷洒于竹笋易形成干枯病的部位即可。或者将暹罗芽孢杆菌B11制成固体制剂，具体为：先将其制成液体发酵液，再与辅料混合，制成暹罗芽孢杆菌B11纳米缓释剂。
进一步地，发酵液和辅料的重量比为100:8-20；优选发酵液和辅料的重量比为10：1。
辅料包括保护剂、防冻剂和缓释胶液，保护剂、防冻剂和缓释胶液的重量比为0.5-3:5-10:4-6；优选保护剂、防冻剂和缓释胶液的重量比为2：8： 4.5。
当采用上述组分作为辅料时，暹罗芽孢杆菌B11纳米缓释剂的具备制备过程为：将暹罗芽孢杆菌B11先制成发酵液，将发酵液与保护剂、防冻剂充分混匀后，加入缓释胶液进行固化，然后再依次经过过滤、低温冷冻干燥、吸附载体吸附、干燥即得纳米缓释制剂。
进一步地，保护剂为保护剂为腐殖酸；防冻剂为聚乙二醇；缓释胶液为阿拉伯胶和玉米淀粉按重量比为3.5:1混合的混合物；吸附性载体为凹凸棒石。
进一步地，暹罗芽孢杆菌B11纳米缓释剂中暹罗芽孢杆菌B11的活芽孢的含量不低于1×109cfu/g。
本发明具有以下有益效果：
本发明将暹罗芽孢杆菌B11用于预防和/或治疗竹笋干枯病，有良好防效，50倍稀释液在不同程度竹笋干枯病发生区内的防治效果超过80％，可基本上控制病害蔓延，防治效果随稀释倍数的增加而降低，稀释1600-2400 倍时防效差异较大。总的来看，病害发生在10％以下，800倍液为经济浓度，病害发生较轻时，400倍液为经济浓度，病害中等程度发生时，200倍液为经济浓度，病害发生大于60％时，经济浓度为100倍。
此外，采用本发明方法制得的缓释剂不但菌含量高，还能有效避免高温、氧气、酸性环境对芽孢杆菌的胁迫，且缓慢释放，有效延长芽孢杆菌残效期。
附图说明
图1为基于16S rDNA序列构建的菌株B11的系统发育树。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1暹罗芽孢杆菌B11的分离与鉴定
1、暹罗芽孢杆菌B11的分离
本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11菌株于2017年6月15 日采用平板稀释涂布法分离于四川宜宾竹栽培区根际土，具体为将采回的土壤样本用无菌水稀释，稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5共5个梯度，分别吸取100μL 10-3，10-4，10-5这3个梯度土壤稀释液，分别涂布NA平板(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min)，每个处理3次重复，27℃培养48h，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。
依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于 4℃保藏备用。按五点对峙法，在PDA平板中心接种直径5mm竹笋干枯病病原菌菌饼，四周等距离接种上述待筛选菌株，25℃恒温培养，每个处理3 个重复。根据各筛选菌产生的抑菌圈的大小确定拮抗程度(表1、表2和表 3)，效果优良的菌株为B11(编号11)。
表1内生细菌对竹笋干枯病菌(Anthostomella sp.)的抑制作用
编号 抑菌圈(mm) 编号 抑菌圈(mm)
1 0 9 0
2 0 10 4.0
3 5.5 11 20.2
4 0 12 0
5 11.0 13 0
6 10.5 14 0
7 0 15 5.8
8 0 16 6.9
表2内生细菌对竹笋干枯病菌(Ascotremellopsis sp.)的抑制作用
编号 抑菌圈(mm) 编号 抑菌圈(mm)
1 0 9 0
2 3.6 10 4.0
3 0 11 19.2
4 0 12 0
5 0 13 5.2
6 0 14 0
7 8.0 15 0
8 0 16 0
表3内生细菌对竹笋干枯病菌(Cercosporidium sp.)的抑制作用
编号 抑菌圈(mm) 编号 抑菌圈(mm)
1 0 9 0
2 0 10 0
3 0 11 18.8
4 0 12 0
5 0 13 0
6 6.6 14 0
7 0 15 0
8 0 16 0
2、暹罗芽孢杆菌B11的鉴定
在NA平板培养基上培养了2天的B11菌株的单菌落呈乳白色，圆形，表面粗糙，边缘波纹状，不透明，无粘性。
除上述形态学观察，还结合了生理生化指标(表4)和分子生物学鉴定该内生菌B11为暹罗芽孢杆菌。
表4菌株B11生理生化指标
Figure BDA0002643772250000051
分子生物学鉴定(16S rDNA)：通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳，回收产物送至生物技术公司测序；将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析，并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较，再用Mega4.0软件中的邻接法构建系统发育树，确定B11菌株在微生物系统发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为688bp的DNA片段(如 SEQ ID NO.1所示)，将B11菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析，选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列，并用 Clustalx软件进行多重匹配排列分析，用Mega分析软件构建系统发育树，构建的系统发育树见图1。由图1可知，B11(MT482698)菌株与MT052693 以99％的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支，而与其他芽孢杆菌相距较远，表明B11与Bacillus siamensis的亲缘关系最近。
基于以上特征，所述菌种其分类命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11，已于2020年6月1日保藏在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19894。
实施例2暹罗芽孢杆菌B11纳米水剂的制备
将暹罗芽孢杆菌B11，经过发酵，固化，干燥，制成纳米缓释剂，具体包括以下步骤：
(1)发酵：将暹罗芽孢杆菌斜面种子接种于液体培养基中，初始接种量为4％，然后于25℃，200r/min，通气量100L/h条件下震荡培养46h；
其中，液体培养基中含有以下重量百分比的组分：0.1％纳米二氧化硅、 2％葡萄糖、0.11％黄豆粉、0.1％氯化钾和0.05％硫酸镁，其余为无菌水，液体培养基pH值为7.0。
(2)制备纳米水剂：向上述发酵液中加入腐殖酸、聚乙二醇，混匀，然后加入阿拉伯胶和玉米淀粉进行固化，然后依次经过过滤、低温冷冻干燥、吸附载体凹凸棒石吸附、干燥即得纳米缓释制剂；其中腐殖酸、聚乙二醇、阿拉伯胶和玉米淀粉占发酵液的重量百分比分别为2％、8％、3.5％、1％。
上述制得的暹罗芽孢杆菌B11纳米缓释剂进行袋装后，常温保存1.5年或低温(4℃)保存3年不影响预防和治疗效果。
实施例3竹笋干枯病的预防与治疗实验
制备暹罗芽孢杆菌B11纳米缓释剂稀释液：取1g实施例2制得的暹罗芽孢杆菌B11纳米缓释剂，分别用无菌水进行50倍、100倍、200倍、400 倍、800倍、1600倍和2400倍稀释，制成稀释液，其芽孢含量分别为2× 107cfu/ml、1×107cfu/ml、5×106cfu/ml、2.5×106cfu/ml、1.25×106cfu/ml、 6.25×105cfu/ml、4.17×105cfu/ml。
在竹笋栽培地中，经调查及病原鉴定，干枯病由Anthostomella sp.、Ascotremellopsis sp.、Cercosporidium sp.引起，按照干枯病发生程度分为4个发生区(I：5-10％；II：11-30％；III：31-60％；Ⅳ：>60％)。在4-5月，用上述制得的稀释液采用喷雾法对竹笋进行处理，沿表面均匀喷雾，每株100mL，每十天喷洒一次，并以无菌水作对照，重复3次，统计竹笋发病情况。每处理20株。
30天后观察发病情况，进行病害调查统计，并计算发病率，病情指数和防治效果，记录如表4。
发病率(％)＝(病株数/株数总和)×100；
病情指数＝[∑(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最重级的代表值] ×100；
防治效果(％)＝[(对照病情指数增长率-处理病情指数增长率)/对照病情指数增长率]×100。
表5 B11缓释剂对竹笋干枯病的田间防治效果
浓度 I(5-10％) II(11-30％) III(31-60％) Ⅳ>60％
50 96.1a 95.7a 85.1a 80.4a
100 94.7a 91.6b 79.2b 70.2b
200 88.1b 85.2c 71.2c 51.1c
400 85.5b 73.2d 61.1d 40.8d
800 72.1c 60.5e 39.1e 20.5e
1600 52.1d 42.1f 19.5f 8.8f
2400 20.1e 12.3g 9.2g 1.2g
由表5可知，在B11纳米缓释剂防治竹笋干枯病试验中发现，生防菌对竹笋干枯表现出良好的防治效果。50倍稀释液在四类发生区内的防治效果超过80％，可基本上控制病害蔓延，防治效果随稀释倍数的增加而降低，稀释 1600-2400倍时防效差异较大。总的来看，病害发生在10％以下，800倍液为经济浓度，病害发生10-30％时，400倍液为经济浓度，病害发生30-60％时，200倍液为经济浓度，大于60％时，经济浓度为100倍。总的来看，本发明分离得到的暹罗芽孢杆菌B11菌株对竹笋干枯病有特效，对环境适宜性强、亲和性好，适于商品化生产，符合可持续发展的战略要求，具有广阔的市场前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 暹罗芽孢杆菌B11在预防和/或治疗竹笋干枯病中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 688
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420
gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtacagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgagt 688

Claims (10)

1.暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11在预防和/或治疗竹笋干枯病中的应用，所述暹罗芽孢杆菌B11于2020年6月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.19894。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11制成液体制剂或固体用于预防和/或治疗竹笋干枯病。
3.一种预防和/或治疗竹笋干枯病的制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11。
4.根据权利要求4所述的预防和/或治疗竹笋干枯病的制剂，其特征在于，所述制剂为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11液体发酵液。
5.根据权利要求3所述的预防和/或治疗竹笋干枯病的制剂，其特征在于，所述制剂为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11纳米缓释剂。
6.根据权利要求5所述的预防和/或治疗竹笋干枯病的制剂，其特征在于，所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11纳米缓释剂中暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11的活芽孢的含量不低于1×109cfu/g。
7.权利要求5或6所述的预防和/或治疗竹笋干枯病的制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11制成液体发酵液，然后与辅料混合，依次经固化、过滤、吸附载体吸附、干燥，制得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，发酵液和辅料的重量比为100:8-20。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，辅料包括保护剂、防冻剂和缓释胶液；保护剂、防冻剂和缓释胶液的重量比为0.5-3:5-10:4-6。
10.采用权利要求3-6任一项所述的制剂预防和/或治疗竹笋干枯病的方法，其特征在于，将制剂稀释后喷洒在竹笋表面即可。
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CN111925963A (zh) * 2020-08-21 2020-11-13 四川农业大学 暹罗芽孢杆菌b11在预防和/或治疗绵竹枯梢病中的应用

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