CN107629970B - 一种用于防治人参红皮病的微生物及应用 - Google Patents
一种用于防治人参红皮病的微生物及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于防治人参红皮病的微生物，保藏编号为CGMCC No.14628，是从吉林省通化市平地参土壤中分离获得的，在制备用于防治人参红皮病的制剂方面具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，尤其是一株用于防治人参红皮病的微生物及应用。
背景技术
人参(包括西洋参)红皮病在中国、韩国、北美等世界人参种植区域都普遍发生，。发病轻者为10％-30％，重者达80％以上，严重影响人参品质和产量。红皮病发病较轻的人参，参根表皮呈现不规则的、颜色深浅不一的红色病斑，无规律地分布于整株人参根表皮上；发病较重的人参，整根周皮全部变色，病斑颜色深，表皮粗糙，出现裂缝甚至出现腐烂现象。患病人参植株地上部分萎蔫或不萎蔫。人参红皮病的发生会导致人参总皂苷、总氨基酸、必需氨基酸、粗淀粉、总糖等物质的含量下降，严重影响人参品质和等级，从而影响其销售价格，所以人参红皮病的发生给参农造成巨大的经济损失。
关于人参红皮病的发病机理国内外学者存在2种观点：一是认为人参红皮病为生理性病害，主要与土壤理化性质有关；二是认为人参红皮病为侵染性病害：主要与土壤微生物的入侵有关。根据本课题组研究表明该病主要由致病微生物Ilyonectria属导致。
目前，人参红皮病的防治主要通过田间管理、化学方式和生物方式。传统的田间管理包括轮作、整地、撒施生石灰、控制光照、湿度、肥水等。化学防治作为人参病害的重要防治手段之一，主要是使用杀菌剂或抗生素等农药对土壤、种子、苗或根进行处理。生物防治通过施用微生物菌剂，利用微生物的寄生、竞争和拮抗等方式抑制病害菌繁殖。
传统的田间管理在一定程度上可以减少病害菌，降低该病发生，但是不能从根本上控制病害的发生。特别是发病严重地区，仅仅田间管理对该病不能有效防控。化学防治具有见效快、效果明显等特点，但是对已发红皮病人参并没有明显的治疗作用，且长期使用化学农药易造成农药残留、环境污染、产生抗药性等问题。生物防治方面在我国人参种植区虽然存在一些微生物菌剂，但针对人参红皮病的微生物菌剂仍然缺乏。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一株用于防治人参红皮病的微生物。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述温度敏感型菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一株用于防治人参红皮病的微生物，保藏编号为CGMCC No.14628。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物，具有序列表<400>1所示序列(ITS区序列)。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物，是从吉林省通化市平地参土壤中分离获得的。
上述用于防治人参红皮病的微生物在制备用于防治人参红皮病的制剂方面的应用。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物的应用，所述制剂为包含有效量上述微生物的微生物菌剂。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物的应用，每1g或1mL的微生物菌剂中含有上述微生物的含量为106-109CFU。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物的应用，每1g或1mL的微生物菌剂中含有上述微生物的含量为107-108CFU。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物的应用，所述微生物菌剂是由下述方法制备得到的：
(1)将上述微生物在活化培养基中接种并培养得到活化菌种；
(2)将步骤(1)所得活化菌种转接至发酵培养基中培养，得到发酵后的菌液；
(3)将步骤(2)得到的菌液直接灌装，即为液体菌剂；或
经过惰性载体吸附、烘干和粉碎，得到菌种的粉状制剂。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物的应用，所述步骤(1)中菌种的活化培养条件及培养后菌种状态没有特别的限制，可以为菌种培养过程中常用条件，例如，培养温度为25-30℃，培养时间为36-96h；在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如，显微镜观察确定活化菌种的状态。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物的应用，所述步骤(1)中活化培养基可以为常规的能够培养霉菌的培养基，例如包括但不限于PDA培养基。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物的应用，所述步骤(2)中发酵的条件和发酵后的物料中的活菌浓度没有特别的要求，可以为菌种发酵过程中常用的条件和浓度，步骤(2)中发酵时间为36-96h，温度25-30℃，该发酵条件下使得发酵后的物料中的活菌浓度为(1-100)×108CFU/mL。
优选的，上述用于防治人参红皮病的微生物的应用，所述步骤(2)中发酵培养基可以为常规的能够发酵扩大菌体数目的液体培养基，例如所述液体培养基为葡萄糖，蔗糖或糖蜜的至少一种做为碳源；豆粕粉，酵母粉，玉米粉的至少一种作为氮源；所述液体培养基还含有0.1-0.5％磷酸氢二钾、0.01-0.05％硫酸镁、0.01-0.05％氯化钠，以补充微生物快速生长时所需的无机盐。
上述微生物菌剂的应用方式为：田间施用——整地过程中将菌剂按50-100倍稀释液对畦面进行喷洒，然后按照常规方法种植；种子种植或参根移栽可按照10-50倍稀释液进行浸种或浸根处理；对种植出芽后或发病区域使用50-100倍稀释对人参进行灌根处理。
本发明的有益效果是：
所述用于防治人参红皮病的微生物分离自人参种植区土壤，是针对人参红皮病病害菌进行开发筛选的微生物，对人参红皮病致病菌Ilyonectria属有很好的抑制效果，其在实验室条件培养皿中下能够显著并长期(30天)的抑制人参红皮病病害菌的生长，大田实验实验表明该菌株对人参红皮病表现出良好的防治功能，用于制备的微生物菌剂对于人参红皮病具有较好的预防和治疗效果，具有针对性强、绿色环保、作用时效长的特点，对减少人参病害，减少农药使用、降低农残，提高参农收入，促进人参产业绿色健康发展中有重要的应用价值。
保藏信息
分类名词：拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2017年10月18日
保藏号：CGMCC No.14628
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
一株用于防治人参红皮病的微生物的筛选与鉴定
从人红皮病害发病率低的人参种植区进行根际土壤随机取样。对土样使用无菌水进行梯度稀释。将稀释后溶液在固体PDA培养基(6g马铃薯浸粉，20g葡萄糖，0.25g氯霉素，20g琼脂和水配成1L，pH6.8-7.0，灭菌后倒入培养皿中)中进行涂布。然后放置在25℃培养箱中培养7天。对生长的菌落进行分离纯化，然后对纯化的菌株进行人参红皮病害菌的平板对峙实验。挑选对峙效果明显的菌株进行鉴定。即得本专利中菌株。
该菌株在25℃培养3天菌落可生长至满皿。生长初期菌落呈白色、丝状。生长后期菌落呈现为绿色。显微镜下，分生孢子梗具有明显的主轴；可育分枝沿主轴长度方向依次产生，一般对生，分生孢子梗顶端分枝少，分枝之间距离较大；分生孢子簇生，椭圆形，深绿色。厚坦孢子端生或间生，球形或亚球形。
提取该菌株基因组DNA，利用ITS1/ITS4引物对菌株进行rDNA-ITS区序列进行扩增并测序。将测得有效序列在GenBank数据库中进行nucleotide blast比对，与Trichodermakoningiopsis strain TJG40(J652467.1)株相似性100％，初步鉴定为Trichodermakoningiopsis。
实施例2
将保藏的实施例1所述拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)接种到活化培养基PDA培养基(6g马铃薯浸粉，20g葡萄糖，20g琼脂和水配成1L，pH6.8-7.0，灭菌后倒入培养皿中)上，在27℃培养96h。将活化好的斜面木霉菌菌种接种至灭菌的液体发酵培养基(以重量计，含有2％葡萄糖，1％蛋白胨，0.6％马铃薯浸粉，0.05％的MgSO4)，27℃培养4天，至90％菌丝都形成厚垣孢子，得到拟康宁木霉菌液。
将5L上述菌液进行离心，收集湿菌体，低温保存。并利用平板培养计数法检测活菌数量，所得到的湿菌体即为微生物菌剂。
对比例
本对比例参照实施例2中方法制备菌剂，并将商品号为ACCC 10166的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和商品号为ACCC 03221的枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)作为对比菌剂，并按照以下方法制备：
将保藏解淀粉芽孢杆菌接种到活化培养基NA培养基(牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂20g和水配成1L，pH值7.0±0.1，灭菌后倒入培养皿中)上，在37℃培养24h。将活化好的解淀粉芽孢杆菌菌种接种至灭菌的液体发酵培养基(以重量计，含有2％葡萄糖，1％酵母粉，1％蛋白胨，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4，pH值7.0±0.1)，37℃培养48小时，至90％菌体都形成芽孢，得到解淀粉芽孢杆菌菌液。
将保藏的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种到活化培养基NA培养基(牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂20g和水配成1L，pH值7.0±0.1，灭菌后倒入培养皿中)上，在37℃培养24h。将活化好的枯草芽孢杆菌菌种接种至灭菌的液体发酵培养基(以重量计，含有2％葡萄糖，1％酵母粉，1％蛋白胨，0.15％K2HPO4，0.15％MgSO4，pH值7.0±0.1)，37℃培养48小时，至90％菌体都形成芽孢，得到枯草芽孢杆菌菌液。
测试实施例
本测试实施例在田间试验中测定本发明实施例2所述微生物菌剂在防治人参红皮病病中的效果。所使用人参的拉丁学名为Panax ginseng C.A.Mey.。
试验田位于吉林省通化市大泉源满族朝鲜族乡爱国村，两年生人参苗，红皮病病情指数20-30。设置实施例2制备得到的各微生物菌剂及空白对照7个处理，试验小区面积8m2，随机排列。将各菌剂用清水进行稀释(解淀粉芽孢杆菌106CFU/mL，枯草芽孢杆菌106CFU/mL，拟康宁木霉105CFU/mL)。对每个小区中的人参苗进行灌根处理，每小区人参苗200株。以同等重量清水灌根处理作为对照。田间管理常规。4个月后调查人参红皮病发病情况。人参红病病情分为5个级别，0级：参根无红皮病斑；1级：参根红皮病斑占表面积25％以下；2级：参根红皮病斑占表面积26％-50％；3级：参根红皮病斑占表面积51％-75％；4级：参根病斑占表面积76％以上。病情指数＝∑(发病级别代表值×该级的株数)/(发病最重级别代表值×总株数)×100；防治效果＝(对照病情指数-处理情指数)/对照病情指数×100％。结果如表1所示。
表1测试实施例1各处理病情指数与防治效果
通过表1的数据可见，三株微生物菌剂都对人参红皮病具有不同程度防治效果，其中拟康宁木霉菌防治效果大于90％，效果最为突出。
上述参照实施例是对该一株用于防治人参红皮病的微生物及应用的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种用于防治人参红皮病的微生物及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 604
<212> DNA/RNA
<213> 用于防治人参红皮病的微生物(Trichoderma)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(604)
<400> 1
gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt accgagttta caactcccaa 60
acccaatgtg aaccatacca aactgttgcc tcggcggggt cacgccccgg gtgcgtcgca 120
gccccggaac caggcgcccg ccggagggac caaccaaact ctttctgtag tcccctcgcg 180
gacgttattt cttacagctc tgagcaaaaa ttcaaaatga atcaaaactt tcaacaacgg 240
atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 300
agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagta ttctggcggg 360
catgcctgtc cgagcgtcat ttcaaccctc gaacccctcc ggggggtcgg cgttggggat 420
cgggaacccc taagacggga tcccggcccc gaaatacagt ggcggtctcg ccgcagcctc 480
tcctgcgcag tagtttgcac aactcgcacc gggagcgcgg cgcgtccacg tccgtaaaac 540
acccaacttc tgaaatgttg acctcggatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata 600
tcaa 604
Claims (8)
1.一种用于防治人参红皮病的微生物在制备用于防治人参红皮病的制剂方面的应用；所述的微生物菌株是保藏编号为CGMCC No. 14628 的拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis) 菌株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制剂为包含有效量权利要求1所述微生物的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：每1g或1mL的微生物菌剂中含有微生物的含量为106-109CFU。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述微生物菌剂是由下述方法制备得到的：(1)将权利要求1中所述微生物在活化培养基中接种并培养得到活化菌种； (2)将步骤(1)所得活化菌种转接至发酵培养基中培养，得到发酵后的菌液；(3)将步骤(2)得到的菌液直接灌装，即为液体菌剂；或经过惰性载体吸附、烘干和粉碎，得到菌种的粉状制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)中菌种的活化培养条件为：培养温度为25-30℃，培养时间为36-96h。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)中活化培养基为PDA培养基。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中发酵时间为36-96h，温度25-30℃，该发酵条件下使得发酵后的物料中的活菌浓度为(1-100)×108CFU/mL。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中发酵培养基为液体培养基：葡萄糖，蔗糖或糖蜜的至少一种作为碳源；豆粕粉，酵母粉，玉米粉的至少一种作为氮源；所述液体培养基还含有0.1-0.5％磷酸氢二钾、0.01-0.05％硫酸镁、0.01-0.05％氯化钠，以补充微生物快速生长时所需的无机盐。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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