CN105586274A - 拟康宁木霉t-51菌株及其在番茄促生和灰霉病生物防治的应用 - Google Patents

拟康宁木霉t-51菌株及其在番茄促生和灰霉病生物防治的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株拟康宁木霉T-51菌株及其在番茄促生和灰霉病生物防治的应用。本发明的拟康宁木霉T-51，保藏编号为：CCTCCNO：M？2015729，分离自湖北省武汉市油菜田土壤中。拟康宁木霉T-51主要用于番茄幼苗的促生及番茄灰霉病的生防防治。拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液能够显著促进番茄种子萌发，促进番茄幼苗生长，抑制番茄灰霉病。拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液能够抑制灰霉菌丝生长。拟康宁木霉T-51菌株在PDA上生长产生的挥发性物质能够抑制灰霉菌丝生长、分生孢子萌发和灰霉孢子对番茄果实侵染。

Description

拟康宁木霉T-51菌株及其在番茄促生和灰霉病生物防治的应用
技术领域
本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体地指一种拟康宁木霉T-51菌株及其在番茄促生和灰霉病生物防治的应用。
背景技术
木霉菌是广泛存在于自然界的一种真菌。木霉菌(Trichodermaspp.)属于半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科。木霉菌广泛存在于土壤、根围、叶围、种子等生态环境中，也是一种优良的生防菌。由于木霉菌的广泛适应性、广谱性和多机制性，因此该菌一直是植物病害生物防治研究的重点对象。
番茄灰霉病是由灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)引起的重要病害，在保护地生产中危害尤为严重。长期以来，灰霉病防治主要依赖于化学药剂。但由于病菌抗药性迅速产生，并且化学药剂的过量使用严重污染农产品和生态环境，危及人畜健康。因此，近年来生物防治正日益成为灰霉病防控中的一条重要的途径。
发明内容
本发明的目的是提供了一种拟康宁木霉T-51菌株及其在番茄促生和灰霉病生物防治的应用。
为实现上述目的，本发明提供的一株拟康宁木霉T-51菌株，其特征在于：菌株为拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)T-51，其保藏编号为：CCTCCNO：M2015729。该菌株分离自湖北武汉地区油菜田土壤中。T-51菌株通过分子水平上ITS序列的测定，在木霉鉴定网站(http://www.isth.info/)上鉴定为拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)。因此将菌株T-51定名为拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)T-51。
该菌种已于2015年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCCM2015729；保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。
进一步地，所述拟康宁木霉T-51菌株置于葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养一周，菌丝发达、产生大量气生菌丝，产生蓬松茂密的产孢簇，呈浅绿色至深绿色，无可溶性色素，无明显气味，最适生长温度为24～30℃，光照条件有利于其生长和产孢。
本发明提供了一种拟康宁木霉T-51菌株促进番茄种子萌发和幼苗生长的用途，将番茄种子在拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液中浸种1～2小时，用于促进番茄种子萌发及幼苗生长。
本发明还提供了一种拟康宁木霉菌株T-51防治番茄灰霉病的应用，使用拟康宁木霉菌株T-51分生孢子悬浮液抑制灰霉在番茄死体叶片上产孢，以及接种在番茄根际土壤中防治番茄叶片灰霉病。
本发明提供了一种拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到的拟康宁木霉T-51菌株菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养；
3)在步骤2)的培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液。
进一步地，所述步骤1)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天；
所述步骤2)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天。
其中，PDA培养基的配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉11g,补充蒸馏水至1000ml。
PDA制作方法：将洗净后去皮的马铃薯切片，加水800ml煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖20g，将11g琼脂粉加200ml水搅拌均匀，加入上述溶液中，再加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌。
本发明提供了一种利用拟康宁木霉T-51菌株制备抑制番茄灰霉病菌生长速率的滤液的方法，包括以下步骤：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到拟康宁木霉T-51菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养，得到培养物；
3)将步骤2)得到的培养物离心，取离心上清液经滤纸过滤，得到的初级滤液经细菌过滤器再次过滤，得到滤液。
其中，PDB液体培养基的配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至1000ml。
PDB制作方法：将洗净后去皮的马铃薯切片，加水1000ml煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖20g，加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌。
进一步地，所述步骤1)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天；所述步骤2)中，培养条件为在温度为25℃、150r/min的条件下振荡培养7d。
本发明还提供了一种拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对番茄灰霉病抑制的应用，所述挥发性物质在密闭条件下抑制灰霉菌丝生长、孢子萌发，以及防治番茄果实灰霉病。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液对番茄种子萌发和番茄幼苗生长的促进作用，以及对番茄灰霉病的抑制作用。
2)本发明的拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对灰霉菌丝生长的抑制作用。
3)本发明的拟康宁木霉T-51菌株在PDA上生长产生的挥发性物质对灰霉菌丝生长、分生孢子萌发和灰霉孢子对番茄果实侵染的抑制作用。
附图说明
图1为拟康宁木霉T-51菌株的菌落形态(PDA，20℃,7d)；
图2为拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液浸种对番茄种子萌发的促进作用；
图3为拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液浸种对番茄幼苗生长的促进作用；
图4为拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液处理对灰霉在番茄死体叶片上产孢的抑制作用；
图5为拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液接种番茄根际土壤对番茄叶片灰霉病的防治效果；
图6为拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对灰霉菌丝生长的抑制作用；
图7为拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对灰霉菌丝生长的抑制作用；
图8为拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对灰霉孢子萌发芽管生长的抑制作用；
图9为拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对番茄果实灰霉病的防治作用。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1拟康宁木霉T-51菌株的分离及鉴定
一、菌株的分离
微生物是在湖北武汉地区油菜田土壤中分离的一株拟康宁木霉菌株。其分离方法为：取0.1g样品土壤，加100mL无菌水，充分震荡混匀后取100μL土壤悬浮液涂布于添加了乳酸的PDA培养基上，吹干后，置于20℃培养。待平板上长出真菌菌落后，根据木霉的形态特征，挑出菌丝生长速度较快，产生绿色产孢簇的菌落。分离的木霉菌株使用平板稀释法进行单孢纯化：分离的菌株在PDA上生长7天后，用无菌水洗下孢子，在血球计数板上计算孢子浓度，并用无菌水稀释至3×102个孢子/mL的孢子液，取100μL孢子液涂于PDA平板上，使每个平板上的孢子数量大约在30个左右，以便于分离单孢。平板吹干后，在20℃下培养48h，挑取单菌落，即为纯化菌株(图1)。
二、菌株的鉴定
将上述木霉鉴定是基于ITS序列的DNA条形码系统进行鉴定。通过引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对菌株的总DNA进行PCR扩增，在木霉鉴定网站(http://www.isth.info/)的TrichOKey工具进行比对鉴定，鉴定结果为拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)，即为拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)T-51，其保藏编号为：CCTCCNO：M2015729。
实施例2：拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液对番茄种子萌发及幼苗生长的促进作用
一、拟康宁木霉T-51菌株的分生孢子悬浮液对番茄种子萌发的促进作用
供试番茄品种为合作903(番茄大王)。将番茄种子在5×106个孢子/mL拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液中浸种1小时后，均匀摆在铺有双层湿润滤纸的9mm培养皿中，每皿摆10粒种子，以清水浸种作为对照，每个处理重复三个皿。将摆有种子的培养皿放在28℃，16h光照条件下，每日按需向培养皿中喷水保湿。7天后，测量每一粒种子的胚根长度、下胚轴长度，并统计每个处理的种子萌发率，根据以下公式计算种子活力指数：种子活力指数＝萌发率×(胚根长度+下胚轴长度)。本试验共重复三次(图2)。
二、拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液对番茄幼苗生长的促进作用
供试番茄材料：合作903(番茄大王)。试验时间为2014年3月20日至2014年5月26日。用5×106个孢子/mL拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液将番茄种子浸种每个处理72粒种子，无菌水浸种作为对照。浸种1小时后，将番茄种子播种至装有育苗基质的72孔苗盘，在网室中生长37天后，每个处理随机选25株番茄幼苗，测量每一株幼苗的真叶叶片数、株高、茎粗、全株鲜重以及全株干重。最后计算每一株幼苗的壮苗指数：壮苗指数＝(茎粗/株高)×全株干重×100。试验共重复三次(图3)。试验结果如下：
表1.本发明的拟康宁木霉T-51菌株对番茄幼苗的促生效果
注：数据后注**说明与对照相比有差异显著性(P<0.01)
实施例3：拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液对灰霉在番茄死体叶片上产孢的抑制作用
供试番茄材料：合作903(番茄大王)。从生长到2-3个月的番茄植株上选取长势一致的叶片，用打孔器打成直径为1cm的叶圆片。将叶圆片压在铺有吸水纸的植物标本夹中，在60℃下烘干72h。烘干好的叶圆片先在无菌水中浸泡复水30分钟。将复水后的叶圆片放在铺有湿润滤纸的培养皿中，再在叶圆片上接种20μL浓度为5×106个孢子/mL的灰霉分生孢子悬浮液和20μL浓度为5×107个孢子/mL拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液。用20μL清水代替拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液接种作为对照。每个培养皿中放10个叶圆片，每个处理接种3皿。将接种后的培养皿放在20℃下培养，4天后，观察每个叶圆片上的灰霉孢子的情况，根据灰霉分生孢子在叶圆片上萌发的面积划分为0～4级：
0级:叶圆片上没有灰霉分生孢子产生
1级:叶圆片面积0％＜灰霉产孢面积≤25％叶圆片面积
2级:叶圆片面积25％＜产孢面积≤50％叶圆片面积
3级:叶圆片面积50％＜产孢面积≤75％叶圆片面积
4级:叶圆片面积75％＜产孢面积≤100％叶圆片面积
根据各处理的产孢面积计算产孢指数：产孢指数＝100×∑(各级叶数×各级代表值)/(总叶数×最高级代表值)。以产孢指数作为拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液对灰霉在番茄死体叶片上产孢的抑制效果(图4)。
实施例4：拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液灌根接种对番茄叶部灰霉病的抑制作用
供试番茄材料：合作903(番茄大王)。选取长势一致的20天苗龄的番茄幼苗，在每株幼苗根际土壤中接种1mL浓度为5×107个孢子/mL的拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液，处理6株幼苗作为6个重复，用清水接种作为对照。接种拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液后的番茄幼苗放在20℃光照下，24小时后，将1×105个孢子/ml灰霉孢子悬浮液喷施番茄叶片，每个处理喷施30mL，将处理后的番茄植株放在密闭保湿的玻璃箱中，在20℃光照下培养5天后，观察番茄叶片灰霉病的发病情况(图5)。
将番茄叶片灰霉病的发病严重程度分为0～4级：
0级：番茄叶片完全不发病
1级：灰霉病发病面积≤番茄叶片面积的1/4
2级：番茄叶片面积的1/4＜灰霉病发病面积≤番茄叶片面积的1/2
3级：番茄叶片面积的1/2＜灰霉病发病面积≤番茄叶片面积的3/4
4级：番茄叶片面积的3/4＜灰霉病发病面积≤整个叶片发病
实施例5：拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用
在90mlPDA培养基中分别添加0μl、100μl、500μl、1ml、5ml、10ml拟康宁木霉T-51菌株液体培养物滤液，总体积不满100ml的添加未培养拟康宁木霉T-51菌株的PDB使各处理的体积达到100ml，各处理中拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液浓度分别为0％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％(v/v)，分装在培养皿中(Φ＝9cm)，每皿含20ml混合培养基，制成平板。在含有各种处理的平板中央接种直径6mm的灰霉菌菌丝块(源于PDA培养2d的菌落边缘)。在20℃下培养。每24小时测定各平板灰霉菌菌落直径。各处理设置5次重复。以灰霉菌丝生长速度的抑制率为指标衡量拟康宁木霉T-51菌株的液体培养物滤液对灰霉菌丝生长的抑制作用，抑制率越高，抑制效果越好(图6)。
实施例6：拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质对灰葡萄孢菌菌丝生长、孢子萌发和灰霉对番茄果实侵染的抑制作用
一、拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质对灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用
在两个PDA平板上分别接种灰霉和拟康宁木霉T-51菌株的菌丝块(源于PDA培养2d的菌落边缘)，将两个培养皿对扣，拟康宁木霉T-51菌株菌丝块在下，灰霉菌在上，用封口膜将双皿密封。试验设两个处理：
(1)拟康宁木霉T-51菌株与灰霉同时接种；
(2)拟康宁木霉T-51菌株先接种，20℃下培养两天后接种灰霉。
以空白PDA和灰霉对扣培养为对照。接种灰霉菌丝块后在20℃下培养72小时，测量灰霉菌落直径。图7所示，拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质对灰霉菌丝的生长有明显的抑制作用。
二、拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质对灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制作用
在PDA平板上分别接种拟康宁木霉T-51菌株的菌丝块，20℃下培养两天。取浓度为1×105个孢子/ml的灰霉孢子悬液，滴加在另一个PDA平板中央，用灭过菌的三角形玻棒将孢子悬液均匀涂布在平板上。将两个培养皿对扣，拟康宁木霉T-51菌株在下，灰霉菌在上，用封口膜将双皿密封。以空白PDA培养皿与接种灰霉孢子液的平板对扣作为对照。每个处理涂3个平板，作为3次重复。将所有平板置于20℃下培养，分别在3h、6h、9h、12h时在光学显微镜下统计各平板灰霉孢子的萌发率，并测量芽管长度，每平板随机调查150个以上的孢子。如图8所示，拟康宁木霉T-51产生的挥发性物质对灰霉孢子的萌发率没有显著影响，但是对灰霉孢子萌发后的芽管伸长有显著的抑制作用。
三、拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质对灰霉对番茄果实侵染的抑制作用
在PDA平板上分别接种拟康宁木霉T-51菌株的菌丝块，20℃下培养两天。成熟的番茄在自来水下冲洗干净，然后无菌条件下，用75％的酒精浸泡60s，无菌水冲洗2次，超净工作台内吹干表面。5个表面消毒的番茄果实放在直径9cm的培养皿中，每个果实用消毒的刺针刺伤，取10μL的1×105个孢子/ml的灰霉孢子悬液滴在刺伤点上。
设置3个处理：
(1)只接种灰霉的番茄；
(2)只用拟康宁木霉T-51菌株熏蒸未接种灰霉的番茄；
(3)用5个PDA平板接种拟康宁木霉T-51菌株熏蒸接种灰霉的番茄。每个处理3个重复。
将接种拟康宁木霉T-51菌株的PDA平板去掉培养盖，立即放进无菌的干燥器底部，然后放入陶瓷隔板，将接种过的灰霉的番茄立即放进干燥器，盖好干燥器的盖子，并用封口膜密封。密封后的干燥器放置在20℃的环境中，培养7天，观察番茄果实的发病情况。试验共重复3次。结果如图9所示，在上述密闭条件下，拟康宁木霉T-51菌株产生的挥发性物质显著抑制了灰霉对番茄果实的侵染。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一株拟康宁木霉T-51菌株，其特征在于：菌株为拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)T-51，其保藏编号为：CCTCCNO：M2015729。
2.根据权利要求1所述的拟康宁木霉T-51菌株，其特征在于，所述拟康宁木霉T-51菌株置于葡萄糖马铃薯琼脂培养基PDA上培养一周，菌丝发达、产生大量气生菌丝，产生蓬松茂密的产孢簇，呈浅绿色至深绿色，无可溶性色素，无明显气味，适合生长温度为24～30℃，光照条件有利于其生长和产孢。
3.一种拟康宁木霉T-51菌株促进番茄种子萌发和幼苗生长的用途，其特征在于，将番茄种子在拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液中浸种1～2小时，用于促进番茄种子萌发及幼苗生长。
4.一种拟康宁木霉菌株T-51防治番茄灰霉病的应用，其特征在于，使用拟康宁木霉菌株T-51分生孢子悬浮液抑制灰霉在番茄死体叶片上产孢，以及接种在番茄根际土壤中防治番茄叶片灰霉病。
5.一种权利要求3和4任意一项所述拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到的拟康宁木霉T-51菌株菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养；
3)在步骤2)的培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液。
6.根据权利要求所述拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天；
所述步骤2)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天。
7.利用拟康宁木霉T-51菌株制备抑制番茄灰霉病菌生长速率的滤液的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到拟康宁木霉T-51菌落边缘的菌丝块接种至PDB培养液中培养，得到培养物；
3)将步骤2)得到的培养物离心，取离心上清液经滤纸过滤，得到的初级滤液经细菌过滤器再次过滤，得到滤液。
8.根据权利要求7所述利用拟康宁木霉T-51菌株制备抑制番茄灰霉病菌活性滤液的方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养条件为在温度为20℃，光照条件下培养2天；所述步骤2)中，培养条件为在温度为25℃、150r/min的条件下振荡培养7d。
9.一种权利要求7制备得到的滤液的应用，其特征在于：所述滤液抑制对番茄灰霉病菌生长速率。
10.一种拟康宁木霉T-51菌株在PDA培养基上产生的挥发性物质对番茄灰霉病抑制的应用，其特征在于，所述挥发性物质在密闭条件下抑制灰霉菌丝生长、孢子萌发，以及防治番茄果实灰霉病。
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