CN110373331B - 一株抗灰霉菌的蛇足石杉内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株抗灰霉菌的蛇足石杉内生真菌，分类命名为链格孢菌(Alternaria alternate)HR38‑7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2019388。该菌株是首次从蛇足石杉内生真菌中筛选得到，可用于农作物灰霉病的防治，以及作为活性成分用于制备防治农作物灰霉病的生防制剂。

Description

一株抗灰霉菌的蛇足石杉内生真菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株抗灰霉菌的蛇足石杉内生真菌，尤其是一株链格孢菌(Alternaria alternate)。
背景技术
在我国，由于农药的大量使用和不规范使用，引起了多种生态问题和食品安全问题。生物防治相比于化学防治，具有安全性高、环境兼容性好等特点。目前，多种生物防治剂产品已投入市场，运用于田间农作物的病害防治。据研究表明，生物农药与化学农药相比，安全性更高。刘新社研究发现生物农药可以提高黄瓜的产量和品质，相比化学农药，更能保障食品安全(刘新社2019)。因此，我国加大了对生物农药产业的扶持力度，生物农药产品在我国农药登记总数中已经超过10％。
番茄灰霉病是由灰霉菌引起的一种世界性病害，可以侵染多种作物，已经引起严重的经济损失。已报道的对番茄灰霉病有防治效果的真菌有多种，Elad发现白色隐球酵母菌和胶粘红酵母菌能够抑制番茄灰霉病病原菌侵染及产孢，国外市场已有木霉制作而成的灰霉菌防治剂。但我国在灰霉菌的生物防治研究中，还没找到能够有效用于农业生产中的生物防治剂。因此亟待通过开展生防潜力研究，分离筛选出对番茄灰霉病具有较强拮抗作用的菌株，寻找新型生物农药。
链格孢菌(Alternaria alternata)一般以病原菌形式存在，链格孢菌可引起观赏凤梨叶斑病(孙慧琳等2018)；桃在运输和贮藏过程中极易受链格孢菌侵染而造成腐烂变质，失去商品价值；链格孢菌也是最常见的霉菌过敏原，可引起过敏性鼻炎、过敏性哮喘等疾病(孔瑞等2019)。同时，链格孢菌可以起到抑制病原菌的作用，刘悦等发现从刺五加植物中分离出的链格孢属对大肠埃希菌抑菌效果显著(刘悦等2019)。链格孢菌也可以起到药用价值的作用，在某些研究中发现对癌症等有治疗作用，袁琳等从云南美登木植物内生链格孢属菌株的固体发酵物中提取出对肺癌有较强抑制活性的混合蔽类化合物(袁琳等2013)；张培岭发现链格孢菌可以降低伽师瓜果实的发病率(张培岭2018)；钱正强发现链格孢菌处理能显著增加烟叶叶面积，提高烟叶中蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性，减小海绵组织变薄，且经链格孢菌侵染的烟叶，其内生真菌的种类减少，多样性指数降低(钱正强2012)。目前，关于链格孢菌对灰霉菌抑制的研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一株抗灰霉菌的蛇足石杉内生真菌，为链格孢菌(Alternaria alternate)，该菌可用于防治农作物灰霉病。
申请人首先通过对野生蛇足石杉内生真菌进行分离，然后对分离出来的单菌落进行形态鉴定和高通量测序，共鉴定出50株内生真菌。然后对这50株内生真菌进行抗性筛选，首选通过平板对峙试验，发现7株内生真菌具有拮抗灰霉菌活性，然后进一步通过挥发性抑菌试验、发酵抑菌试验对这7株内生真菌进行筛选，最终获得一株具有稳定抑制灰霉菌作用的链格孢菌菌株。
该菌株分类命名为链格孢菌(Alternaria alternate)HR38-7，已于2019年5月23日保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCCNO：M 2019388。
该菌株菌落颜色为白色或浅褐色，反面为白色或棕色，一般中心颜色较重为深褐色；菌丝有隔，分生产孢梗形状为圆柱状，部分单生，部分簇生，呈现合轴式生长方式；分生孢子侧生在分生孢子梗上，部分有突起，有膈，单生或短链生，形状为椭圆形，颜色为黄褐色，鉴定为链格孢菌(Alternaria alternate)。
该菌株的ITS序列见序列表SEQ ID NO:1，该序列与链格孢菌(Alternariaalternate)(GenBank Acc.No.KT345696.1)具有99％同源性。
该菌株可用于农作物灰霉病的防治，以及作为活性成分用于制备防治农作物灰霉病的生防制剂。
附图说明
图1 50株蛇足石杉内生真菌基于ITS序列构建的系统进化树。
图2七种内生真菌通过平板拮抗对Botrytis cinerea的抑制效果。
图3七种内生真菌挥发性物质对Botrytis cinerea的抑制作用。
图4七种内生真菌挥发性物质对Botrytis cinerea的抑制率。
图5七种内生真菌PDB发酵液对Botrytis cinerea的抑制效果。
图6七种内生真菌发酵液对Botrytis cinerea的抑制率。
图7菌株HR38-7、HS46-2-3发酵液对番茄灰霉病的防治效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1蛇足石杉内生真菌的分离与鉴定
1.蛇足石杉内生真菌的分离
采自重庆石柱县(经度108.4585，纬度30.3137，海拔1427m)，由湖北省中医院生药学专家王克勤教授鉴定为野生蛇足石杉(Huperzia serrata)。
用毛刷去除野生蛇足石杉表面灰尘等附着物，将其分为茎段、叶片、根段，加入含量75％的酒精溶液轻轻摇晃5min。滤干后加入含量为0.2％升汞浸泡1.5min，用无菌水清洗5次。清洗水收集作为对照。最后将消毒处理后的组织样品转移到无菌的滤纸上吸干水分。用无菌的镊子轻轻夹取经过消毒处理的组织，分别轻放于PDA培养基的表面，接种后放于28℃生化培养箱内，并合理控制湿度，防止过于干燥培养基失水影响菌体的正常生长。经常观察其生长状态，如果发现有染菌或者叶片组织坏死的样品移出培养箱淘汰并记录。将分离出来的单菌落进行-80℃保存备用。
2.蛇足石杉内生真菌的鉴定
形态鉴定：在-80℃中保存的内生菌菌株接种于PDA平板上，置于25℃的恒温箱中进行活化后，用6mm直径无菌打孔器在菌落边缘取菌丝块。然后将菌丝块移植到新的PDA平板上。将接种后的平板置于28℃的恒温箱中培养。逐日观察各菌株菌落形态、菌丝颜色，是否产生色素等特征，以及是否产生孢子、菌核。
分子鉴定：1)将保存在-80℃的内生真菌株重新放在PDA平板上进行活化，待内生菌生长到能够收集到足够的菌丝，将内生菌收集起来，利用改良的CTAB法提取内生真菌的DNA。在Nanodrop2000超微量核酸仪上进行DNA质量和浓度的检测。同时，1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。基因组DNA统一稀释至50ng/μL备用。
2)真菌ITS序列扩增和高通量测序：利用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增内生菌的ITS序列。PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，对应的阳性克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)程序与GenBank核酸数据库进行比对，获得鉴定信息，并将得到的PCR产物序列利用Sequin软件上传至GenBank数据库，获得Accession Number。所有真菌的ITS序列，利用MEGA7.0软件的neighbor-joining计算方法进行系统进化树构建(图1)。
鉴定结果：从蛇足石杉的根茎叶中共分离出180个单菌落，经观察各菌落形态、菌丝颜色、是否产生孢子等特征以及通过提取菌丝DNA、PCR扩增进行ITS测序，完成内生真菌的形态学鉴定和分子生物学鉴定。鉴定到属的有50株内生真菌，其中包含4个纲，7个目，11个科，12个属。分离鉴定出的优势种为：博宁炭疽菌(Colletotrichum boninense)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、链格孢菌(Alternaria alternata)、草茎点霉(phoma herbarum)。胶孢炭疽菌、博宁炭疽菌属于Sordariomycetes，Glomerellales，Glomerellaceae，Colletotrichum；链格孢菌属于Dothideomycetes，Pleosporales，Pleosporaceae，Alternaria；草茎点霉属于Dothideomycetes，Pleosporales，Didymellaceae，Phoma。
实施例2抗灰霉菌的蛇足石杉内生真菌筛选
1.实验材料与仪器
1.1供试菌株
供试菌株：已鉴定的蛇足石杉内生真菌菌株50株。
供试病原菌真菌：灰霉菌(Botrytis cinerea)
1.2实验仪器耗材
高速冷冻离心机(Thermo)、百分之一天平(先行者)、恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)，相机(Canon)、显微镜(广东市明美光电技术有限公司)。游标卡尺(上海美耐特实业有限公司)、恒温培养摇床(武汉瑞华仪器设备有限责任公司)、超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)。
2.实验方法
2.1平板拮抗菌株筛选
将分离得到的50株蛇足石杉内生真菌经PDA培养至适宜菌落大小后，利用打孔器打取直径约6mm的菌块，接种至新鲜培养皿上，待接种的菌株直径长到2cm时，间隔3cm接种病原真菌进行对峙培养(将灰霉菌的对峙培养基置于25℃的恒温培养箱中进行暗培养)。实验一共进行三次，挑选出认为有抑制效果的的内生真菌进行下一步实验。
2.2产生挥发性抗菌物质内生菌株的筛选
对平皿对峙培养的有效的内生真菌菌株，利用打孔器从新鲜的菌落边缘打取直径6mm的菌丝块，接种到新鲜的PDA培养基上，用封口膜将培养皿密封，放置在28℃培养。待内生菌菌丝覆盖这个培养皿，进行产生挥发性抗菌物质菌株的筛选。
方法如下：在新鲜的病原菌菌落上打取直径为6mm的菌丝块接种至新鲜的PDA培养基上，然后将该培养皿与事先培养蛇足石杉内生菌的培养皿相对的扣在一起，然后用封口膜将两个培养皿紧密的封在一起，做成一个双皿对扣的装置，设置3个重复，只接种病原菌的PDA平板作为对照。
灰霉菌放置在25℃下培养，形成病原菌在上，内生真菌在下的放置方式。待对照病原菌的菌落直径长满整个皿后，测量实验组病原菌菌落生长直径并计算内生真菌对灰霉菌的抑制率。
菌落直径(mm)＝直径平均数-6(菌饼的直径)
抑菌率(％)＝(对照病原菌菌落直径-实验组病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径×100。
2.3拮抗菌株发酵液防病筛选
从新鲜培养的蛇足石杉内生真菌菌落边缘打取直径为6mm的菌丝块，接种到PDB培养基中，28℃，150r/min，震荡培养。
培养完成后，取出培养物，在无菌操作下将培养物装入离心管中，在12000r/min的转速下离心10min后取出，在常规无菌环境中得到上清液，发酵液通过孔径0.45um滤膜，通过一次性无菌过滤器，获得无菌发酵液，4℃冷藏备用。
(1)平板菌丝抑制法
按照无菌操作，将供试菌种用打孔器打取一定数量的菌块备用。待灭菌后的PDA冷却至60℃左右时，PDA与发酵液按照9：1的比例进行混匀后倾倒平皿至完全凝固(对照为加了同等质量的无菌水)。用接种针小心将菌块放置在含发酵液的培养基中央，菌丝一面向上，接种灰霉菌的置于25℃恒温箱中培养。待对照组菌丝长满整个皿后，采用十字交叉法测量菌落直径，求平均值。每种发酵液重复3次，取平均值并计算其抑制率。
菌落直径(mm)＝直径平均数-6(菌饼的直径)
抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100
(2)病斑侵染抑制法
于华中农业大学中百超市购买成熟健康的番茄，产地山东。用75％的酒精消毒，无菌水冲洗，放于一次性塑料碗中，每个处理的番茄用相对应的无菌发酵液均匀的涂抹在叶片表面，从生长了3天的新鲜灰霉菌菌落边缘打取直径6mm的菌丝块，菌丝块接种到番茄上，每个番茄三个菌丝块。塑料碗用食品保鲜膜覆盖，用以保持合适的湿度。抑制率计算方法同方法一。
2.4数据分析
利用SPSS软件进行统计分析平皿对扣中测量病原菌直径的数据和含发酵液的PDA平板上测量的病原菌直径的数据。每组处理的平均数利用邓肯氏多重比较，在P<0.05显著性水平上比较是否有显著性差异。
3.结果与分析
3.1平板拮抗灰霉菌的内生菌菌株
经过平板对峙试验，发现7株内生真菌菌株Colletotrichum boninense HS46-2-3、Colletotrichum boninense HL33-6-1、Colletotrichum boninense HL34-8-1，Alternaria alternate HR38-7，Epicoccum nigrum HL36-9-3，Mycoleptodiacus indicusHS8-3，Trametes versicolor HS39-18具有拮抗灰霉菌抑制活性。(图2)
3.2产生VOCs抑制灰霉菌生长的菌株
对平板对峙实验所筛选到的内生真菌进行平皿倒扣实验，筛选到菌株Trametesversicolor HS39-18、Colletotrichum boninense HL34-8-1、Epicoccum nigrum HL36-9-3、Alternaria alternate HR38-7菌株产生的挥发性物质对Botrytis cinerea的抑制作用最显著(P<0.05)，抑菌率分别为61.57％、55.41％、51.41％、54.52％，其他菌株在一定程度上也均有抑制作用。菌株Colletotrichum boninense HS46-2-3和菌株Mycoleptodiacusindicus HS8-3对Botrytis cinerea的抑制作用最低(P<0.05)，抑菌率分别为26.22％、26.10％(图3，图4)。
3.3拮抗菌株发酵液防灰霉菌菌株筛选
(1)平板菌丝抑制法
对于灰霉菌平皿对峙实验所筛选到的内生真菌进行发酵液物质的检测，7株菌株中，HR38-7的发酵液对Botrytis cinerea的抑制作用最明显(P<0.05)，抑制率为24.84％；菌株Epicoccum nigrum HL36-9-3对Botrytis cinerea的抑制作用较明显(P<0.05)，抑制率为15.08％；菌株Colletotrichum boninense HS46-2-3、ColletotrichumboninenseHL33-6-1和Trametes versicolor HS38-19的抑制作用最低(P<0.05)，抑制率分别为4.36％、3.70％、4.73％。(图5，图6)
(2)病斑侵染抑制法
在平板拮抗试验的基础上，将筛选出的7株蛇足石杉内生真菌的PDB培养发酵液，在番茄上进行防病试验，结果发现7株菌株对灰霉菌引起的番茄腐烂均有抑制作用，其中Colletotrichum boninense HS46-2-3、Alternaria alternate HR38-7可以显著的抑制番茄的腐烂(图7、表1)。
表1蛇足石杉内生真菌代谢产物对灰霉菌的抑制效果
Figure BDA0002103646800000071
4.结论与讨论
本研究通过平板对峙初步筛选出7株抑制灰霉菌的内生真菌，这些菌株属于炭疽属(Colletotrichum)、链格孢属(Alternaria)、附球菌属(Epicoccum)、Mycoleptodiacus、栓菌属(Trametes)。进行平皿倒扣实验，筛选出菌株Trametes versicolor HS39-18、Colletotrichum boninense HL34-8-1、Epicoccum nigrum HL36-9-3、Alternariaalternate HR38-7菌株产生的挥发性物质对Botrytis cinerea的抑制作用最显著。进行发酵液物质筛选试验，检测出菌株发酵液对Botrytis cinerea抑制作用较强的是Alternariaalternate HR38-7、Epicoccum nigrum HL36-9-3菌株。在番茄上进行防病试验表明，Colletotrichum boninense HS46-2-3、Alternaria alternate HR38-7可以显著的抑制番茄的腐烂。综上所述，Alternaria alternate HR38-7具有稳定的抑制灰霉菌的作用。
在这7株内生真菌中，有的菌株产生的挥发性物质的抑制作用强，但其发酵液的防病效果却不理想，如菌株Trametes versicolor HS38-19。结果显示菌株发酵液喷施在番茄上的效果总体优于加入培养基的防病效果，由此推测如果改变具有生物防治作用菌株的田间使用方法，或许会增强其防病效果。
本研究通过平板对峙、挥发性物质、发酵液筛选试验发现，Alternaria alternateHR38-7具有稳定的抑制灰霉菌的作用。虽抑制机理还需要更深层次的研究，但为防治灰霉菌的生物农药的开发提供了菌种资源。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一株抗灰霉菌的蛇足石杉内生真菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 572
<212> DNA
<213> 链格孢菌(Alternaria alternate)
<400> 1
tccgtaaggg tgacctgcgg agggatcatt acacaaatat gaaggcgggc tggaacctct 60
cggggttaca gccttgctga attattcacc cttgtctttt gcgtacttct tgtttccttg 120
gtgggttcgc ccaccactag gacaaacata aaccttttgt aattgcaatc agcgtcagta 180
acaaattaat aattacaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac 240
gcagcgaaat gcgataagta gtgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa 300
cgcacattgc gccctttggt attccaaagg gcatgcctgt tcgagcgtca tttgtaccct 360
caagctttgc ttggtgttgg gcgtcttgtc tctagctttg ctggagactc gccttaaagt 420
aattggcagc cggcctactg gtttcggagc gcagcacaag tcgcactctc tatcagcaaa 480
ggtctagcat ccattaagcc tttttttcaa cttttgacct cggatcaggt agggataccc 540
gctgaactta agcatatcat agccgggagg aa 572

Claims (3)

1.一株抗灰霉菌的蛇足石杉内生真菌，分类命名为链格孢菌（Alternaria alternate）HR38-7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019388。
2.权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌在防治农作物灰霉病中的应用。
3.一种防治农作物灰霉病的生防制剂，其活性成分是权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌。
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