KR20120061580A - 심플리실리움 라멜리콜라 ｋｒｉｃｔ3 균주, 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 식물병 방제방법 - Google Patents

심플리실리움 라멜리콜라 ｋｒｉｃｔ3 균주, 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 식물병 방제방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주는 우리나라에서 자생하는 미생물로서 경제적인 대체효과가 크고, 고성능을 가지고 있을 뿐 아니라 다양한 식물병에 대하여 탁월한 항균 활성을 갖고 있어, 작물의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

심플리실리움 라멜리콜라 ＫＲＩＣＴ3 균주, 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 식물병 방제방법{Simplicillium lamellicola KRICT3 strain, composition for control plant diseases and control method of plant diseases with same}
본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주, 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 잿빛곰팡이병균에 대한 중복기생균으로 다양한 식물 병원균에 대한 항균활성을 가지는 신규한 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주, 상기 KRICT3 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법에 관한 것이다.
근대 과학의 산물인 농약과 비료는 농업생산성을 증대하여 인류를 기아로부터 해방시키는데 크게 기여하여 왔다. 하지만 최근에는 이러한 긍정적인 측면보다는 농약과 비료의 오남용 및 잔류에 따른 인?축 독성 및 환경오염에 대한 사회적 관심이 크게 증가하고 있고, 삶의 질을 중요시하는 웰빙시대가 도래하여 합성 농약 사용량을 줄이거나 농약을 사용하지 않고 작물을 재배한 친환경 농산물에 대한 수요가 증가하고 있다. 또한 농민의 입장에서도 수입 자유화로 가격이 저렴한 국외 농산물이 많이 수입되고 있어 그 대안으로 단위 면적 당 소득이 높은 유기농법을 이용한 재배를 선호함에 따라 친환경 농산물 재배 면적이 점차 증가하고 있다. 그러나 실제 포장에서 친환경 농법으로 작물을 재배하려면 식물병을 방제하지 않고 농산물을 수확하기는 매우 어렵다. 연구에 따르면 작물보호제를 사용하지 않고 농산물을 재배하였을 경우, 복숭아와 사과는 100%와 97%의 손실이 있었으며, 오이, 양배추, 토마토 등의 채소는 39~63%의 수확량 감소가 있었다. 그러므로 친환경 농산물 생산을 위해서는 합성 농약을 대신할 식물병 방제효과가 우수한 생물농약이 필요하다.
생물농약에는 미생물을 이용하여 식물병, 해충 및 잡초를 방제하는 미생물농약과 식물 혹은 미생물이 생산하는 천연물을 이용하는 생화학농약이 있다. 미생물농약의 경우에는 처리 미생물의 살균작용을 나타내는 방법에 따라 항균물질 생산 미생물, 식물병원균을 기생하는 중복기생 미생물, 식물에 유도저항성을 증진하는 미생물 등으로 구분할 수 있다. 이들 중 식물병원균 특히 곰팡이를 기생하는 중복기생균으로는 Trichoderma 속, Gliocladium 속, Acremonium 속 등이 알려져 있다. 생물농약으로 개발된 Trichoderma 속 균주로는 Trichoderma harzianum T-22, TH35, TH315, T-39, ATCC 20475 및 IMI 206040 균주 그리고 Trichoderma viridae ATCC 20476 균주, Trichoderma polysporum IMI 206039, Trichoderma stromaticum, Trichoderma virens, Trichoderma viride 등이 있다. 그리고 Cliocladium catenulatum(Clonostachys rosea f. catenulate 동일명)은 Prestop등의 상표명으로 등록되어 시판되고 있다. 그리고 Heminthosporium 등 다양한 식물병원곰팡이를 중복기생하는 다양한 Acremonium 속 균주도 알려져 있으며 일부 국가에서는 식물병 방제에 크게 성공한 바 있다. 하지만 중복기생 미생물 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola)를 이용한 식물병 방제방법에 관한 보고는 거의 없는 실정이다.
이에 본 발명자들은 아직 보고된 바 없는 우리나라에서 자생하는 미생물로서, 식물 병원곰팡이를 중복기생하며 식물병에 대한 우수한 방제효과를 가지는 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) 균주를 처음으로 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다양한 식물병에 대하여 우수한 항균 활성을 가지는 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) 균주 및 이의 배양물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 우리나라에서 자생하는 미생물로서 경제적인 대체효과가 크고 고성능을 가지고 있는, 상기 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) 균주 또는 이의 배양물을 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 방제방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다양한 식물병에 대한 우수한 항균 활성을 가지는, 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) 균주 및 이의 배양물을 제공한다.
본 발명은 상기 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) 균주 또는 이의 배양물을 함유하는, 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 방제방법을 제공한다.
본 발명에 따른 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) 균주는 우리나라에서 자생하는 미생물로서, 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대한 중복기생균으로 다양한 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) 균주는 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 코클리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus), 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 보트리티스 씨네리(Botrytis cinerea), 보트리티스 알리(Botrytis allii), 스클레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리쿰 오르비쿨라레(Colletotrichum orbiculare), 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici), 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 피티움 그라미니콜라(Pythium graminicola) 및 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG1로부터 선택되는 1종 이상의 식물 병원균에 대한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) 균주 및 이의 배양물은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 고추 역병, 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 잿빛곰팡이병, 백합 잎마름병 및 보리 흰가루병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물병에 대한 방제효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대한 중복기생균으로 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는, 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주 및 상기 균주의 배양물을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3 균주는 잿빛곰팡이병에 감염된 딸기의 표면으로부터 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 기생하여 생장하는 중복기생균의 특성 뿐 아니라 잿빛곰팡이병균에 대한 살균 활성을 보이는 균주를 분리 선별하였다.
상기 균주의 동정을 위한 28S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호: 1)과 ITS 영역의 염기서열(서열번호: 2) 분석 결과, 동일하지는 않으나 심플리실리움 라멜리콜라로 동정되었으며, 상기 선별된 신규한 균주를 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2010년 9월 15일자로 기탁번호 제 KCTC 11765BP를 부여받았다. 도 6 및 도 7을 참조한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물 병원균은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 고추 역병, 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 잿빛곰팡이병, 백합 잎마름병 및 보리 흰가루병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물병에 대한 우수한 방제효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 본 발명의 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3 균주의 다양한 식물병의 원인균에 대한 대치배양 실험 결과, 각종 식물에 점무늬병을 일으키는 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 옥수수 깨시무늬병균인 코클리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus), 벼 도열병균인 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 각종 식물의 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 씨네리(Botrytis cinerea), 양파 잿빛곰팡이병균인 보트리티스 알리(Botrytis allii), 각종 식물의 균핵병을 일으키는 스클레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 오이 탄저병균인 콜레토트리쿰 오르비쿨라레(Colletotrichum orbiculare), 고추 역병 병원균인 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici), 토마토ㆍ감자 역병 병원균인 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 시들음병균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 각종 식물의 모잘록병을 일으키는 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 잔디 모잘록병을 일으키는 피시움 그라미니콜라(Pythium graminicola) 및 벼의 잎집무늬마름병 병원균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG1 등의 식물 병원균의 생장을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 도 4를 참조한다.
특히, 본 발명에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주는 상기 식물병의 원인균 중 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 코클리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus), 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 보트리티스 씨네리(Botrytis cinerea), 보트리티스 알리(Botrytis allii), 스클레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리쿰 오르비쿨라레(Colletotrichum orbiculare)의 경우 우수한 살균 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주 또는 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 배양물을 함유하는, 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 방제용 조성물은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 고추 역병, 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 잿빛곰팡이병, 백합 잎마름병 및 보리 흰가루병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 식물병에 대하여 우수한 방제효과가 있는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 상기 방제용 조성물을 이용하여 온실실험에서 다양한 식물병에 대한 방제효과를 실험하였다.
그 결과 본 발명의 방제용 조성물을 식물에 살포함으로써 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(병원균: Rhizoctonia solani AG1), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 고추 역병(병원균: Phytophthora capsici), 오이와 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 백합 잎마름병(병원균: Botrytis elliptica), 그리고 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei) 등 다양한 식물병에 대하여 효과적인 방제효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 처리 식물인 벼, 토마토, 오이, 밀, 보리, 배추, 고추 등의 작물에는 전혀 병원성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 방제용 조성물은 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주를 1×104 내지 1×109 포자/㎖의 농도로 함유하는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 1×106 내지 1×108 포자/㎖의 농도로 함유하는 한다. 도 5를 참조한다.
본 발명은 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주 또는 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 배양물을 함유하는 식물병 방제용 조성물을 작물의 열매 또는 재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 식물병의 방제방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 식물병은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 고추 역병, 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 잿빛곰팡이병, 백합 잎마름병 및 보리 흰가루병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것으로, 작물에 통상의 방법으로 적용한다.
구체적인 방법으로 본 발명에 따른 상기 방제용 조성물은 토양, 작물의 잎, 줄기, 꽃 또는 열매에 살포하는 것으로, 포장처리시 포장 내 병원균의 밀도, 발병환경 등에 따라 물에 상기 조성물을 희석하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 미생물 균주의 항균 활성을 더하기 위하여 엽면살포제 또는 관주살포제 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 살포시기는 각 식물 병원균이 발병ㆍ증식하기 전 예방적으로 미리 처리하는 것이 방제효과를 더욱 상승시킬 수 있다.
본 발명에 따른 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주는 우리나라에서 자생하는 미생물로서 경제적인 대체효과가 크고, 고성능을 가지고 있을 뿐 아니라 다양한 식물병에 대하여 탁월한 항균 활성을 갖고 있어, 작물의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 28S rRNA 유전자의 염기서열을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 ITS 영역의 염기서열을 나타낸 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 균총을 보여주는 사진이고,
도 4는 본 발명에 따른 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 다양한 식물 병원균에 대한 항균 활성을 보여주는 대치배양의 결과이며(페트리 디쉬의 오른쪽은 KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주),
(A: 벼 도열병균, B: 옥수수 깨시무늬병균, C: 잿빛곰팡이병균, D: 점무늬병균, E: 시들음병균, F: 오이류 탄저병균, G: 잔디 모잘록병균, H: Pythium 모잘록병균, I: Rhizoctonia 모잘록병균)
도 5는 본 발명에 따른 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 농도별 처리구에 대한의 백합 잎마름병 방제효과를 확인한 결과이고,
(A: 무처리구, B: 4.1×105개 포자/㎖ 처리구, C: 1.2×106개 포자/㎖ 처리구)
도 6은 본 발명에 따른 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 28S rRNA 유전자에 대한 염기서열의 상동성을 확인한 결과이며,
도 7은 본 발명에 따른 신규한 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3(기탁번호: KCTC 11765BP) 균주의 ITS 영역에 대한 염기서열의 상동성을 확인한 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게는 명백한 것이다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 분리
충청남도 논산 지역에 위치한 잿빛곰팡이병이 심하게 발생한 딸기 비닐하우스 포장에서 잿빛곰팡이병에 감염된 딸기들의 표면에 잿빛의 균사체와 포자들이 무수히 많은 것을 관찰하였고, 이들 중 중복기생균의 전형적인 증상으로 알려진 잿빛곰팡이병균에서 생장하는 흰색의 곰팡이를 발견하였다.
상기와 같은 증상을 나타내는 딸기 열매를 채집하여 이로부터 흰색의 여러 콜로니를 분리하였다. 이들 중 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대하여 살균 활성을 보이는 균주를 선발하기 위하여 대치배양실험을 실시하였다. 직경 8.5 cm 페트리 디쉬의 감자한천배지의 한 편에 분리한 균주의 균사조각(직경 6.5 mm)을 올려 접종하고 20℃에서 3일 배양한 후, 반대편에는 잿빛곰팡이병균의 균사조각을 접종하고 다시 20℃에서 5일 배양하였다. 대치배양 실험에서 가장 큰 저지대를 형성하는 균주를 선발하고 KRICT3 균주로 명명하였다.
[실시예 2] 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 동정
상기 실시예 1에서 선별된 KRICT3 균주의 동정을 위하여 ITS 영역 및 28S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다.
KRICT3 균주의 28S rRNA 유전자와 ITS 영역의 염기서열을 얻기 위하여 분리된 균주의 균사로부터 DNA를 분리한 후, PCR-프리믹스(PCR-premix; iNtRON Biotechnology, Korea)와 혼합하여 LR0R(5'-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3') 및 LR 7(5'-TAC TAC CAC CAA GAT CT-3') 프라이머를 이용하여 28S rRNA 유전자를 증폭하였고, ITS 5(5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3') 및 ITS 4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') 프라이머를 이용하여 ITS 영역을 증폭하였다.
상기 증폭된 PCR 산물을 위저드 PCR 프렙 키트(Wizard PCR prep kit; Promega, Medison, WI, USA)를 사용하여 정제한 후, 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 얻었다. 염기서열은 NCBI의 BLAST를 이용하여 GenBank 데이터베이스와 염기서열을 비교하였다. CLUSTAL X로 염기서열을 정렬하고, PHYDIT 프로그램 버젼 3.0을 사용하여 neighbour-joining tree를 작성하였다.
상기 선별된 균주의 28S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호: 1)과 ITS 영역의 염기서열(서열번호: 2)을 neighbour-joining 알고리즘을 바탕으로 분석한 결과, 하기 표 1 및 도 6에서도 확인할 수 있듯이, KRICT3 균주는 심프리실리움 라멜리콜라 CBS 116.25와 28S rRNA 유전자의 염기서열은 99.6%의 상동성을 가지고 있었다.
Figure pat00001
또한, ITS 영역의 염기서열의 경우 하기 표 2 및 도 7에서도 확인할 수 있듯이, 심프리실리움 라멜리콜라 CBS 116.25와 ITS 영역의 염기서열이 99.2%의 상동성을 나타내는 신규한 균주임을 확인할 수 있었다.
Figure pat00002
이상의 결과로부터 본 발명에서 선별된 균주는 동일하지는 않으나 심플리실리움 라멜리콜라로 동정되었으며, 상기 선별된 신규한 균주를 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2010년 9월 15일자로 기탁번호 제 KCTC 11765BP를 부여받았다.
[ 실시예 3] 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 중복기생성 확인
상기 실시예 1 및 2의 결과로부터 분리 후 동정된 신규한 KRICT3 균주의 균총은 흰색이며, 잿빛곰팡이병균의 균총은 잿빛을 나타내었다.
또한, 잿빛곰팡이병균 균사의 직경은 KRICT3 균주의 균사에 비하여 10배 이상의 균사 직경을 가지고 있는 특징을 이용하여, KRICT3 균주의 잿빛곰팡이병균에 대한 기생성을 조사하였다. KRICT3 균주를 감자액체배지(potato dextrose broth, Becton Dickinson & Co.)에 접종하고 20℃에서 10일 동안 150 rpm으로 진탕배양 하였다. KRICT3 배양액을 2겹 가제로 걸러 균체를 제거한 후, 원심분리 하여 수확한 포자현탁액을 감자액체배지로 희석하여 각각 ㎖ 당 9×104, 3×105, 8×105, 3×106, 7×106, 2×107, 7×107, 2×108개 농도의 포자현탁액을 준비하였다.
감자한천배지에서 배양하여 형성된 잿빛곰팡이병균의 포자를 감자액체배지로 수확하여 각각 ㎖ 당 1×103, 4×103, 1×104, 4×104, 1×105, 3×105개 농도의 포자현탁액을 준비하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 잿빛곰팡이병균과 KRICT3 균주의 각 포자현탁액을 각각 50 ㎕ 씩 넣고 20℃ 배양기에서 7일 동안 150 rpm으로 진탕배양한 후 균총의 색을 조사하고, 또 이들을 현미경 하에서 관찰하여 KRICT3 균주의 기생성을 조사하였다.
Figure pat00003
그 결과 상기 표 3의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주는 처리한 대부분의 농도에서 흰색의 균총을 나타내었고, KRICT3 균주가 잿빛곰팡이병균의 발아 및 생장을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.
그리고 잿빛곰팡이병균의 포자 농도가 높고 KRICT3 균주의 포자농도가 낮은 경우에는 균총이 잿빛을 띄는 흰색 균총을 나타내어 두 균주가 공존하고 있음을 확인할 수 있었다, 하지만 이들 균총을 현미경 하에서 관찰해 보면 잿빛곰팡이병균의 균사에 가는 균사 즉 KRICT3 균사가 침입하여 자라고 있는 모습을 관찰할 수 있었다. 따라서 상기의 결과로부터 본 발명의 신규한 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주가 잿빛곰팡이병균에 대한 중복기생균임을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] 다양한 식물병원균에 대한 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 살균효과
다양한 식물병원균에 대한 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 살균효과를 확인하기 위하여 페트리 디쉬(Petri dish, 직경 8.5 cm)에 있는 감자한천배지(potato dextrose agar)의 한편에 KRICT3 균주의 균사조각(직경 6.5 mm)을 올려 접종한 후 20℃에서 3일 동안 배양하였다.
감자한천배지에서 배양한 12종 식물병원균(Rhizoctonia solani AG4, Pythium ultimum, Pythium graminicola, Phytophthora capsici, Colletotrichum orbiculare, Fusarium oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea, Botrytis allii, Magnaporthe oryzae, Alternaria alternata, Cochliobolus heterostrophus)으로부터 균총의 선단부로부터 떼어낸 균사조각(직경 8 mm)을 KRICT3 균주를 전배양한 감자한천배지의 KRICT3 균주 맞은편에 접종하고, 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 피티움 그라미니콜라(Pythium graminicola), 스클레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 보트리티스 씨네리(Botrytis cinerea), 보트리티스 알리(Botrytis allii)는 20℃에서 그리고 나머지 식물병원균은 25℃에서 2일 내지 7일 동안 배양한 후 저지환의 크기를 측정하였다.
Figure pat00004
상기 표 4 및 도 4에서도 확인할 수 있듯이, KRICT3 균주는 실험한 12종 식물병원균 중 Rhizoctonia 모잘록병균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG4를 제외한 11종 식물병원균에 대하여 다양한 크기의 저지환을 나타내어 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 코클리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus), 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 보트리티스 씨네리(Botrytis cinerea), 보트리티스 알리(Botrytis allii), 스클레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리쿰 오르비쿨라레(Colletotrichum orbiculare), 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici), 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 피티움 그라미니콜라(Pythium graminicola) 등의 식물병원균에 대하여 살균 활성이 있음을 알 수 있었다.
특히, KRICT3 균주는 실험한 병원균 중 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 코클리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus), 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 보트리티스 씨네리(Botrytis cinerea), 보트리티스 알리(Botrytis allii), 스클레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리쿰 오르비쿨라레(Colletotrichum orbiculare)에 대하여 우수한 살균 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 5] 온실실험에서 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 식물병에 대한 방제효과
1) 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주 배양액의 6종 식물병 방제효과
심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 포자현탁액과 배양여액 처리에 의한 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(병원균: Rhizoctonia solani AG1), 오이 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia recondita) 및 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei) 등의 6종 식물병에 대한 방제효과를 온실에서 실험하였다.
실험에 사용하는 작물을 준비하기 위하여, 직경 4.5 cm의 일회용 플라스틱 포트에, 벼의 파종을 위해서는 수도용 상토를, 토마토, 오이, 밀, 보리의 파종을 위해서는 원예용 상토를 넣고 벼(품종: 낙동벼), 오이(품종: 하우스백다다기, 동부한농), 토마토(품종: 서광토마토, 몬산토코리아), 밀(품종: 은파밀) 및 보리(품종: 동보리)의 종자를 각 포트에 파종한 후, 온실(25±5℃)에서 1 내지 4주 동안 재배하여 준비한 3 내지 4엽기의 벼, 2 내지 3엽기의 토마토, 1엽기의 오이, 밀 및 보리를 실험에 사용하였다.
심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주는 감자액체배지(potato dextrose broth, Becton Dickinson & Co.)에 접종하고 20℃에서 10일 동안 150 rpm으로 진탕배양하여 배양액을 수득하였다. 상기 KRICT3 균주의 배양액을 2겹 가제로 걸러 균사를 제거한 후 이를 5000 rpm으로 원심분리하여 상층액(배양여액)을 수확하고, 침전물에 배양액과 동량의 멸균 증류수를 넣고 잘 흔들어 ㎖ 당 약 1×108개 농도의 포자 현탁액을 준비하였다. 상기 포자 현탁액을 벼, 토마토, 오이, 밀 그리고 보리 식물에 살포하였다. 약제 처리한 식물은 온실에서 1일 동안 풍건시킨 후, 각 병원균의 포자 혹은 균사조각을 접종하고 발병시켜 식물병 방제효과를 조사하였다.
방제효과는 하기 수학식 1에 따라 방제가로 계산하였으며, 각 식물병에 대한 접종 및 발병 유도는 다음과 같이 실시하였다.
Figure pat00005
㉠ 벼 도열병(Rice Blast, RCB)에 대한 시험
병원균인 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae) KJ201 균주를 쌀겨 한천배지(rice polish 20 g, dextrose 10 g, agar 15 g, 증류수 1 L)에 접종하여 25℃ 배양기에서 2주간 배양하였다. 병원균이 자란 배지를 멸균한 붓으로 배지표면을 긁어 기중 균사를 제거하고, 형광등이 켜진 선반(25±1℃)에서 48시간 동안 포자를 형성시켰다. 병원균의 접종은 형성시킨 분생포자를 살균증류수로 일정농도의 포자현탁액(1×106 포자/㎖)을 만든 뒤 식물에 흘러내릴 정도로 충분히 분무하였다. 접종한 벼는 습실상에서 암상태로 24시간 습실처리를 하고 상대습도 80% 이상이며 온도 25±1℃인 항온항습실에서 5일간 둔 뒤 잎에 발생한 병반면적율을 조사하였다.
㉡ 벼 잎집무늬마름병(Rice Sheath Blight, RSB)에 대한 시험
적당한 양의 밀기울을 1 L 배양병에 넣고 멸균한 후 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG1 균을 접종하고 25℃ 배양기에서 7일간 배양하였다. 병원균 접종은 배양된 균사덩어리를 적당히 잘게 마쇄하여 벼가 자란 포트에 고르게 접종하고, 습실상(25℃)에서 3일간 배양한 후 상대습도 80% 이상인 항온항습실에서 4일간 둔 뒤에 병 발생을 조사하였다. 발병조사는 벼의 잎집에 발생된 병반면적율을 조사하였다.
㉢ 오이 잿빛곰팡이병(Cucumber Gray Mold, CGM)에 대한 시험
잿빛곰팡이병 병원균인 보트리티스 씨네리(Botrytis cinerea) NY76을 감자한천배지에 접종하여 20℃ 항온기(암상태)에서 5일간 배양한 후, 하루에 12시간씩 광암을 교차하면서 다시 7일 동안 배양하여 접종원으로 사용하였다. 배지에 형성된 포자를 감자액체배지로 수확하여 혈구계를 사용하여 포자농도를 5×105 spores/㎖로 조정하고, 본엽 1엽 오이 유묘에 분무접종 하였다. 접종한 오이 유묘는 20℃ 습실상(상대습도 95% 이상)에서 3일간 발병을 유도시킨 후 오이 잎에 발생한 병반면적율을 조사하였다.
㉣ 토마토 역병(Tomato Late Blight, TLB)에 대한 시험
병원균인 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans) PIT 균주를 오트밀 아가(oatmeal agar)배지에 접종하고 20℃ 항온기에서 배양하였다. 배지에 형성된 유주자낭을 살균증류수를 첨가하여 수확하고, 광학현미경하에서 혈구계로 포자농도를 조사하여 3×104 sporangia/㎖의 포자현탁액을 만들어 저온처리하여 유주자를 유출시킨 후, 토마토 유묘에 분무접종 하였다. 병원균을 접종한 토마토 유묘는 20℃ 습실상에서 1일간 습실처리한 후에 20℃의 항온항습실(상대습도 70%)에 2일간 두어 발병시킨 후 토마토 잎에 발생한 병반면적율을 조사하였다.
㉤ 밀 붉은녹병(Wheat Leaf Rust, WLR)에 대한 시험
병원균인 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita)는 활물기생균이므로, 실험실에서 식물체에 직접 계대배양하면서 밀 유묘에 형성된 하포자를 접종원으로 사용하였다. 수확한 하포자로 포자현탁액(포자 0.67 g/L)을 제조한 후 밀 유묘에 분무접종 하였다. 접종한 유묘는 20℃의 습실상에서 1일간 습실처리한 후에 상대습도가 70%인 20℃의 항온항습실로 옮겨서 발병을 유도하고, 접종한지 7일 후에 병반면적율을 조사하였다.
㉥ 보리 흰가루병(Barley Powdery Mildew, BPM)에 대한 시험
병원균인 블루메리아 그라미니스 포마 스페셜리스 호르데이(Blumeria graminis f. sp. hordei)는 활물기생균이므로, 실험실에서 보리 유묘에 인공 접종하여 발병시킨 보리 잎에 형성된 흰가루병균 포자를 접종원으로 사용하였다. 이들을 보리 유묘에 고르게 털어서 접종하였으며, 접종한 보리 유묘는 20℃, 상대습도 70% 정도의 항온항습실에 두어 7일간 발병시킨 후 병반면적율을 조사하였다.
Figure pat00006
무처리 대조구의 발병도는 벼 도열병은 30%, 벼 잎집무늬마름병은 95%, 오이 잿빛곰팡이병은 53%, 토마토 역병은 70%, 밀 붉은녹병은 15% 그리고 보리 흰가루병은 30%로 대상 식물병 모두에서 KRICT3 균주의 약효를 평가하기에 충분한 병 발생이 있었다. 상기 표 5에서도 확인할 수 있듯이, 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 포자현탁액을 처리하였을 때는 밀 붉은녹병을 제외한 벼 잎집무늬마름병, 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 역병과 보리 흰가루병에 대하여 90% 이상의 우수한 방제효과를 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 벼 도열병에 대해서는 80%의 방제효과를 나타냈다. 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 배양여액을 살포하였을 경우에는, 오이 잿빛곰팡이병과 보리 흰가루병에 대하여 각각 72%와 71%의 방제효과를 가지는 것을 확인함으로써 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주는 배양여액에 잿빛곰팡이병과 흰가루병 발생을 억제할 수 있는 항균물질을 생산한다는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주가 다양한 식물병 즉, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 보리 흰가루병 등의 방제에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
2) 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 포자 농도에 따른 토마토 잿빛곰팡이병 방제효과
심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주를 감자액체배지에 접종하고, 20℃에서 10일 동안 150 rpm으로 진탕배양 하였다. 상기 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 배양액을 2겹 가제로 걸러 균체를 제거하고 원심분리 하여 수확한 포자현탁액을 멸균 증류수로 희석하여 각각 ㎖ 당 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108개 포자 농도의 포자현탁액을 준비하였다.
온실에서 재배한 2 내지 3엽기 토마토 유묘와 약 2개월 재배한 성체 토마토 식물에 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 포자현탁액을 살포하고 1일 후에 잿빛곰팡이병균(포자 농도: 1×106 spores/㎖)을 접종하고 병 발생을 유도한 후에 병조사를 실시하여 잿빛곰팡이병 방제효과를 조사하여 하기 표 6에 나타내었다. 무처리 대조구의 발병도는 유묘 토마토의 잿빛곰팡이병 발병도는 89% 그리고 성체 토마토의 잿빛곰팡이병은 40%로 둘 다에서 KRICT3 균주의 약효를 평가하기에 충분한 잿빛곰팡이병 발생이 있었다.
Figure pat00007
상기 표 6의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주를 ㎖ 당 1×107개 이상의 포자 농도로 처리하면 유묘와 성체 식물 토마토 모두에서 잿빛곰팡이병을 90% 이상 방제할 수 있었으며, KRICT3 균주를 ㎖ 당 1×105 내지 1×106개 포자 농도로 처리하면 무처리구에 비하여 잿빛곰팡이병을 27% 내지 62%를 억제할 수 있음을 확인하였다.
3) 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 배양액 농도에 따른 백합 잎마름병 및 고추 역병 방제효과
심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주를 감자액체배지에 접종하고 20℃에서 10일 동안 150 rpm으로 진탕배양 하였다. 상기 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 배양액을 2겹 가제로 걸러 균체를 제거하고, 멸균 증류수로 3배 씩 희석하여 각각 3배, 9배, 27배, 81배, 243배 희석액을 준비하였으며, 원액의 포자농도는 ㎖ 당 약 1×108개 이었다.
백합 잿빛곰팡이병 실험은 원예용 상토에 백합 구근을 파종하여 온실에서 재배한 꽃 피기 직전 시기의 백합 식물에 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 배양액을 살포하고 4일 후에 백합 잎마름병균(병원균: Botrytis elliptica, 포자 농도: 5×105 spores/㎖)을 접종하고, 병 발생을 유도한 후에 병조사를 실시하여 잎마름병 방제효과를 조사하였다.
고추 역병 실험은 원예용 상토에 고추 종자(품종: 부강, 몬산토코리아)를 파종하여 온실에서 약 2개월 재배한 1차 분지기의 고추 식물에 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 배양액을 관주처리하고, 1일 후에 고추 역병균(병원균: Phytophthora capsici CY6225, 포자 농도: 1×104 sporangia/㎖)을 접종하고 병 발생을 유도한 후에 병조사를 실시하여 고추 역병 방제효과를 조사하였다. 무처리 대조구의 발병도는 백합 잎마름병은 50% 그리고 고추 역병은 38%로 둘 다에서 KRICT3 균주의 약효를 평가하기에 충분한 식물병 발생이 있었다.
Figure pat00008
상기 표 7에서도 확인할 수 있듯이, 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주는 백합 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과로 20℃에서 10일 동안 배양한 배양액을 243배(4.1×105 spores/㎖) 희석한 용액으로 살포한 경우에도 95%의 높은 방제효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 고추 역병에 대한 방제효과는 백합 잎마름병에 비하여 방제효과가 다소 낮으나 27배(3.6×106 spores/㎖) 희석액도 79%의 높은 방제효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
4) 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 약효 지속성
심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주를 감자액체배지에 접종하고 20℃에서 10일 동안 150 rpm으로 진탕배양 하였다. 상기 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주의 배양액을 2겹 가제로 걸러 균체를 제거하고 멸균 증류수로 희석하여 각각 1×107 spores/㎖와 1×108 spores/㎖ 농도의 KRICT3 균주 포자현탁액을 준비하였다. 20±5℃의 온실에서 약 2개월 동안 재배한 토마토 식물에 두 농도의 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주 포자현탁액을 각각 접종 1일, 2일, 3일, 5일. 7일 전에 살포하고 온실에서 재배한 후에 잿빛곰팡이병균(병원균: Botrytis cinerea, 포자 농도: 5×105 spores/㎖)을 접종하고, 병 발생을 유도한 후에 병조사를 실시하여 잿빛곰팡이병 방제효과를 조사하였다. 무처리 대조구의 발병도는 50% 이상으로 KRICT3 균주의 약효를 평가하기에 충분한 토마토 잿빛곰팡이병 발생이 있었다.
Figure pat00009
상기 표 8에서도 확인할 수 있듯이, 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주를 1×108개 포자/㎖ 농도로 처리하고 온실에서 7일 동안 재배한 후에 잿빛곰팡이병균을 접종하여도 완벽하게 잿빛곰팡이병을 방제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주를 1×108개 포자/㎖ 농도로 처리한 경우에는 처리 3일 후까지는 92% 이상의 방제효과를 그리고 처리 5일 후에는 78%의 높은 방제효과를 나타내었다. 따라서 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주는 토마토 식물에 살포한 후에도 오랫동안 식물체 표면에서 생존하며 잿빛곰팡이병을 방제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC11765BP 20100915
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Simplicillium lamellicola KRICT3 strain, composition for control plant diseases and control method of plant diseases with same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 774 <212> DNA <213> Simplicillium lamellicola <220> <221> gene <222> (1)..(774) <223> 28S rDNA <400> 1 ttgccccagt aacggcgagt gaagcggcaa cagctcaaat ttgaaatctg gctcctagag 60 tccgaattgt aatttgcaga ggatgctttt gatgcggtgc cttccgagtt ccctggaacg 120 ggacgccata gagggtgaga gccccgtctg gtcggatgcc aaatctctgt aaagctcctt 180 cgacgagtcg agtagtttgg gaatgctgct ctaaatggga ggtatatgtc ttctaaagct 240 aaatattggc cagagaccga tagcgcacaa gtagagtgat cgaaagatga aaagcacttt 300 gaaaagaggg ttaaaaagta cgtgaaattg ttgaaaggga agcgcctatg accagacttg 360 ggcccggtga atcatccagc gttctcgctg gtgcactttg ccgggcacag gccagcatca 420 gtttgccttg ggggaaaaag gctttgggaa tgtagctcct tcgggagtgt tatagaccat 480 tgcataatac cctggggcgg actgaggttc gcgcatctgc aaggatgctg gcgtaatggt 540 catcagcgac ccgtcttgaa acacggacca aggagtcgtc ttcgtatgcg agtgttcggg 600 tgtaaaaccc ctacgcgtaa tgaaagtgaa cgcaggtgag agcttcggcg catcatcgac 660 cgatcctgat gttctcggat ggatttgagt aagagcatac ggggccggac ccgaaagaag 720 gtgaactatt cctgtatagg gtgaagccag aggaaactct ggtggaggct cgca 774 <210> 2 <211> 551 <212> DNA <213> Simplicillium lamellicola <220> <221> gene <222> (1)..(551) <223> ITS region <400> 2 attaacgagt tatacaactc ccaaaccctt tgtgaacctt accacttacg ttgcttcggc 60 ggaacgcgct ggtgtcgccc tcacgggtgc cccaggtcaa cgcgcccgcc ggggactaca 120 aactcttgat tttgcgaaag cagtattctt ctgagtggcc gaaaggcaaa aaaacaaatg 180 aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcaaaat 240 gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc 300 gcccgccagc attctggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct cgacttcacg 360 tctttacgga cgagaagccg gtgttggggc gcggcgatcg agcctagctc gcgccggctc 420 cgaaatttag tggcggcccg ttgcggcgac ctctgcgtag taacttaacc tcgcactggg 480 acagcagcgc ggccacgccg taaaaccccc gactttttta aggttgacct cgaatcaggt 540 aggactaccc g 551

Claims (6)

  1. 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3 균주(KCTC 11765BP).
  2. 심플리실리움 라멜리콜라(Simplicillium lamellicola) KRICT3 균주(KCTC 11765BP), 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 식물병이 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병, 고추 역병, 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 잿빛곰팡이병, 백합 잎마름병 및 보리 흰가루병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 식물병이 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 코클리오볼루스 헤테로스트로푸스(Cochliobolus heterostrophus), 마그나포르테 오리자(Magnaporthe oryzae), 보트리티스 씨네리(Botrytis cinerea), 보트리티스 알리(Botrytis allii), 스클레로티니아 스크레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리쿰 오르비쿨라레(Colletotrichum orbiculare), 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici), 파이토프쏘라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 피티움 그라미니콜라(Pythium graminicola) 및 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG1 등에 의해 발생하는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
  5. 제 2 항의 식물병 방제용 조성물을 식물이 생장하고 있는 환경 또는 식물에 처리하는 것을 포함하는, 식물병 방제방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 심플리실리움 라멜리콜라 KRICT3 균주를 1×104 내지 1×109 포자/㎖의 양으로 처리하는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제방법.
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