RU2673155C1 - Штамм Bacillus amyloliquefaciens, обладающий антибактериальной и фунгистатической активностью, и микробиологический препарат на его основе против болезни растения, вызываемой фитопатогенным микроорганизмом - Google Patents
Штамм Bacillus amyloliquefaciens, обладающий антибактериальной и фунгистатической активностью, и микробиологический препарат на его основе против болезни растения, вызываемой фитопатогенным микроорганизмом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2673155C1 RU2673155C1 RU2017138604A RU2017138604A RU2673155C1 RU 2673155 C1 RU2673155 C1 RU 2673155C1 RU 2017138604 A RU2017138604 A RU 2017138604A RU 2017138604 A RU2017138604 A RU 2017138604A RU 2673155 C1 RU2673155 C1 RU 2673155C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- ab8b
- strains
- amyloliquefaciens
- plants
- Prior art date
Links
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 title claims abstract description 74
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 title claims description 41
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 26
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 25
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims description 11
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 title claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 58
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 55
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 34
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 claims description 25
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 19
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 16
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 14
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 claims description 9
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 8
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000008406 SarachaNachtschatten Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 claims description 6
- 235000004790 Solanum aculeatissimum Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000008424 Solanum demissum Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000018253 Solanum ferox Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000000208 Solanum incanum Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000013131 Solanum macrocarpon Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000009869 Solanum phureja Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000000341 Solanum ptychanthum Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000017622 Solanum xanthocarpum Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000219104 Cucurbitaceae Species 0.000 claims description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 3
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 claims 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 claims 1
- 235000002560 Solanum lycopersicum Nutrition 0.000 claims 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 abstract description 24
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 5
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 abstract description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 42
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 20
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 15
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 241001187099 Dickeya Species 0.000 description 13
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 13
- 241000588702 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Species 0.000 description 12
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 241001148142 Pectobacterium atrosepticum Species 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 7
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 6
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 description 6
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 6
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 6
- 241000531155 Pectobacterium Species 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 6
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241001160201 Dickeya solani Species 0.000 description 5
- 241001047487 Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense Species 0.000 description 5
- 241000556406 Pectobacterium wasabiae Species 0.000 description 5
- 240000002307 Solanum ptychanthum Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002351 pectolytic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 4
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- 241000221787 Erysiphe Species 0.000 description 4
- 241001281802 Pseudoperonospora Species 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 4
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 3
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001961 Alternariosis Diseases 0.000 description 2
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 2
- 241000193833 Bacillales Species 0.000 description 2
- 241001249117 Bacillus mojavensis Species 0.000 description 2
- 241000563903 Bacillus velezensis Species 0.000 description 2
- 241001480061 Blumeria graminis Species 0.000 description 2
- 241000219122 Cucurbita Species 0.000 description 2
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 2
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000521936 Pseudomonas amygdali pv. lachrymans Species 0.000 description 2
- 241001281805 Pseudoperonospora cubensis Species 0.000 description 2
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 2
- 241001361634 Rhizoctonia Species 0.000 description 2
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 2
- 241000221696 Sclerotinia sclerotiorum Species 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N alpha-D-galacturonic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 2
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 2
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylcyclopentane-1,2-dione Chemical compound CC1CC(C)C(=O)C1=O MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- ZOCSXAVNDGMNBV-UHFFFAOYSA-N 5-amino-1-[2,6-dichloro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-4-[(trifluoromethyl)sulfinyl]-1H-pyrazole-3-carbonitrile Chemical compound NC1=C(S(=O)C(F)(F)F)C(C#N)=NN1C1=C(Cl)C=C(C(F)(F)F)C=C1Cl ZOCSXAVNDGMNBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000123646 Allioideae Species 0.000 description 1
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 1
- 241000213004 Alternaria solani Species 0.000 description 1
- 241000219317 Amaranthaceae Species 0.000 description 1
- 241000208173 Apiaceae Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000278457 Bacillus siamensis Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 1
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 1
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 235000002243 Daucus carota subsp sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241001338022 Daucus carota subsp. sativus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 239000005899 Fipronil Substances 0.000 description 1
- 241000897260 Frenkelia Species 0.000 description 1
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 description 1
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001442495 Mantophasmatodea Species 0.000 description 1
- 206010027146 Melanoderma Diseases 0.000 description 1
- 241000427649 Melongena Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000002245 Penicillium camembertii Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001123569 Puccinia recondita Species 0.000 description 1
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 description 1
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000013736 caramel Nutrition 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 229940013764 fipronil Drugs 0.000 description 1
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 230000001863 plant nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 1
- 230000002940 repellent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Inorganic materials [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- -1 termiteicide Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Заявленная группа изобретений включает штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens Аб8б (ВКПМ В-12792), обладающий антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, и микробиологический препарат на его основе. Микробиологический препарат содержит штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens Аб8б (ВКПМ В-12792) в виде живых бактериальных клеток или спор, или их комбинации в различном соотношении. Заявленная группа изобретений позволяет повысить всхожесть семян сельскохозяйственных растений и увеличить выход биомассы сельскохозяйственных растений. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 8 табл., 3 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к сельскому хозяйству, более точно - к агрохимии и биологической защите растений, в частности, к выделенным бактериальным штаммам Bacillus amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, а также применению микробиологического препарата на основе таких штаммов для борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур, таких как овощные и зерновые культуры, вызываемыми фитопатогенными бактериями и грибами.
Описание предшествующего уровня техники
Повышение урожайности сельскохозяйственных культур и сохранение урожая - есть одна из наиболее важных задач в сельском хозяйстве, на решение которой ежегодно тратятся значительные ресурсы. В частности, значительное внимание уделяется защите овощных и зерновых культур, таких как, например, картофель и пшеница от болезней, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами. Например, среди болезней картофеля наиболее часто встречаются бактериозы, которые распространены повсеместно на территории России и уносят от 10 до 25% урожая. В некоторых районах страны во влажные годы потери урожая могут достигать 50%. К числу наиболее распространенных и вредоносных бактериальных болезней картофеля относятся черная ножка, также известная как гниль корневой шейки сеянцев (Фиг. 1А), и мягкая, или мокрая гниль (Фиг. 1Б), симптомы которых проявляются на растениях в период вегетации и на клубнях при хранении. Эти болезни вызывают три самостоятельных, но близкородственных вида пектолитических бактерий семейства Enterobacteriaceae, такие как принадлежащие к подвиду Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, виду Pectobacterium atrosepticum и роду Dickeyа (Игнатов A.H.,
Распространение возбудителей опасных бактериозов растений в Российской Федерации, Защита картофеля, 2014, 2:53-57).
Недавно в России была выявлена ранее не встречавшаяся болезнь тепличного огурца - бородатость корней, также называемая как «корневой мат» (root mat), «косматый корень», «бородатый корень» и т.п., возбудителем которой, как было установлено, является бактерия Agrobacterium spp. биовар 1 (Ходыкина М.В. и др., Новая бактериальная болезнь тепличного огурца, Гавриш, 2014, 3:24-29). Фитопатогенные бактерии, проникнув в растение и перенеся в его клетки фрагмент Т-ДНК (pRi ДНК), вызывают чрезмерное разрастание корневой системы огурца (Фиг. 2), при этом падает урожайность, ухудшается товарный вид плодов, растения быстрее нормы увядают и отмирают.
Известны болезни зерновых культур, такие как, например, Мучнистая роса пшеницы, вызываемая грибом Erysiphe graminis; альтернариоз (гриб Altemaria spp.) и фузариоз (гриб Fusarium spp.) пшеницы, а также черный бактериоз озимой пшеницы, вызываемый бактериями рода Xanthomonas spp.
Сельскохозяйственные предприятия на территории России, занимающиеся выращиванием овощных и зерновых культур, применяют различные разрешенные способы борьбы с фитопатогенами. Тем не менее, не все они дают желаемый результат: не стимулируют пассивный иммунитет растений, не повышают вовсе или в требуемой степени всхожесть семян и рост растений и/или их биомассу, урожайность, товарный вид плодов. Широко распространено применение пестицидов, однако они имеют существенные недостатки, например: токсичность как для сельскохозяйственных культур, так и для окружающей среды, вызывают ожог листьев, необходимость постоянно проводить поиск новых препаратов, так как уже после 3-4 обработок возможно появление устойчивых к пестицидам штаммов фитопатогенов, отрицательное субъективное восприятие потребителями. Фитопатогенные бактерии способны приобретать устойчивость к антибиотикам при их применении в качестве антибактериальных препаратов.
В связи с этим особое внимание уделяется биологическому способу защиты сельскохозяйственных растений, заключающемуся в том, что вместо пестицидов используют препараты на основе живых штаммов бактерий-антагонистов и продуктов их метаболизма. Использование бактерий-антагонистов для борьбы с бактериальными болезнями известно с 80-90-х годов, но их применение, в частности, против пектолитических бактерий изучено мало. Известно, что под влиянием бактерий-антагонистов фитопатогенные микроорганизмы вытесняются из прикорневой зоны (ризосферы) сельскохозяйственных растений, вследствие чего пагубное влияние фитопатогенных микроорганизмов значительно снижается или растения вовсе не подвергаются заражению. Подавление или полное уничтожение болезнетворных форм происходит под влиянием веществ, выделяемых бактериями-антагонистами. Антибиотические вещества оказывают свое бактерицидное действие в тканях растений, но в почве эти вещества утрачивают свои свойства (Вердеревский Д.Д., Иммунитет растений к паразитарным болезням. // Гос. изд-во сельхоз. лит-ры, 1959, 372 с.).
Известны способы защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов с использованием биопрепаратов, содержащих бактерии-антагонисты. Например, известно средство повышения продуктивности растений и их защиты от болезней, вызываемых фитопатогенными бактериями и грибами, содержащее штамм Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 с титром бактерий 104-109 клеток/мл (патент РФ №2599416 С1). Установлено, что указанный штамм проявляет антагонистические свойства в отношении возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, в частности, пшеницы озимой и яровой - против мучнистой росы (Erysiphe graminis), бурой ржавчины (Puccinia recondita), фузариозной корневой гнили (Fusarium culmorum), базального бактериоза (Pseudomonas syringae); картофеля - против фитофтороза (Phytophtora infestans), ризоктониоза (Rhizoctonia solani), фузариозного увядания (Fusarium oxysporum). Однако не было показано, что штамм Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 активен против бактерий родов Pectobacterium, Dickeya и Agrobacterium, также не известно его влияние на фитопатогенные микроорганизмы, вызывающие болезни растений семейства тыквенные (Cucurbitaceae).
Также известен биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от бактериальных и грибных болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия, содержащий биомассу из вегетативных клеток и спор бактерий вида Bacillus amyloliquefaciens (ВКПМ В-11008) с титром вегетативных клеток и спор 1,24-1,30×1010 KOE/мл и содержанием спор 94% от общего количества KOE (патент РФ №2478290 С2). Применение биопрепарата ограничено зерновыми культурами.
Также известен биологический препарат для защиты зерновых растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами, содержащий в виде активного начала культуральную жидкость штамма Bacillus amyloliquefaciens (ВКПМ В-11475) с титром 2-3×109 KOE/мл (патент РФ №2528058 С1).
Известна композиция, содержащая штаммы Bacillus amyloliquefaciens ВОТ SPO (DSMZ 29231) и STB / 01 (DSMZ 29232), для подавления, в частности, бактерии вида Ralstonia solanacearum, поражающей растения семейства пасленовые (Solanaceae), такие как, например, картофель, томат, баклажан (публикация заявки РСТ WO 2016046155 А1). Рабочая концентрация штаммов ВОТ SPO и STB / 01 в тепличном опыте с томатом была 2×1010-2×1014 KOE/мл при концентрации патогенной Ralstonia solanacearum 2×106 KOE/мл. Указанная композиция и входящие в ее состав штаммы ВОТ SPO и STB / 01 проявляли антагонистические свойства также в отношении бактерии подвида Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.
Известны штаммы Bacillus amyloliquefaciens RTI301 и RTI472, содержащие кластер генов биосинтеза лантипептида, проявляющего свойства лантибиотика, и композиции на их основе для улучшения роста растений и защиты их от инфекций (публикации заявок РСТ WO 2016109395 А1 и WO 2016109396 А1). Антагонистическая активность штаммов RTI301 и RTI472 против бактериальных и грибных фитопатогенов была подтверждена опытным путем, включая фитопатогены Alternaria solani и Fusarium graminearum, поражающие пшеницу (парша), Ralstonia solenacearum, Xanthomonas и Botrytis cinerea, поражающие томаты (пятнистость, коричнево-серая плесень), Sclerotinia sclerotiorum, поражающую фасоль (белая плесень), и фитопатогены, вызывающие мучнистую росу огурцов. Заявленная концентрация штаммов в композициях составляет 1×108-1×1012 КОЕ/мл. Влияние штаммов RTI301 и RTI472 на подавление бактерий родов Pectobacterium, Dickeya и Agrobacterium и грибов родов Erysiphe и Pseudoperonospora (оомицет) в опубликованных патентных заявках опытным путем не изучалось.
Однако, отсутствуют данные, которые описывали бы бактериальные штаммы Bacillus amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 и микробиологический препарат на их основе, обладающие ярко выраженной антибактериальной и фунгистатической активностью, которые могут применяться для борьбы с различными болезнями, вызываемыми фитопатогенными бактериями и грибами, относящимися, в частности, к родам Pectobacterium, Dickeya, Agrobacterium, Erysiphe и Pseudoperonospora, поражающие овощные и зерновые культуры.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка микробиологического препарата на основе одного или нескольких бактериальных штаммов для борьбы с фитопатогенными бактериями и грибами, вызывающими болезни сельскохозяйственных культур, в частности, овощных и зерновых культур. Как следствие, другой задачей изобретения является разработка микробиологического препарата на основе одного или нескольких штаммов бактерий-антагонистов, применение которого способно улучшить всхожесть семенного материала сельскохозяйственных культур, питание и рост растений, повысить биомассу растений и их продуктивность, благоприятно влиять на сохранность семенного материала и урожая. Предоставление микробиологического препарата на основе бактериальных штаммов позволяет расширить арсенал технических средств, которые могут применяться для борьбы с фитопатогенами сельскохозяйственных овощных и зерновых культур. В частности, предоставляемый согласно изобретению препарат позволяет расширить арсенал технических средств, которые могут быть использованы для защиты от фитопатогенных бактерий и грибов, например, растений семейства пасленовые (Solanaceae), тыквенные (Cucurbitaceae) и зерновые (Роасеае). Указанные задачи были решены благодаря тому, что были выделены из природного источника и определены штаммы Bacillus amyloliquefaciens (В. amyloliquefaciens) Аб8б и В. amyloliquefaciens Аб60, которые, как было найдено, обладают антибактериальной и фунгистатической активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов, вызывающих болезни растений семейства пасленовые, тыквенные и зерновые, в частности, картофеля, огурца и пшеницы, соответственно.
Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является предоставление штамма Bacillus amyloliquefaciens Аб60, депонированного в ВКПМ под номером В-12791, обладающего антибактериальной и фунгистатической активностью.
Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление штамма Bacillus amyloliquefaciens Аб8б, депонированного в ВКПМ под номером В-12792, обладающего антибактериальной и фунгистатической активностью.
Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление микробиологического препарата, содержащего штамм Bacillus amyloliquefaciens Aб8б, депонированный в ВКПМ под номером В-12792, против болезни растения, вызываемой фитопато генным микроорганизмом.
Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного микробиологического препарата, отличающегося тем, что фитопатогенный микроорганизм есть бактерия или гриб.
Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного микробиологического препарата, отличающегося тем, что титр указанного штамма, по меньшей мере, 1×104 КОЕ/мл.
Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного микробиологического препарата, отличающегося тем, что титр указанного штамма от 1×104 КОЕ/мл до 1,5×109 КОЕ/мл.
Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного микробиологического препарата, отличающегося тем, что титр указанного штамма от 1×104 КОЕ/мл до 1×107 КОЕ/мл.
Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного микробиологического препарата, отличающегося тем, что указанный препарат также содержит штамм Bacillus amyloliquefaciens Аб60, депонированный в ВКПМ под номером В-12791.
Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного микробиологического препарата, отличающегося тем, что титр указанного штамма Bacillus amyloliquefaciens Аб60, по меньшей мере, 1×104 КОЕ/мл.
Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного микробиологического препарата, отличающегося тем, что указанное выше растение принадлежит к семейству пасленовые (Solanaceae), тыквенные (Cucurbitaceae) или зерновые (Роасеае).
Также аспект настоящего изобретения - предоставление вышеописанного микробиологического препарата, отличающегося тем, что растение есть картофель , томат , огурец (Cucumis sativus) или пшеница (Triticum).
Краткое описание Фигур
Фигура 1 показывает растение картофеля, пораженное болезнью «черная ножка» (место поражения указано стрелкой), которая вызвана бактерией рода Dickeya (А) и мягкой гнилью, которая вызвана бактерией подвида Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum (Б).
Фигура 2 показывает растение тепличного огурца, пораженного болезнью «корневой мат».
Фигура 3 показывает результаты ПЦР-анализа 16S рДНК штамма В. amyloliquefaciens Аб8б (А) и В. amyloliquefaciens Аб60 (Б). Дорожки: 1 - маркер длин ДНК (1 kb DNA, GeneRuler), снизу-вверх: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 и 250 п. н.; 2 - реакционная смесь, содержащая ДНК-фрагмент длиной 747 п. н., полученный с помощью ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров Р6 и Р7.
Фигура 4 показывает результаты изучения антагонистической активности штаммов В. amyloliquefaciens Аб60 и Аб60 в отношении бактерий подвида Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (А) и вида Pectobacterium atrosepticum (Б).
Фигура 5 показывает общий вид контрольной (А) и тестовой (Б) делянок растений картофеля в с. Горшково.
Фигура 6 показывает общий вид контрольной (А) и тестовой (Б) делянок растений картофеля в с. Рогачево.
Фигура 7 показывает результаты обработки растений картофеля микробиологическим препаратом в с. Горшково (А) и с. Рогачево (Б).
Фигура 8 показывает динамику накопления урожая растениями картофеля на делянках в с. Горшково (А) и с. Рогачево (Б).
Описание способов осуществления изобретения
Настоящее изобретение более подробно будет описано ниже с приведением не ограничивающих настоящее изобретение Примеров.
Штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 выделены в 2015 году из растений озимой пшеницы (Triticum aestivum L.), выращенной в Московской области в природных условиях. Как показано в нижеследующих Примерах, полученные бактериальные штаммы Аб8б и Аб60 проявляют антагонистические свойства, т.е. выступают как бактерии-антагонисты в отношении фитопатогенных бактерий, относящихся, например, к роду Pectobacterium, в частности, подвидам Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum и Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, видам Pectobacterium atrosepticum и Pectobacterium wasabiae, роду Dickeya, в частности, виду Dickeya solani, и роду Agrobacterium, в частности, виду Agrobacterium rhizogenes, а также грибов, относящихся, например, к роду Erysiphe, в частности, виду Erysiphe cichoracearum, роду Pseudoperonospora, в частности, виду Pseudoperonospora cubensis, и роду Sclerotinia, в частности, виду Sclerotinia sclerotiorum. Ввиду того, что штаммы бактерий могут проявлять антагонистические свойства в отношении различных семейств, родов и видов фитопатогенных бактерий и грибов (см. например, RU 2528058 C1, WO 2016109395 А1 и WO 2016109396 А1), для специалиста в данной области техники очевидно, что штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 могут быть антагонистами не только в отношении вышеуказанных фитопатогенных бактерий и грибов, относящихся к родам Pectobacterium, Dickeya, Agrobacterium, Erysiphe, Pseudoperonospora и Sclerotinia, но других фитопатогенных бактерий и грибов, таких как, например, относящихся к родам Pseudomonas, Fusarium и др. Следовательно, микробиологический препарат согласно изобретению, содержащее, по меньшей мере, штамм В. amyloliquefaciens Аб8б, может применяться не только в отношении фитопатогенных микроорганизмов, для которых антагонистический эффект подтвержден опытным путем в нижеследующих Примерах, но также и в отношении других бактериальных и грибных фитопатогенов, относящихся, например, к родам Pseudomonas, Fusarium, Rhizoctonia, Alternaria, Aspergillus и др. Наличие или отсутствие антагонистической активности штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, а также степень такой активности можно определить, используя известные специалисту в данной области техники способы определения антибактериальной и фунгистатической активности штаммов бактерий-антагонистов. Например, антибактериальную активность тестируемого штамма можно определить, оценивая степень подавления им роста фитопатогенного штамма в среде, содержащей тестируемый и фитопатогенный штамм, как описано, в частности, в Примерах или патенте РФ №RU 2528058 С1. Фунгистатическую активность тестируемого штамма можно определить, например, in vitro, используя метод двойных (встречных) культур или «агаровых блоков», высевая мицелий фитопатогенного гриба и тестируемый штамм бактерии-антагониста на чашку Петри с питательной средой (Ваксман З.А. Антагонизм микробов и антибиотические вещества. М.: Гос. изд-во иностр. лит., 1947. - 391 с.; Егоров Н.С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1957. - 78 с.).
Известно, что один и тот же вид фитопатогенного микроорганизма может вызывать болезнь у сельскохозяйственных культур, принадлежащих к различным семействам, родам, видам и подвидам. Например, бактерия подвида Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, относящаяся к пектолитическим бактериям ввиду ее свойства гидролизовать пектин между клеточными стенками растений, вызывает болезнь мягкую гниль, поражающую растения семейства пасленовые (Solanaceae), к которому относятся, в частности, картофель , томат , баклажан melongena); семейства зонтичные (Apiaceae), к которому относится, в частности, морковь посевная (Daucus carota subsp.sativus); семейства тыквенные (семейство Cucurbitaceae), к которому относятся, в частности, огурец (Cucumis sativus), тыква обыкновенная (Cucurbita реро) и кабачок (Cucurbita реро subsp. реро); семейства луковые (подсемейство Alliaceae), к которому относится, в частности, лук (Allium); и др. Также известно, что, например, бактерия вида Agrobacterium rhizogenes (Rhizobium rhizogenes), способная встраивать собственную Т-ДНК в геном растения, вызывает ветвистость корней у многих двудольных растений, в частности, огурца и томата, относящихся к различным семействам (Ходыкина М.В. и др., 2014), а бактерия вида Pseudomonas syringae pv. lachrymans вызывает угловатую пятнистость огурца, кабачка и тыквы (Игнатов А.Н., 2014). Следовательно, микробиологический препарат согласно изобретению, содержащий по меньше мере штамм В. amyloliquefaciens Аб8б, может применяться не только для сельскохозяйственных культур, положительный эффект для которых подтвержден опытным путем в нижеследующих Примерах, включая растения картофеля, огурца и пшеницы озимой (Triticum aestivum L.), но также и для других культур, относящихся к семействам пасленовые, тыквенные и зерновые. Данное разъяснение касается также штамма В. amyloliquefaciens Аб60, который входит в состав микробиологического препарата согласно изобретению, и комбинации штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и В. amyloliquefaciens Аб60. Ввиду того, что штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 обладают антагонистической активностью в отношении многих фитопатогенных бактерий и грибов, допустимо, что микробиологический препарат может применяться не только для растений семейств пасленовые, тыквенные и зерновые, но и для растений других таксонов, таких как, например, семейство зонтичные и маревые (Amaranthaceae), подсемейство луковые, и др.
Микробиологический препарат согласно изобретению содержит, по меньшей мере, штамм В. amyloliquefaciens Аб8б, который может присутствовать в составе препарата в виде живых бактериальных клеток или спор, или их комбинации в различном соотношении. Концентрация штамма выбирается такой, чтобы он был способен проявлять антагонистическую активность в отношении фитопатогенного микроорганизма, являющегося возбудителем болезни, развитие которой подавляют. Фраза «антагонистическая активность» штамма В. amyloliquefaciens Аб8б, штамма В. amyloliquefaciens Аб60, их смеси или композиции, содержащей, по меньшей мере, один из указанных штаммов или оба штамма, например, микробиологический препарат как здесь описано, применяемая в отношении фитопатогенного микроорганизма, являющегося возбудителем болезни, развитие которой подавляют, может означать способность штамма В. amyloliquefaciens Аб8б, штамма В. amyloliquefaciens Аб60, их смеси или композиции, содержащей, по меньшей мере, один из указанных штаммов или оба штамма, ингибировать рост и/или размножение такого фитопатогенного микроорганизма. Фраза «антагонистическая активность» штамма В. amyloliquefaciens Аб8б, штамма В. amyloliquefaciens Аб60, их смеси или композиции, содержащей, по меньшей мере, один из указанных штаммов или оба штамма, также может означать способность штамма В. amyloliquefaciens Аб8б, штамма В. amyloliquefaciens Аб60, их смеси или композиции, содержащей, по меньшей мере, один из указанных штаммов или оба штамма, ингибировать рост и/или размножение фитопатогенного микроорганизма, так что развитие болезни, вызываемой этим фитопатогенным микроорганизмом, невозможно вовсе или замедлено по сравнению со случаем, когда указанные штаммы или их смесь или композиция не применяются.
Антагонистическая активность считается как наличествующая, т.е. присущая штамму В. amyloliquefaciens Аб8б или Аб60, их смеси или композиции, содержащей, по меньшей мере, один из указанных штаммов или оба штамма, если возможно ингибирование роста и/или размножения фитопатогенного микроорганизма в условиях применения указанных одного или обоих штаммов, или их смеси или композиции, содержащей, по меньшей мере, один из указанных штаммов или оба штамма. В условиях применения одного или нескольких штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 ингибирование возможно в степени большей, чем по сравнению с условиями, в которых один или оба таких штамма не применяются. То есть, ингибирование в условиях применения одного или нескольких штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 возможно в степени, по меньшей мере, 5%, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 100% по сравнению с условиями, в которых один или оба указанных штамма не применяются. Например, штамм В. amyloliquefaciens Аб8б может считаться как обладающий антагонистической активностью, если такой штамм или композиция, содержащая такой штамм, например, микробиологический препарат согласно изобретению, способен(на) ингибировать рост и/или размножение фитопатогенного микроорганизма, в отношении которого устанавливается антагонистическая активность, в степени, достаточной для определения антибактериальной активности тестируемого штамма Аб8б, которая может быть больше нуля, например, 5% и более как указано выше.
Микробиологический препарат согласно изобретению помимо штамма В. amyloliquefaciens Аб8б также может содержать компоненты, необходимые для поддержания его жизнеспособности, такие как, например, вода, дрожжевой экстракт, соли и микроэлементы. Состав таких компонентов и их соотношение могут варьироваться в зависимости от условий ферментации, в которых штамм Аб8б культивируется (выращивается) до получения требуемого титра, и они могут быть те, что приведены в нижеследующих Примерах. Кроме того, микробиологический препарат помимо штамма В. amyloliquefaciens Аб8б также может содержать штамм В. amyloliquefaciens Аб60. Следовательно, состав и соотношение компонентов в микробиологическом препарате также может зависеть от состава ферментационной среды, используемой для культивирования штамма Аб60. Соотношение компонентов в микробиологическом препарате, содержащем штаммы Аб8б и Аб60, определяется, в частности, титром каждого штамма, как разъяснено ниже.
Концентрация живых бактериальных клеток и спор штамма В. amyloliquefaciens Аб8б, штамма В. amyloliquefaciens Аб60 или их смеси в микробиологическом препарате (так называемый «титр») может быть выражена в колоний-образующих единицах (КОЕ), и такая концентрация может быть, по меньшей мере, 1×104 живых клеток и спор на 1 мл препарата. Например, титр может быть 1×104-1×107 живых клеток и спор на 1 мл препарата, готового к применению. Для удобства приготовления концентрированного раствора микробиологического препарата согласно изобретению титр может быть поддержан на уровне 1×109-1,5×109 живых клеток и спор на 1 мл концентрированного раствора препарата. Титр штаммов подбирают в зависимости, например, от вида сельскохозяйственной культуры, вида обрабатываемого материала (например, семена, клубни, растения и их части), фазы развития растения, степени заражения материала фитопатогенным микроорганизмом, вида фитопатогенного микроорганизма, состава почвы, погодных условий и т.д. Штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 могут быть взяты с требуемым титром по отдельности или таким образом, чтобы получить требуемый суммарный титр с различным соотношением штаммов. Например, в случае применения препарата, содержащего штаммы Аб8б и Аб60, доля титра штамма Аб8б может быть не менее 50% от общего титра обоих штаммов. Например, доля титра штамма Аб8б может быть не менее 67% от общего титра штаммов Аб8б и Аб60. Допустимо, что микробиологический препарат может содержать живые клетки штаммов Аб8б и/или Аб60, или споры таких штаммов, или смесь живых клеток и спор в различном соотношении. Например, в случае применения препарата, содержащего штамм Аб8б или Аб60, или смесь таких штаммов, титр живых клеток штамма или обоих штаммов может быть не менее 1×104 КОЕ/мл от общего титра живых клеток и спор. Например, титр живых клеток может быть 1×107 КОЕ/мл от общего титра живых клеток и спор.
Микробиологический препарат можно применять как таковой, то есть, например, такой, как указано выше, или в смеси с одним или несколькими другими компонентами (так называемый «баковый раствор»), такими как, например, один или несколько различных видов веществ, включая, но не ограничиваясь этим, гербицид, инсектицид, нематицид, термитицид, бактерицид, фунгицид, репеллент и т.д., полученные химическим и/или биологическим способом или выделенные из природных источников. Антибиотик и гербицид есть отдельные примеры пестицидов, которые могут применяться в смеси с микробиологическим препаратом согласно изобретению.
Микробиологический препарат можно применять в виде раствора, например, культуральной жидкости, суспензии или порошка, содержащего штамм В. amyloliquefaciens Аб8б и/или Аб60. Форма внесения препарата зависит от вида обрабатываемой сельскохозяйственной культуры, обрабатываемого материала (например, семена, клубни, растения и их части), части растения, фазы развития растения, времени года внесения препарата и т.д., что понятно для специалиста в данной области техники. Например, микробиологический препарат можно применять в виде водного раствора одного или обоих штаммов, содержащего при необходимости другие компоненты. Такой водный раствор можно использовать для обработки почвы и клубней картофеля в момент высевания, или для обработки семян, например, пшеницы перед высевом, или для обработки листьев, например, огурца в период роста растений и/или созревания плодов. Кроме того, возможна обработка микробиологическим препаратом урожая (плодов, клубней, семян) перед закладкой его на хранение или при транспортировке. Способы внесения микробиологического препарата обычные, и к ним относятся например, опрыскивание или внесение под корень, которые могут быть выполнены с применением стандартной сельскохозяйственной техники или устройств.
Примеры
Пример 1. Выделение и идентификация штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб0б.
1.1. Выделение штаммов.
Штаммы фитопатогенных пектолитических бактерий выделяли из промытых водой пораженных клубней картофеля, затем высевали на селективную среду CVP ( V. et al., Two new effective semiselective crystal violet pectate media for isolation of Pectobacterium and Dickeya, Plant Pathology, 2012, 61:339-345; HiMedia Laboratories, Crystal Violet Pectate Medium, кат. №M1392, http://www.himedialabs.com/td/m1392.pdf). Штаммы проверяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (Bio Rad, США), используя олигонуклеотидные праймеры на бактерии подвида Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum и видов Pectobacterium atrosepticum, Dickeya subsp. dianthicola и Dickeya solani, и методику из каталога MBI Fermentas (1998/1999, с. 146-157).
Штаммы (В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб0б) были выделены в 2015 году из растений озимой пшеницы, выращенной в Московской области в природных условиях. Выделенные штаммы хранили в стерильной воде при комнатной температуре или при -80°C. Перед опытами культуру клеток оживляли на агаризованной питательной среде YDC и высевали на агаризованную среду LB (Sambrook, J. and Russell, D.W. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).
Состав среды YDC (на 1 л воды), рН 7,0:
- дрожжевой экстракт (10,0 г),
- глюкоза (20,0 г),
- CaCO3 (20,0 г),
- агар (20,0 г).
Среду YDC стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм. избыточного давления в течение 30 мин.
1.2. Идентификация штаммов.
Штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб0б идентифицировали до вида.
Штаммы рассевали до отдельных колоний на среде LB при 29°C. ДНК выделяли известным способом выделения бактериальной ДНК (PCR Protocols. A Guide to methods and applications, ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J., 1989). Для наработки 16S рДНК (16S рибосомная ДНК) использовали «прямой» праймер P1 (SEQ ID NO: 1) и «обратные» праймеры Р2 (SEQ ID NO: 2) и Р3 (SEQ ID NO: 3), и выделенную ДНК в качестве матрицы. Условия проведения ПЦР были следующие: 95°C - 3 мин.; 95°C - 30 сек., 57°C - 30 сек., 72°C - 1 мин. 30 сек. (35 циклов); 72°C - 5 мин. ПЦР повторяли не менее двух раз. Полученную ДНК очищали методом электрофореза в агарозном геле (1,0%) при напряженности электрического поля 5 В/см в буфере ТАЕ (состав на 1 л, 50-ти кратный ТАЕ: Трис-основный (242 г), ледяная уксусная кислота (57 мл), ЭДТА (14,6 г), рН 8,0).
Состав среды LB (на 1 л воды), pH 7,2:
- дрожжевой экстракт (5,0 г),
- агар (15,0 г),
- триптон (10 г),
- NaCl (10 г).
Среду LB стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм. избыточного давления в течение 30 мин.
На основании выделенной 16S рДНК была синтезирована 16S рРНК (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ); Российская Федерация, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1, Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГБУ «ГосНИИгенетика») Минобрнауки России), нуклеотидную последовательность которой определяли на автоматическом секвенаторе (Illumina, Inc., США). Для анализа последовательностей использовали специализированные компьютерные программы (BioEdit, http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html; MEGA, http://www.megasoftware.net), предназначенные для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев (Pavlicek A. et al., Free-Tree-freeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap\jackknife analysis of tree robustness. Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia, Folia Biol. (Praha), 1999 45(3):97-99). В результате секвенирования вариабельных участков 16S рРНК штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 были получены нуклеотидные последовательности 16S рРНК штаммов Аб8б и Аб60. Нуклеотидные последовательности 16S рДНК, соответствующие нуклеотидным последовательностям 16S рРНК штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, представлены как SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, соответственно. В последовательностях SEQ ID NOs: 4 и 5 нуклеотид, обозначенный как «m», означает аденин или цитозин, «y» означает тимин или цитозин, «s» означает гуанин или цитозин.
1.2.1. Анализ вариабельных участков 16S рРНК штамма В. amyloliquefaciens Аб8б.
Анализ результатов секвенирования с использованием баз данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) и RDP-II (Ribosomal Database Project II, https://rdp.cme.msu.edu/) показал, что исследуемый штамм Аб8б принадлежит к систематическим группам Bacteria, Firmicutes, Bacillales, Bacillaceae, Bacillus.
Нуклеотидная последовательность 16S рРНК штамма Аб8б была выровнена с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank. Последовательности обрабатывали при помощи компьютерных программ BioEdit и MEGA. Полученные результаты показали, что 16S рРНК штамма Аб8б гомологична 16S рРНК бактерий Bacillus subtilis (DSM10, AJ276351), Bacillus mojavensis (IFO15718, AB021191), Bacillus subtilis (NRRL B-23049, AF074970), Bacillus amyloliquefaciens (NBRC 15535, AB255669), Bacillus siamensis (PD-A10, GQ281299) и Bacillus subtilis (DSM 22148, HE582781). 16S рРНК выделенного штамма Аб8б имела гомологию 99% с 16S рРНК некоторых видов бактерий рода Bacillus. Критерием отнесения штамма к тому или иному виду считали гомологию не менее 97%. По этому критерию исследуемый штамм Аб8б был отнесен к нескольким видам бактерий рода Bacillus.
Для более точной идентификации исследуемого штамма Аб8б использовали метод ПЦР с видоспецифичными праймерами Р4-Р17 как указано в Таблице 1. Условия проведения ПЦР были следующие: 94°C - 5 мин.; 94°C - 40 сек., температура «отжига» праймеров, t (Таблица 1) - 30 сек., 72°C - 20 сек. (30 циклов); 72°C - 5 мин. Полученные ДНК очищали методом электрофореза в агарозном геле как указано выше. При использовании праймеров Р6 и Р7 (Таблица 1), специфичных к Bacillus amyloliquefaciens, в результате ПЦР был получен ДНК-фрагмент длиной 747 п.н. (Фиг. 3А). При использовании других праймеров из Таблицы 1 ДНК-фрагменты получены не были. Таким образом, исследуемый штамм Аб8б был отнесен к виду Bacillus amyloliquefaciens. Штамм Bacillus amyloliquefaciens Аб8б депонирован 03 апреля 2017 г. во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под инвентарным номером В-12792 (Российская Федерация, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1, ФГБУ «ГосНИИгенетика» Минобрнауки России).
1.2.2. Анализ вариабельных участков 16S рРНК штамма В. amyloliquefaciens Аб60.
Анализ результатов секвенирования с использованием баз данных (Пример 1.2.1) показал, что исследуемый штамм Аб60 принадлежит к систематическим группам Bacteria, Firmicutes, Bacillales, Bacillaceae, Bacillus.
Нуклеотидная последовательность 16S рРНК штамма Аб60 была выровнена и результаты обработаны, как указано выше в Примере 1.2.1. Полученные результаты показали, что 16S рРНК штамма Аб60 гомологична 16S рРНК бактерий Bacillus subtilis (DSM10, AJ276351), Bacillus mojavensis (IF015718, AB021191), Bacillus subtilis (NRRL B-23049, AF074970), Bacillus siamensis (PD-A10, GQ281299), Bacillus amyloliquefaciens (DSM7, FN597644) и Bacillus subtilis (DSM 22148, HE582781). 16S pPHK выделенного штамма Аб60 имела гомологию 99% с 16S рРНК некоторых видов бактерий рода Bacillus. Критерием отнесения штамма к тому или иному виду считали гомологию не менее 97%. По этому критерию исследуемый штамм Аб60 был отнесен к нескольким видам бактерий рода Bacillus.
Для более точной идентификации исследуемого штамма Аб60 использовали метод ПЦР с видоспецифичными праймерами Р4-Р17 как указано в Таблице 1. ПЦР проводили и ДНК очищали, как указано в Примере 1.2.1. При использовании праймеров Р6 и Р7 (Таблица 1), специфичных к Bacillus amyloliquefaciens, в результате ПЦР был получен ДНК-фрагмент длиной 747 п.н. (Фиг. 3Б). При использовании других праймеров из Таблицы 1 ДНК-фрагменты получены не были. Таким образом, исследуемый штамм Аб60 был отнесен к виду Bacillus amyloliquefaciens. Штамм Bacillus amyloliquefaciens Аб60 депонирован 03 апреля 2017 г. во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под инвентарным номером В-12791 (Российская Федерация, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1, ФГБУ «ГосНИИгенетика» Минобрнауки России).
Пример 2. Изучение антагонистической активности штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 in vitro.
Активность штаммов-антагонистов изучали in vitro методом лунок или бляшек.
2.1. Метод лунок.
На чашках Петри в среде NBY стерильным пробковым сверлом просекали четыре лунки диаметром 5 мм каждая, при помощи пипетки наносили 100 мкл суспензии фитопатогена, шпателем Дригальского делали «газон», затем производили посев исследуемого штамма Аб8б или Аб60, внося в лунки при помощи пипетки 100 мкл культуральной жидкости. Каждый штамм вносили в концентрации 1×108 колоний-образующих единиц (KOE) на 1 мл. Чашки инкубировали при 29°C в течение 3-5 дней. Опыт проводи в 4-х кратной повторности. Диаметр зоны ингибирования роста измеряли в расстоянии (мм) от края лунки, также оценивали бактериостатическую активность (б.а.) и рост поверх «газона» (р.п.г.). Оценку проводили в сравнении с контролем (вода).
Состав среды NBY (на 1 л воды), pH 7,0:
- питательный бульон (8,0 г),
- дрожжевой экстракт (2,0 г),
- K2HPO4 (2,0 г),
- KH2PO4 (0,5 г),
- MgSO4 (0,246 г),
- глюкоза (2,5 г),
- агар (16,0 г).
Среду NBY стерилизовали автоклавированием при 0,5 атм. избыточного давления в течение 30 мин.
2.2. Метод бляшек.
На чашках Петри на среду NBY при помощи пипетки наносили 100 мкл культуральной жидкости, содержащей целевую бактерию, шпателем Дригальского делали «газон» и бактериологической петлей наносили чистую бактериальную культуру в виде бляшек. Чашки инкубировали при 29°C в течение 3-5 дней. Опыт проводили в 4-х кратной повторности. Диаметр зоны ингибирования роста измеряли в расстоянии (мм) от края лунки, также оценивали бактериостатическую активность (б.а.) и рост поверх «газона» (р.п.г.). Оценку проводили в сравнении с контролем (вода). Перед закладкой эксперимента штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 раздельно культивировали на твердой питательной среде NBY при температуре 29°C в течение 2-3 суток.
В качестве фитопатогенных бактерий использовали Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium wasabiae, Dickeya solani и Dickeya subsp. dianthicola (Таблица 2) из коллекции фитопатогенов ООО «Исследовательский Центр «ФитоИнженерия» (Российская Федерация, 141880 Московская область, Дмитровский район, с. Рогачево, ул. Московская, строение 58). Указанные бактерии также могут быть получены из Американской коллекции типовых культур, Манассас, штат Виргиния, Соединенные Штаты Америки (АТСС, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, U.S.A.; веб-сайт: www.lgcstandards-atcc.org), немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг, Германия (Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; 7B, 38124 Braunschweig, Germany; веб-сайт: www.dsmz.de) или выделены из природных источников с использованием известных методов, например: Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum (АТСС 15713), Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliensis (De Boer S.H. et al., Phytopathology, 2012, 102(10): 937-947), Pectobacterium atrosepticum (ATCC BAA-673), Pectobacterium wasabiae (ATCC 43316), Dickeya solani (DSM 28711) и Dickeya subsp. dianthicola (DSM 18054).
На Фиг. 4 в качестве примера показаны результаты изучения антагонистической активности штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 в отношении бактерий подвида Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum и вида Pectobacterium atrosepticum. В Таблице 2 приведены результаты изучения бактериостатической активности обоих штаммов в отношении исследуемых фитопатогенных бактерий. Из данных, приведенных в Таблице 2, следует, что штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 ингибируют рост и размножение бактерий подвидов Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum и Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis и видов Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium wasabiae, Dickeya solan и Dickeya subsp.dianthicola. Также из Таблицы 2 следует, что штамм В. amyloliquefaciens Аб8б проявляет более выраженное антагонистическое в отношении фитопатогенных бактерий свойство по сравнению со штаммом В. amyloliquefaciens Аб60.
Пример 3. Изучение антагонистической активности штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 на овощных и зерновых культурах.
3.1. Растения картофеля.
Полевые опыты с растениями картофеля проводили на полях возле села (с.) Горшково в пойме р. Яхрома и с. Рогачево Московской области.
с. Горшково: опыты закладывали на торфяно-болотной почве с орошением, почва состоит из растительных остатков и имеет кислотную реакцию, микробиологически активна, количество бактерий на 1 грамм почвы - 8,0×1011 KOE.
с. Рогачево: опыты закладывали на дерново-подзолистой легкосуглинистой почве без орошения, реакция почвы нейтральная, количество бактерий на 1 грамм почвы - 3,0×1010 KOE, пектолитические бактерии присутствуют, представлены псевдомонадами и энтеробактериями.
Исследуемый сорт картофеля - Айл оф Джура, первая репродукция. Повторность опыта - 3-х кратная. Общая площадь делянки - 360 м2 (3,6 м×100 м), учетная площадь делянки - 300 м2. Общая площадь делянки для 3-х повторов - 1080 м2 (360 м2×3). Расход семенного картофеля - 3,0 т/га, что соответствует 0,35 т на один опыт в 3-х повторах. В качестве контроля использовали обработку семенных клубней препаратом пестицидов, обработку в период вегетации не делали. Обработку проводили в процессе посадки семенного картофеля (в момент падения клубней из высаживающего аппарата картофелесажалки) опрыскиванием раствором пестицида с нормой расхода 80 л/га.
Состав препарата пестицидов (на 1 т.):
- препарат Юниформ (Syngenta, Швейцария; 0,5 л),
- препарат Регент 800 (Фипронил, BASF, Германия; 30 г),
- микроудобрения (2,0 л).
Штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 выращивали раздельно на твердой питательной среде NBY (Пример 2.1) и жидкой питательной среде NBY до достижения концентрации, по меньшей мере, 1×109 живых клеток и спор (КОЕ) на 1 мл культуральной жидкости. Затем готовили смесь микробиологического препарата и препарата пестицидов (баковая смесь) следующего состава:
- препарат пестицидов (1 т),
- микробиологический препарат (культуральная жидкость, содержащая штаммы Аб8б и Аб60 до конечной концентрации каждого штамма 1×104 КОЕ/мл или 1×107 КОЕ/мл; 0,6 л/т).
В случае тестового опыта обрабатывали клубни при посадке и растения в начале цветения (фаза бутонизации) микробиологическим препаратом, содержащим препарат пестицидов, т.е. баковой смесью, с нормой расхода 300 л/га.
Общий вид контрольных и тестовых делянок в с. Горшково (поле №92, дата посадки - 25.05.2016) и с. Рогачево (поле №230, дата посадки - 25.05.2016) приведен на Фиг. 5 и 6, соответственно. Из Фиг. 5 и 6 следует, что наземная часть растений картофеля на тестовых делянках (Б), обработанных препаратом, содержащим штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, выглядела значительно лучше по сравнению с контрольными делянками (А). Более точный анализ растений картофеля на полях в с. Горшково и с. Рогачево показал, что обработка растений препаратом, содержащим штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, благоприятно влияет на биомассу растений, в частности, повышается высота растения, увеличивается количество здоровых растений и число стеблей на 1 куст (Фиг. 7).
Анализ растений (с. Горшково) на содержание нитратов (NO3-) показал, что обработка растений картофеля препаратом, содержащим штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, способствует накоплению нитратов в листьях (Таблица 3). Также, анализ растений (с. Горшково) на содержание микроэлементов показал, что обработка растений картофеля препаратом, содержащим штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, способствует накоплению в листьях микроэлементов, таких как калий, фосфор и сера (Таблица 4). Данные эффекты следует рассматривать как положительные, т.к. накопление нитратов и микроэлементов в листьях картофеля во время цветения способствует увеличению массы клубней.
На Фиг. 8 показана динамика накопления урожая (в граммах с 1 м2) растениями картофеля на контрольных и тестовых делянках в с. Горшково и с. Рогачево. Из данных на Фиг. 8 следует, что растения картофеля, обработанные препаратом, содержащим штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, увеличивали массу клубней быстрее по сравнению с контрольными делянками. Применение антагонистов дало накопление урожая с одного куста на 80-й день после посадки 30,8% по сравнению с контрольным опытом, в котором штаммы не применялись (с.Рогачево, Фиг. 8Б).
Оценивали урожайность растений картофеля (в тоннах, т) с общей площади делянок для 3-х повторностей (с. Рогачево). Полученные данные представлены в Таблице 5. Как следует из Таблицы 5, растения картофеля, обработанные препаратом, содержащим штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, дали на 51% больше урожая по сравнению с контрольными растениями.
3.2. Растения огурца.
Антагонистические свойства штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 изучали в отношении физиологических, бактериальных и грибных болезней растений огурца. Отдельное внимание уделяли способности штаммов бактерий-антагонистов ингибировать рост и размножение фитопатогенной бактерии вида Agrobacterium rhizogenes, вызывающей болезнь бородатость корня (корневого мат) у растений огурца (Ходыкина М.В. и др., 2014). В качестве физиологических болезней рассматривали нехватку или переизбыток микро- и макроэлементов, бактериальных - угловатую пятнистость листьев огурца (возбудитель Pseudomonas syringae pv. lachrymans) и сосудистый бактериоз (возбудитель Xanthomonas spp.), грибных - мучнистую росу (возбудитель Erysiphe spp.), пероноспороз (возбудитель Pseudoperonospora cubensis, оомицет) и белую гниль (возбудитель Sclerotinia sclerotiorum).
Опыт с растениями огурца был проведен 20.01.2016 в агрофирме «Ольдеевская», г. Чебоксары. По результатам анализа 26 образцов почвы, субстрата, воды и растений была выбрана теплица, в которой бактериоз проявлялся наиболее заметно. Опыт проводили по схеме, приведенной в Таблице 6. Всего растений в опыте - 6336, в 1 клапане (1/4 теплицы). Сорт - гибрид Атлет (совместно с гибридом-опылителем Гладиатор), гидропонный метод выращивания, тип субстрата - Агроперлит (75%) и торф верховой (25%). Температурные условия в теплице при закладке опыта: влажность - ночью 80-90%, днем 70-80%; температура среднесуточная - от 18 до 20°C (ночью 16-18°C, днем 18-22°C). Дата первого учета: 20.01.2016, дата второго учета: 17.03.2016. Эффективность штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 оценивали по стабилизации числа пораженных растений и количеству растений без видимых симптомов поражения. Фитотоксичность использованных в опытах препаратов исследуемых штаммов Аб8б и Аб60 в отношении растений огурца не наблюдали.
Полученные данные представлены в Таблице 7. Как следует из Таблицы 7, штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, использованные в обработке по отдельности или в смеси, подавляли развитие физиологических, бактериальных и грибных болезней растений огурца в отличии от контрольного опыта, в котором штаммы не использовали. Наибольшую антагонистическую активность в отношении физиологических и грибных болезней проявлял штамм Аб8б по сравнению со штаммом Аб60. Был выявлен синергетический антагонистический эффект штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 против грибных болезней растений огурца (Таблица 7, опыты №2-4). Принимая во внимание тот факт, что внесенные в почву бактерии-антагонисты имеют свойство накапливаться, представляется целесообразным долгосрочное применение штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, что в масштабах отдельно взятой теплицы могло бы способствовать эффективному контролю бактериоза и грибных болезней, не угнетая при этом сами растения, что будет благоприятно влиять на урожайность.
3.3. Растения озимой пшеницы.
Антагонистические свойства штаммов В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 изучали в отношении болезней мучнистая роса, альтернариоз, базальный и черный бактериоз озимой пшеницы. Опыты проводили на семенах озимой пшеницы сорта Московская 39, посев 19.09.2016. Для обработки использовали препарат пестицида (контроль) и смесь препарата пестицида с культуральной жидкостью, содержащей штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60 (тест). Состав препарата пестицида и микробиологического препарата приведен в Примере 3.1. Масса обработанных семян - 3 т на 1 опыт, дата первого учета: 18.10.2016. Полученные данные приведены в Таблице 8. Как следует из Таблицы 8, растения озимой пшеницы, семена которых были обработаны препаратом, содержащим штаммы В. amyloliquefaciens Аб8б и Аб60, имели повышенную массу и длину надземной части по сравнению контрольными растениями.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучшие способы осуществления изобретения, для специалиста в данной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
* - Сокращения:
Р.с.с. - Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum,
P.c.b. - Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis,
P.a. - Pectobacterium atrosepticum,
P.w. - Pectobacterium wasabiae,
D.s. - Dickeya solani,
D.d. - Dickeya subsp. dianthicola.
** - Диаметр зоны подавления (в мм) роста культуры фитопатогенной бактерии.
* 1) суммарная концентрация живых бактериальных клеток и спор, 2) в случае смеси штаммов - общая концентрация штаммов Аб8б и Аб60
1) частота встречаемости болезней (в %),
2) нехватка или переизбыток микро- и макроэлементов,
3) угловатая пятнистость листьев огурца, сосудистый бактериоз,
4) мучнистая роса, пероноспороз, белая гниль
* - значения представлены как «среднее ± стандартное отклонение» и получены для средних значений 4-х повторов (в каждом повторе 30 растений, всего 120 растений в одном опыте)
Claims (9)
1. Штамм Bacillus amyloliquefaciens Аб8б, депонированный в ВКПМ под номером В-12792, обладающий антибактериальной и фунгистатической активностью.
2. Микробиологический препарат против болезни растения, вызываемой фитопатогенным микроорганизмом, выбранным из бактерии и гриба, содержащий штамм Bacillus amyloliquefaciens Аб8б, депонированный в ВКПМ под номером В-12792.
3. Микробиологический препарат по п. 2, отличающийся тем, что титр указанного штамма по меньшей мере 1×104 КОЕ/мл.
4. Микробиологический препарат по п. 3, отличающийся тем, что титр указанного штамма от 1×104 КОЕ/мл до 1,5×109 КОЕ/мл.
5. Микробиологический препарат по п. 4, отличающийся тем, что титр указанного штамма от 1×104 КОЕ/мл до 1×107 КОЕ/мл.
6. Микробиологический препарат по любому из пп. 2-5, отличающийся тем, что указанный препарат также содержит штамм Bacillus amyloliquefaciens Аб60, депонированный в ВКПМ под номером В-12791.
7. Микробиологический препарат по п. 6, отличающийся тем, что титр указанного штамма Bacillus amyloliquefaciens Аб60 по меньшей мере 1×104 КОЕ/мл.
8. Микробиологический препарат по п. 2, отличающийся тем, что указанное растение принадлежит к семейству пасленовые (Solanaceae), тыквенные (Cucurbitaceae) или зерновые (Роасеае).
9. Микробиологический препарат по п. 8, отличающийся тем, что растение есть картофель (Solanum tuberosum), томат (Solanum lycopersicum), огурец (Cucumis sativus) или пшеница (Triticum).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017138604A RU2673155C1 (ru) | 2017-11-08 | 2017-11-08 | Штамм Bacillus amyloliquefaciens, обладающий антибактериальной и фунгистатической активностью, и микробиологический препарат на его основе против болезни растения, вызываемой фитопатогенным микроорганизмом |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2017138604A RU2673155C1 (ru) | 2017-11-08 | 2017-11-08 | Штамм Bacillus amyloliquefaciens, обладающий антибактериальной и фунгистатической активностью, и микробиологический препарат на его основе против болезни растения, вызываемой фитопатогенным микроорганизмом |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2673155C1 true RU2673155C1 (ru) | 2018-11-22 |
Family
ID=64556484
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017138604A RU2673155C1 (ru) | 2017-11-08 | 2017-11-08 | Штамм Bacillus amyloliquefaciens, обладающий антибактериальной и фунгистатической активностью, и микробиологический препарат на его основе против болезни растения, вызываемой фитопатогенным микроорганизмом |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2673155C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2724538C1 (ru) * | 2019-10-25 | 2020-06-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) | Средство для стимуляции роста меристемной культуры Solanum tuberosum |
RU2808722C1 (ru) * | 2023-02-16 | 2023-12-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты овощных растений от грибных и бактериальных болезней |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2478290C2 (ru) * | 2011-11-11 | 2013-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Бациз" | Биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия |
RU2528058C1 (ru) * | 2013-06-04 | 2014-09-10 | Федеральное государственное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты зерновых растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами |
RU2599416C1 (ru) * | 2015-09-02 | 2016-10-10 | Общество с ограниченной ответственностью "БИСОЛБИ ПЛЮС" | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ |
-
2017
- 2017-11-08 RU RU2017138604A patent/RU2673155C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2478290C2 (ru) * | 2011-11-11 | 2013-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Бациз" | Биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия |
RU2528058C1 (ru) * | 2013-06-04 | 2014-09-10 | Федеральное государственное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты зерновых растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами |
RU2599416C1 (ru) * | 2015-09-02 | 2016-10-10 | Общество с ограниченной ответственностью "БИСОЛБИ ПЛЮС" | ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum BS89 В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ И ИХ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
СИРАЕВА З.Ю. Биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008. Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Казань, 2012, с. 5-22. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2724538C1 (ru) * | 2019-10-25 | 2020-06-23 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Тюменский научный центр Сибирского отделения РАН" (ТюмНЦ СО РАН) | Средство для стимуляции роста меристемной культуры Solanum tuberosum |
RU2808722C1 (ru) * | 2023-02-16 | 2023-12-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты овощных растений от грибных и бактериальных болезней |
RU2814716C1 (ru) * | 2023-07-26 | 2024-03-04 | Общество с ограниченной ответственностью "Листерра" | Биологический препарат с высокой ростостимулирующей и противогрибковой активностью |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111356761B (zh) | 用于植物病原体的生物防治的方法和组合物 | |
Yao et al. | Biological control of potato late blight using isolates of Trichoderma | |
Li et al. | Antibacterial activity of Lansiumamide B to tobacco bacterial wilt (Ralstonia solanacearum) | |
JP5567634B2 (ja) | バチルスバリスモルティスbs07m菌株、微生物製剤、及び作物育成方法 | |
Jones et al. | Biocontrol of Sclerotinia sclerotiorum infection of cabbage by Coniothyrium minitans and Trichoderma spp. | |
KR100800566B1 (ko) | 크랩시엘라 옥시토카 c1036 균주 및 이를 이용한 식물의생장 촉진과 식물병 방제 및 환경 스트레스에 대한 피해감소 방법 | |
Arfaoui et al. | Isolation, identification and in vitro characterization of grapevine rhizobacteria to control ochratoxigenic Aspergillus spp. on grapes | |
Nagendran et al. | Exploiting endophytic bacteria for the management of sheath blight disease in rice | |
US20220132862A1 (en) | Pseudomonas sp. strain, composition comprising the same, and uses thereof | |
KR101667541B1 (ko) | 신규미생물 바실러스 메틸로트로피쿠스 gh1-13과 이를 함유하는 미생물제제 및 미생물농약 | |
KR20140127670A (ko) | 식물 내생세균 바실러스 메칠로트로피쿠스 yc7007 균주 및 이를 이용한 다기능 생물농약 및 미생물비료 개발 | |
KR20140071145A (ko) | 신균주인 페니바실러스 폴리믹사 ab-15 균주 및 이의 용도 | |
WO2005104853A1 (ja) | 植物病害の発生を抑制する微生物農薬 | |
KR101250020B1 (ko) | 심플리실리움 라멜리콜라 krict3 균주, 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 식물병 방제방법 | |
Keerthana et al. | Deciphering the role of Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens in the management of late blight pathogen of potato, Phytophthora infestans | |
Pill et al. | Application method and rate of Trichoderma species as a biological control against Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp. in the production of microgreen table beets (Beta vulgaris L.) | |
US20220079165A1 (en) | Formulation for protection against kiwi bacteriosis, caused by the bacterium pseudomonas syringae pv. actinidiae (psa) | |
KR101524651B1 (ko) | 스트렙토마이세스 그리시우스 s4-7'' 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 | |
Ferro et al. | BACTERIA FOR COTTON PLANT PROTECTION: DISEASE CONTROL, CROP YIELD AND FIBER QUALITY1 | |
WO2014185419A1 (ja) | ボーベリア・バッシアナ12b菌株及び該菌株を用いた微生物農薬 | |
KR101498155B1 (ko) | 신규한 패니바실러스 속 균주를 이용한 감자 생산 증진 방법 | |
KR20190136009A (ko) | 미츠아리아속에 속하는 균주 및 그 균주를 사용한 미생물 농약 | |
RU2673155C1 (ru) | Штамм Bacillus amyloliquefaciens, обладающий антибактериальной и фунгистатической активностью, и микробиологический препарат на его основе против болезни растения, вызываемой фитопатогенным микроорганизмом | |
Eliwa et al. | Control of root rot disease of sugar beet using certain antioxidants and fungicides | |
KR20190086947A (ko) | 식물병 방제 효과를 가지는 얼위니아 게런덴시스(Erwinia gerundensis) KUDC9201 균주 및 이의 이용 |