RU2808722C1

RU2808722C1 - Штамм бактерий bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты овощных растений от грибных и бактериальных болезней

Info

Publication number: RU2808722C1
Application number: RU2023103609A
Authority: RU
Inventors: Наталия Ивановна Кузнецова; Юрий Евгеньевич Козловский
Filing date: 2023-02-16
Publication date: 2023-12-04

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству. Предложен штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием против фитопатогенов. Предложен также биопрепарат для защиты овощных растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями. Указанный биопрепарат представляет собой смесь указанного штамма с титром 2-4×10⁹ КОЕ/мл и целевых добавок, иммобилизованную на мелкодисперсных гранулах диатомита, при этом соотношение по объему смесь: гранулы диатомита составляет 1:5. Группа изобретений позволяет обеспечить защиту овощных растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными микроскопическими грибами и бактериями. 2 н.п. ф-лы, 6 табл., 7 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к производству и применению биологических средств защиты растений от поражения фитопатогенными грибами и бактериями. Микроорганизмы являются наиболее востребованными продуцентами различных соединений и обладают широким спектром антагонистической активности. Большинство бактериальных препаратов представляют собой продукт микробиологического синтеза на основе спор и вегетативных клеток бациллярных штаммов, губительных для фитопатогенных грибов и бактерий.

Уровень техники

Поиск новых штаммов-антагонистов является одной из актуальных задач биотехнологии. Бактерии рода Bacillus могут рассматриваться как объекты, имеющие наибольший потенциал в системе поиска новых биологически активных соединений с фунгицидным спектром антагонистической активности [Азизбекян P.P. Биологические препараты для защиты сельскохозяйственных растений. (Обзор). Биотехнология, 2018, т. 34, №5, 37-47.].

Среди микроорганизмов, продуцирующих биологически активные соединения различной направленности, особое место занимают спорообразующие грамположительные бактерии рода Bacillus, имеющие наибольшее значение для биологической защиты растений. Интерес к этим бактериям обусловлен также отсутствием у них токсичности для теплокровных животных.

Защита сельскохозяйственных растений - овощных культур, картофеля, зерновых и фруктов - от болезней является серьезной экономической проблемой. Ежегодные потери сельского хозяйства достигают нескольких миллиардов рублей. К числу экономически значимых заболеваний растений относятся болезни, вызываемые фитопатогенными микроскопическими грибами и бактериями. Овощные культуры (огурцы, томаты, кабачки, патиссоны, баклажаны, капуста и другие) подвержены болезням грибной этиологии, которые не только снижают на 20-30% уровень сельскохозяйственной продукции, но и снижают качество семенного материала (всхожесть, скорость роста). Фитопатогенные грибы продуцируют высокотоксичные и канцерогенные метаболиты, загрязняющие овощи и продукты их переработки.

Используемые химические средства борьбы с грибными болезнями («Альто», «Раксил», «Фундазол», «Фоликур», «Максим» и др.) недостаточно эффективны (не более 50-60%), следовательно, требуется разработка новых экологически безопасных и эффективных фунгицидов для защиты растений. Химические фунгициды индуцируют резистентность у возбудителей болезней, оказывают ряд побочных эффектов на окружающую среду, вызывают фитотоксический эффект, способны накапливаться в окружающей среде. После их применения имеется т.н. период ожидания, т.е. регламентировано время сбора урожая и появления на обработанных участках людей и техники. Серьезную опасность представляют химические фунгициды, применяемые для обработки и готовой сельскохозяйственной продукции, поскольку известно отрицательное влияние химических препаратов на человека и животных. В качестве альтернативных средств защиты растений могут быть использованы биологические препараты, основу которых составляют метаболиты бактериального происхождения, оказывающие антагонистическую активность по отношению к различным возбудителям. Основные преимущества биопрепаратов: высокая эффективность, экологическая безопасность выращенной продукции и безопасность людей, которые ее выращивают и потребляют. При использовании биопрепаратов легко получать высокий урожай экологически чистой овощной продукции.

Биофунгициды на основе бациллярных штаммов получают наиболее широкое распространение в последнее время. Связано это со способностью данных микроорганизмов образовывать споры, которые обладают повышенной устойчивостью к физическим, химическим и биологическим стрессам. Данным свойством бацилл обусловлена повышенная технологичность препаратов на их основе. В частности, бациллярными биофунгицидами возможно: обрабатывать семена овощных культур (перед закладкой на хранение и во время предпосевной обработки); опрыскивать вегетирующие растения в любую, даже солнечную или дождливую погоду; обрабатывать плоды и вегетативные растения; получать стабильный эффект от биопрепарата в сложных почвенно-климатических условиях; в условиях выращивания в закрытом и открытом грунте; совмещать биопрепараты с ХСЗР в одной баковой смеси.

Помимо своей технологичности, биофунгициды на основе бацилл обладают высокой эффективностью не только против грибных заболеваний, но и против болезней бактериальной этиологии (мокрые и мягкие гнили, бактериальная пятнистость и т.д.).

В качестве основы бациллярных биопрепаратов наибольшее распространение получили бактерии рода Bacillus, характеризующиеся высокой скоростью деления при культивировании в промышленных условиях, устойчивостью к неблагоприятным факторам среды и наличием широкого спектра хозяйственно ценных признаков. Среди прочего, бактерии рода Bacillus отличаются высокими супрессивными качествами по отношению к широкому набору фитопатогенов и способностью продуцировать множество вторичных метаболитов различной химической природы. Основная фракция фунгицидных антибиотиков В. subtilis - не рибосомально синтезируемые пептидные производные, в основном липопептиды. Клетки В. subtilis, наряду с пептидными антибиотиками, продуцируют поликетоны, которые служат активными агентами в биологическом контроле фитопатогенов. Кроме того, культура В. subtilis и В. amyloliquefaciens характеризуются высокой продуктивностью амилаз, протеаз, хитиназ, ксиланаз, липаз, глюконаз, целлюлаз и других литических ферментов. Бациллы прикрепляются к грибным гифам, лизируют клеточные стенки фитопатогенных грибов и используют продукты лизиса в качестве дополнительного источника питания и энергии. В настоящее время описаны фунгициды пептидной природы, продуцируемые бактериями рода Bacillus - итурины, сурфактины, фенгицины, бацилломицины [Akra Е., Jacques Р., Wathelet В., Paquot М., Fuchs R., Budzikiewicz Н., Thonart P. 2001., Influence of culture conditions on lipopeptide production by Bacillus subtilis. Appl. Biochem. Bioctechnol. 91-93: 551-561., Klich M.A., Lax A.R., Bland J.M. 1991. Inhibition of some mycotoxigenic fungi by iturin A, a peptidolipid produced by Bacillus subtilis. Mycopathology. 116:77-80., Ahimou F., Jacques P., Dejeu M. 2000. Surfactin and iturin A effect on Bacillus subtilis surface hydrophobility. Enzyme Microb. Technol. 27:749-754., Volpon L., Besson F., Lancelin J. 2000. NMR structure plipastatins A and В from Bacillus subtilis inhibitors of phospholipase A2. FEMS Lett. 485: 76-80., Volpon L., Besson F., Lancelin J. 1999. NMR structure of active and forms of the sterol-dependet antifungal antibiotic bacillomycin L. Eur. J. Biocem. 263:1-12.]. Механизм фунгицидного действия пептидов обусловлен либо лизисом клеток, либо подавлением синтеза компонентов клеточных стенок. Ряд штаммов В. cereus продуцируют антибиотик звиттермицин, оказывающий ингибирующий эффект на фитопатогенные грибы [Milner J.L., Raffel S.J., Lethbridge В.J., Handelsman J. 1995. Culture condition that influence accumulation of zwittermicin A by Bacillus cereus UW85. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:685-691.].

Биологические препараты на основе микроорганизмов, продуцирующих антагонистические факторы, также могут быть использованы для борьбы с фитопатогенными грибами, инфицирующими и семенной материал. Известен биологический препарат «Бактофит», созданный на основе штамма Bacillus subtilis ИПМ 215 [Патент RU 2019966]. Активное начало препарата «Бактофит», представляющее собой штамм В. subtilis ИПМ 215 и препарат на его основе, рассмотрен в качестве ближайшего аналога заявляемого объекта. Препарат рекомендован для защиты различных растений от фитопатогенных болезней (от мучнистой росы огурцов, вертициллезного вилта хлопчатника, корневых гнилей овощных и зерновых культур) [«Проблемы создания и применения микроорганических средств защиты растений», М., 1989, с.253, 257-295.]. Недостатком указанного штамма является его недостаточно высокая эффективность против фитопатогенных бактерий.

Зарегистрированы в 2022 в «Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ» [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных для применения на территории РФ», 3 октября 2022, С.874-908.] штамм В. subtilis В-10 ВИЗР [Патент RU 2081167] - продуцент препарата Алирин-Б и штамм В. subtilis М-22 ВИЗР [Патент RU 2084152] - продуцент препарата Г амаир для защиты сельскохозяйственных культур от грибных и бактериальных болезней. Но эти штаммы имеют более узкий спектр действия и недостаточную биологическую эффективность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Алирин-Б и Гамаир рекомендованы к применению только в период вегетации против корневых и прикорневых гнилей, ризоктониоза, фитофтороза и альтернариоза.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является расширение арсенала штаммов бактерий, обладающих фунгицидным и бактерицидным действием против ряда возбудителей фитопатогенных болезней овощных растений.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание биопрепарата для защиты овощных растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными микроскопическими грибами и бактериями.

Технический результат достигнут тем, что получен штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием против фитопатогенов и разработан биопрепарат для защиты овощных растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями, представляющий собой смесь культуральной жидкости штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 с титром 2-4×10⁹ КОЕ/мл и целевых добавок, иммобилизованную на мелкодисперсных гранулах диатомита, при этом соотношение по объему смесь: гранулы диатомита составляет 1:5.

Осуществление изобретения

Заявляемый штамм получен в результате многоступенчатой селекции из природного штамма Bacillus amyloliquefaciens, выделенного из почвы, и депонирован в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ).

Штаммы Bacillus amyloliquefaciens обладают рядом биотехнологических преимуществ: растут на относительно дешёвых питательных средах, не требуют специальных условий для культивирования, способны легко поддерживаться в лабораторных условиях в течение длительного времени, сохраняя свои уникальные антагонистические свойства.

Бациллы Bacillus amyloliquefaciens, наряду с другими почвенными бактериями, предлагают включать в состав многофункциональных комплексных бактериальных препаратов, для усиления бинарного действия и возможного расширения эффективности ряда химических гербицидов.

Обработка почвы бактериями Bacillus amyloliquefaciens улучшает развитие растений, снижает заболеваемость и повышает урожайность овощных культур до 30% по сравнению с не обработанной почвой. Предпосевная обработка почвы бактериями Bacillus amyloliquefaciens снижает количество аэробных бактерий кишечной группы, что обеспечивает фиксацию щелочной среды почвы. А также предпосевная обработка самих сельскохозяйственных целевых растений бактериями данного вида ингибирует развитие фитопатогенных микроскопических грибов и бактерий, что повышает урожайность растений.

Штамм-продуцент спорообразующих бацилл Bacillus amyloliquefaciens получен путём многоступенчатой селекции без применения мутагенов из штамма, выделенного из природных источников. На основе изученных культуральных, физиологических и биохимических свойств и проведённой генетической идентификации штамма по 16S рРНК, штамм отнесён к Bacillus amyloliquefaciens и депонирован в БРЦ ВКПМ под номером Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 [Pavlicek A., et al. Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia Folia Biol. (Praha). 1999. 45(3): 97-99 и Ruiz-Garcia C. et. al. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiol. 2005. - V. 55. - P. 191-195.].

Заявляемый биопрепарат имеет форму сухого порошка, которая обладает рядом преимуществ по сравнению с жидкими и эмульсионными формами: возможность сохранения биологической активности действующего начала в биопрепарате, а также удобство и простота при его транспортировке и применении.

В качестве ближайшего аналога заявляемого биопрепарата рассмотрен биопрепарат [Патент RU 2528058] на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11475, обладающий фунгицидными действием. Заявляемый биопрепарат отличается от ближайшего аналога широким спектром антагонистической активности, так как наряду с фунгицидной, обладает антибактериальной активностью.

Заявляемый биопрепарат получают на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788. Для этого спорообразующий штамм культивируют в следующих питательных средах:

- среда NBY, мас. %: nutrient broth "Difco" (питательный бульон) - 0,8; yeast extract "Difco" (дрожжевой экстракт) - 0,3; вода - остальное, рН 6,8-7,2

- среда YM, мас. %: гидролизные дрожжи - 4,5; вода - остальное, рН 6,8-7,2

- ферментационная среда, мас. %: гидролизные дрожжи 2,0; дрожжевой экстракт 1,5; меласса 2,0; мука кукурузная 1,5; мука соевая 1,5; сульфат магния 0,02; дигидрофосфат калия 0,02; карбонат кальция 0,1; остальное - вода; рН 7,0.

Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды дополнительно добавляют агар-агар (мас. % - 2,0).

Заявляемый штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-13788 имеет следующие характеристики:

1. Культурально-морфологические признаки штамма-продуцента.

При культивировании на агаризованной среде NBY через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует белые матовые морщинистые, фестончатые, с неровными краями, с плоским центром колонии диаметром 5-7 мм. Исследование морфологических особенностей штамма-продуцента с помощью светового микроскопа выявило у них признаки, характерные для данного вида бактерий. Подвижные вегетативные палочковидные клетки, перитрихи, размером 0,5-0,7 × 2,5-3,0 мкм, цепочек не образуют. Штамм хорошо спорулирует в жидкой и на твердой питательной среде NBY. Через 72-96 часа роста на питательной среде NBY штамм образует споры. Эндоспоры с центральным положением, термоустойчивые. В клетке образуется не более одной споры. Эндоспоры расположены центрально и не выходят из размеров спорангия. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,5-0,6×0,9-2,5 мкм. Клеточная стенка толстая грамположительного типа (метод анализа и окраска по Граму: окраска генциановым красителем и йодистым раствором). Капсулы не образует. Штамм Вас. amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 гидролизует желатин и крахмал, утилизирует цитрат, редуцирует нитрат, образует каталазу, разрушает казеин, образует кислоту из глюкозы, манитола и арабинозы, лецитиназу не продуцирует, обладает протеазной и амилазной активностью и не обладает липазной.

2. Свойства носителя для иммобилизации активных факторов.

В качестве носителя для иммобилизации активного начала - культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 использован диатомит [ТУ 9692-0003-59266087-05 "Материалы сорбционные и фильтрующие".].

Диатомит - рыхлая, светлая, осадочная порода, которая состоит из кремнистых скелетных останков диатомовых водорослей. Это экологически чистая природная, многофункциональная, наноструктурированная, пористая структура с мелким размером частиц и низким удельным весом. В составе диатомита содержится до 85% окиси кремния и около половины ее - в аморфной форме. Высококремнистая порода обладает рядом свойств, важных с технологической точки зрения. Эта порода - природный эффективный сорбент со специфическим характером пористости, обладающий высокой адсорбционной и ионообменной емкостью (0,8-0,12 г•экв/кг), что позволяет использовать ее в качестве носителя для иммобилизации активного начала биопрепарата - культуральной жидкости бактерий. Диатомит может поглощать и удерживать количество жидкости, эквивалентное его собственному весу, что позволяет удерживать в пахотном корнеобитаемом слое почвы также влагу, элементы питания и внесенную биологически активную культуральную жидкость, которые затем постепенно высвобождаются и используются растениями в процессе жизнедеятельности и защищают их от неблагоприятных факторов. Диатомит, содержит в своем составе до 1,5-2,0% калия и серы, а также ряд других микроэлементов. Установлено, что кремний играет защитную роль при любых стрессовых для растений ситуациях, будь то насекомые-вредители, заболевания, вызванные фитопатогенными грибами, воздействие низких температур или химические загрязнения и т.д. Такая универсальность заключена в способности активных кремниевых соединений участвовать в быстром и направленном синтезе специфических органических молекул внутри растительной клетки, которые помогают растению преодолеть все отрицательные воздействия. Вышеуказанные особенности диатомитов - природных сорбентов, делают возможным их использование в современных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур не только в качестве многофункционального удобрения, но и открывают большие перспективы для создания новых видов фунгицидных биопрепаратов для защиты овощных растений, в силу того, что диатомиты обладают наиболее рациональным режимом защиты и взаимодействия с растениями. Свойства диатомита, которые делают его использование технологичным, в качестве носителя для иммобилизации активного начала - культуральной жидкости бактерий штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788, следующие: малый размер частиц, обуславливающий большую площадь адсорбции на их поверхности; высокая пористость, относительно инертная кремнистая композиция; низкий удельный вес.

3. Состав и преимущества биологического препарата.

Заявляемый биопрепарат включает культуральную жидкость штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788, состоящую из комплекса спор, вегетативных клеток (с титром КОЕ/мл ~2-4×10⁹ КОЕ/мл), продуктов их метаболизма, целевых добавок, а также гранул диатомита, на которых этот комплекс иммобилизован, придающих биопрепарату при приготовлении из него рабочих суспензий, необходимые потребительские свойства, как-то: эмульсионную структуру, прилипаемость, стабильность, защиту от потери жизнеспособности спор и биологическую эффективность при высушивании, при следующем соотношении целевых компонентов мас. %:

Культуральная жидкость штамма BL

ВКПМ В-13788 (2-4×10⁹ КОЕ/мл)	70-68
Диатомит	28-30
Бензоат натрия	0,2-0,3
Твин-80	1-2
Глицерин	остальное

В качестве целевых добавок используют:

Бензоат натрия - безвредное вещество, вводят в препарат в качестве стабилизатора и консерванта, препятствующее деструкции биологических компонентов и способствует сохранению всех антагонистических свойств культуральной жидкости. Используется даже в пищевой промышленности.

Твин-80 вводят небольшое количество в препарат как ПАВ (поверхностно активное вещество). Применяют его для повышения диспергируемости и смачиваемости, для снижения поверхностного натяжения воды с целью создания такой препаративной формы биопрепарата, которая при смешивании с водой дает стабильную суспензию.

Глицерин - спирт многоатомного ряда, введенный в препарат как стабилизатор, для торможения деструкции, не способствует возрастанию количества бактерий, но действует как стабилизатор их титра.

К приготовленной жидкой смеси добавляют диатомит, тщательно перемешивают и высушивают при температуре 60°С в течение 24 часов.

Биопрепарат получают в форме сухого однородного смачивающегося порошка, стабильного при хранении не менее 12 месяцев. Хранят в герметичной упаковке при комнатной температуре.

4. Фунгицидные свойства штамма.

Штамм характеризуется широким спектром фунгицидной активности и подавляет развитие следующих фитопатогенных грибов: Alternaria tenuis, Aspergillus niger, Ascoshita cucumis, Fusarium graminearum, Microdochium nivale (Fusarium nivale), Fusarium solani, Fusarium culmorum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium avenaceum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Phoma solanicola, Phomopsis helianthi, Botrytis cinerea, Magnaporthe grisea, Phytophtora infestans.

5. Антагонистическая активность штамма.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 синтезирует биологически активные вещества и проявляет антагонистическую активность по отношению к: грамположительным бактериям: Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis (ssp. galleriae, ssp. tenebrionis, ssp. israelensis), Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Staphylococcus ssp., Streptococcus ssp.; грамотрицательным бактериям: Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas marginata, Erwinia cnrysanthemi, Xanthomonas campestris.

Заявляемый штамм Bacillus amyloliquefaciens В-13788 подавляет развитие фитопатогенных грибов-возбудителей болезней овощных культур: фомоза (Phoma solanicola), альтернариоза (Alternaria tenuis), аскохитоза (Ascoshita cucumis) и фузариозов (Fusarium), фитофтороза (Phytophtora infestans) и др.

В качестве преимущества заявляемого штамма Bacillus amyloliquefaciens В-13788 по сравнению с ближайшим аналогом-штаммом В. subtilis ИПМ 215 следует отметить его способность продуцировать поверхностно-активные вещества (ПАВ) в процессе культивирования, что является важной характеристикой заявляемого штамма, так как в дальнейшем при создании препаративной формы нет необходимости вводить дополнительные ПАВы. В сельском хозяйстве при защите растений ПАВы широко используют для образования эмульсий и в качестве прилипателей. ПАВы используют для повышения эффективности транспортировки фунгицидных компонентов к растениям, так как они влияют на проницаемость клеточных мембран, кроме того, ПАВы обладают ингибирующим действием на ферментативные системы фитопатогенных грибов.

Поддержание штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 проводят на косяках в стандартных пробирках с агаризованной средой NBY. Хранение штамма осуществляют в также в лиофилизированном состоянии. Для получения лиофилизированного материала вегетативную культуру клеток выращивают на агаризованной среде NBY до образования спор. Биомассу, содержащую споры, смывают защитной средой со стерилизованным обезжиренным молоком. Ампулы с суспензией клеток и спор выдерживают 15 мин при температуре -70°С, а затем быстро переносят в камеру для сушки, соединенную с вакуумной системой лиофилизации (модель 75150 фирмы "Labkonko"). Время сушки 4 часа. Лиофилизированные образцы штамма хранят в холодильнике при температуре +4°С.

Изобретение иллюстрировано следующими примерами:

Пример 1.

Приготовление заявляемого биопрепарата

Заявляемый биологический препарат получают следующим образом: штамм-продуцент Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 высевают на твердую среду NBY и помещают в термостат при температуре 30°С, культивируют в течение 2 дней. Полученную вегетативную культуру штамма, затем инокулируют в жидкую среду NBY, используя стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см³, которые заполняют 50 мл жидкой стерильной среды. Выращивают штамм-продуцент для получения посевной культуры при 30°С на качалке при 250 об/мин в течение 16 часов. Полученную посевную культуру затем вносят в ферментационную среду, содержащую мас. %: гидролизные дрожжи 2,0; дрожжевой экстракт 1,5; мелассы 2,0; мука кукурузная 1,5; мука соевая 1,5; сульфат магния 0,02; дигидрофосфат калия 0,02; карбоната кальция 0,1; остальное - вода; рН 7,0. Глубинное культивирование осуществляют при +30°С, рН 7,0 и перемешивании, постепенно меняя скорость вращения мешалки от 200 об/мин до 350 об/мин в ферментере, при заполнении его ферментационной средой на 1/3 объема, в течение 72 часов. Контроль за процессом роста культуры, стерильностью и рН среды осуществляют путем отбора проб через каждые 24 часа от начала культивирования, определяя титр колониеобразующих единиц путем высева проб на агаризованную среду NBY с последующим подсчетом КОЕ. Отсутствие посторонней микрофлоры контролируют микроскопически. К 72 часам культивирования штамм-продуцент образует до 95% спор. Продуктивность штамма-продуцента, которая составляет ~2-4×10⁹ КОЕ/мл, определяют методом серийных разведений с последующим высевом на агаризованную среду.

Биопрепарат получают путем смешивания культуральной жидкости заявляемого штамма-продуцента ВКПМ В-13788, целевых добавок. Полученную смесь иммобилизуют на гранулах диатомита, с последующим высушиванием при температуре +60°С в течение 24 часов. Качество биопрепарата оценивают по титру колониеобразующих единиц методом серийных разведений. Титр биопрепарата составляет до 2,8-3,0×10¹⁰ КОЕ/мл.

Пример 2.

Оценка фунгицидной активности заявляемого штамма в лабораторных условиях

Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 выращивают, как в примере 1. Для анализа фунгицидной активности используют культуральную жидкость, содержащую 2-4×10⁹ КОЕ/мл. Определение антагонистической активности 3-суточной культуральной жидкости, полученной при глубинном выращивании штамма, проводили стандартным микробиологическим методом лунок []Для этого штаммы фитопатогенных грибов (табл. 1) высевают на чашки Петри с агаризованной картофельно-сахарозной средой. Картофельно-сахарозную среду получают, добавляя к процеженному отвару картофеля сахарозу и агар-агар. Картофельно-сахарозная среда, мас. %: сахароза 2,0; агар-агар 2,0; картофельный отвар остальное; рН 6,8-7,2.

В агаризованной среде с помощью бура вырезают лунки диаметром 8 мм, в которые вносят по 150 мкл культуральной жидкости заявляемого штамма. Диаметр зоны задержки роста измеряли через 3-5 суток в зависимости от скорости роста тест-гриба. Эффективность фунгицидного действия заявляемого штамма определяют по диаметру зоны отсутствия роста тест-культур фитопатогенных грибов. Результаты представлены в таблице 1.

Как следует из таблицы 1, заявляемый штамм обладает широким спектром действия в отношении возбудителей грибных заболеваний и высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов, которая локализована в культуральной жидкости.

Пример 3.

Оценка бактерицидной активности заявляемого штамма

Оценку бактерицидной активности заявляемого штамма в лабораторных условиях проводят следующим образом. Штамм выращивают как в примере 1. Для анализа бактерицидной активности используют культуральную жидкость, содержащую 2-4×10⁹ КОЕ/мл. Тестирование бактерицидной активности проводят методом лунок. Для этого бактериальные тест-культуры (табл. 2) высевают на чашки Петри с агаризованной средой NBY, затем в лунки диаметром 5 мм вносят по 50 мкл культуральной жидкости и инкубируют при 30°С в течение 24-48 часов. Эффективность бактерицидного действия заявляемого штамма определяют по диаметру зоны отсутствия роста тест-культур.

Результаты представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, заявляемый штамм обладает широким спектром бактерицидной активности, которая локализована в культуральной жидкости.

Пример 4.

Определение поверхностно-активных свойств заявляемого штамма

Поверхностно-активные свойства штамма (способность образовывать ПАВ) оценивают по следующим критериям - пенообразующую активность, способность к эмульгированию и поверхностное натяжение. Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 выращивают на осветленной среде YM на круговой качалке (260 об/мин) при 30°С в течение 120 часов.

Пенообразование определяют после снятия с качалки как отношение объема пены к объему культуральной жидкости, выраженное %.

Для определения эмульгирующей активности (Е24) надосадок, полученный после отделения биомассы путем центрифугирования культуральной жидкости штамма при 10 000 об/мин., смешивают с керосином в отношении 2:3, встряхивают при 300 об/мин на шейкере в течение 3 мин и оставляют при комнатной температуре на 24 часа.

Эмульгирующую активность (индекс эмульгирования) оценивают как отношение образовавшейся эмульсии к объему культуральной жидкости в %.

Поверхностное натяжение измеряют сталагмометрическим методом [Остроумов С.А., Лазарева Е.В. Поверхностное натяжениеводных растворов додецилсульфата натрия в присутствии водных растений. Вода: технология и экология. 2008 №3 с. 57-60] в объеме 5 мл при 20°С.

Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что заявляемый штамм способен продуцировать поверхностно-активные вещества (ПАВ), что позволяет при приготовлении на его основе биопрепарата не добавлять дополнительных прилипателей, или существенно снизить количество ПАВ, необходимых для иммобилизации активного начала на гранулах носителя.

Пример 5.

Оценка фунгицидной активности заявляемого биопрепарата

Для выявления фунгицидной активности биопрепарата используют метод лунок. Готовят исходную 1% рабочую суспензию, из которой делают кратные разведения (0,1% и 0,01%). Тестируемые фитопатогенные грибы высевают в центр чашки Петри на агаризованную картофельно-сахарозную среду (мас. %: агар-агар - 2,0; сахароза - 2,0; картофельный отвар - остальное, рН - при 25°С - 7,2). В лунки, вырезанные в среде, диаметром 10 мм вносят по 150 мкл кратных разведений. Экспериментальные чашки Петри инкубируют в темноте при комнатной температуре. Через 48 часов оценивают наличие или отсутствие зон подавления роста микроскопических тест-грибов.

Эффективность фунгицидного действия препарата определяют по диаметру зоны отсутствия роста фитопатогенных грибов (таблица 4).

Как следует из таблицы 4, заявляемый препарат подавляет рост мицелия всех исследованных фитопатогенных тест-грибов, обладает широким спектром действия и высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов.

Пример 6.

Оценка антибактериальной активности заявляемого биопрепарата Антибактериальное действие заявляемого препарата выявляют на грамположительных и грамотрицательных тест-бактериях. Тест-микроорганизмы культивируют при +37°С с аэрацией при 250 оборотов/мин в течение 24 часов в бульоне Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton Broth, "HIMEDIA", India), мас. %: кислотный гидролизат казеина - 3,0; вытяжка из говядины - 0,175; растворимый крахмал - 0,015; вода - остальное, рН - (при 25°С) - 7,4±0,2. Тестирование антибактериальной активности проводят методом лунок на плотной агаризованной среде. Для этого бактериальные тест-культуры с оптической плотностью 0,5 высевают на чашки Петри с 20 мл агаризованной среды Мюллера-Хинтона. Чашки Петри оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего в агаре вырезают лунки диаметром 4 мм, в которые вносят по 25 мкл образца каждого разведения заявляемого биопрепарата, приготовленные как в примере 5. Антибактериальное действие разведений препарата оценивают по наличию зоны задержки роста тест-бактерий через 24 часа и измерению величины этих зон (таблица 5).

Как следует из таблицы 5, заявляемый биопрепарат проявляет антибактериальную активность против грамположительных бактерий Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Staphylococcus ssp., Streptococcus ssp. и грамотрицательных бактерий Acinetobacterium calcoaceticus, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas corrugata, Pseudomonas marginata, Erwinia chrysanthemi, Xanthomonas campestris, Escherichia coli; но не активен против грамположительных бактерий Bacillus sphaericus и грамотрициательных бактерий: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumniae.

Пример 7.

Оценка фунгицидной активности биопрепарата при искусственном инфицировании семян огурцов фитопатогенными грибами Fusarium oxysporum, Alternaria alternata. Botrytis cinerea

В модельных опытах на семенах овощных культур селекционно-семеноводческой фирмы «Гавриш» используют семена огурцов сорта «Парижский корнишон». Изучение биологической эффективности в модельных опытах осуществляют в соответствии со стандартными методиками [«Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур» М., 1965 и «Методические указания по регистрационным испытаниям фунгицидов в сельском хозяйстве», Санкт-Петербург, 2009.].

Предварительно обеззараживают 0,1% раствором AgNO₃ все опытные семена огурцов, качают в течение 1,5 часов на шейкере BIOSAN (Environmental Shaker-Incubator ES-20 USA) при 180 об/мин и температуре 25°С. Затем семена подсушивают на воздухе 2 часа до сыпучести. В качестве контроля используют замачивание семян в дистиллированной воде. Тест-грибы культивируют на чашках Петри с 2% картофельным агаром (КСА) в течение 3-х суток. Для приготовления грибной суспензии вырезают агаровые блоки с грибами размером 1×1 см и помещали их в колбу Эрленмейера со 100 мл стерильной дистиллированной воды. Колбу помещают на качалку 260 об/мин на ночь. Полученную грибную суспензию с фитопатогенами Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea микроскопируют в световом микроскопе на наличие конидий и отсутствие посторонней микрофлоры, далее используют для искусственного инфицирования семян.

Опытные семена огурцов, предварительно обеззараженные обработкой 0,1%-ным раствором AgNO₃, замачивают в 0,1% суспензии биопрепарата в течение двух часов. Затем семена подсушивают на воздухе в течение 1 часа и заражают споровой суспензией (10⁵-0⁶ спор/мл) смеси фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea в течение 1 часа. Суспензию грибов и воду сливают, а семена подсушивают и переносят в чашки Петри со стерильной агаризованной средой КСА, раскладывают и оставляют до прорастания при комнатной температуре в темноте. В каждую чашку помещают по 10 семян; повторность - 5 кратная. Используют метод проращивания обработанных и необработанных семян на агаризованной среде КСА на чашках Петри. Чашки с семенами выдерживают при температуре 25-27°С в течение 10 суток. Оценивают всхожесть, начало прорастания и зараженность семян грибами (табл. 4). Изучают влияние на стимулирование или ингибирование прорастания семян огурцов по методу мокрого протравливания.

Как следует из таблицы 6, обработка семян огурцов сорта «Парижский корнишон» биопрепаратом на основе заявляемого штамма ВКПМ В-13788, в условиях влажной камеры демонстрирует высокую антагонистическую активность и приводит к увеличению всхожести семян, уменьшению их зараженности фитопатогенными грибами, уменьшая время начала прорастания.

Таким образом, штамм штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 и биопрепарат на его основе демонстрируют высокую биологическую эффективность фунгицидных и антибактериальных факторов.

Claims

1. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием против фитопатогенов.

2. Биопрепарат для защиты овощных растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями, представляющий собой смесь культуральной жидкости штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-13788 по п. 1 с титром 2-4×10⁹ КОЕ/мл и целевых добавок, иммобилизованную на мелкодисперсных гранулах диатомита, при этом соотношение по объему смесь: гранулы диатомита составляет 1:5.