CN107075459B - 芽孢杆菌属的新型细菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本工作涉及属于表现出抗菌和/或抗真菌和促进植物生长活性的芽孢杆菌属的新型细菌。本工作涉及其分离和鉴定显示抗菌和/或抗真菌，植物生长促进，蛋白水解，淀粉分解活性的新型细菌提取物的方法。特别地，提供了一种具有登录号MTCC‑5674的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis的新型细菌。通过新型细菌和在培养基中大量生产抗菌和/或抗真菌和植物生长促进剂。提供了包含新型细菌或新型细菌的提取物的组合物，其在农业上和药学上有效。本工作的新型细菌用于治疗各种致病真菌和/或细菌并促进植物生长。
Description
本申请涉及表现出抗菌和/或抗真菌以及促进植物生长的活性、被命名为枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(Bacillus subtilis ssp.shriramensis)的属于芽孢杆菌家族的新型细菌，还涉及表现出抗菌和/或抗真菌、蛋白水解、淀粉分解的活性的所述新型微生物的提取物的分离和鉴定，还涉及包含所述新型细菌和/或所述提取物的组合物，和通过使病原微生物和/或真菌与有效量的所述新型细菌和/或抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的组合物和/或试剂接触来抑制病原微生物和/或真菌生长的方法及其用途。
背景技术
虽然高光强度，极端的温度变化，低浓度的有机物质和稀缺的水，使环境不适合微生物生长，但是地球的大气与空气中的微生物相关联是众所周知的。在偏远的大陆，人口稠密的大陆和偏远海洋环境中，生物材料可分别贡献大约20％，22％和10％体积的总大气悬浮颗粒物。它们大多数来自天然来源，如土壤，湖泊，动物和人类。此外，农业生产，医疗单位和工业经营如污水处理，动物饲养，发酵过程和食品加工厂也向环境中排放活微生物。
细菌形成单细胞的原核微生物的大领域。细菌通常长度为几微米，具有许多不同的形状，范围从球菌到杆状和螺旋状。细菌在地球上普遍存在，在土壤中，酸性温泉，放射性废物，水和地壳深处，以及在有机物和植物和动物的活体中生长。杆菌是杆状、革兰氏阳性、孢子生殖、需氧或兼性厌氧细菌。大多数杆菌是腐生菌。每个细菌仅产生一个孢子，其耐热，耐冷，耐辐射，耐干燥和耐消毒剂。杆菌表现出一系列的生理能力允许他们生活在广泛的栖息地，包括许多极端的栖息地，如沙漠，温泉和北极土壤。芽孢杆菌属可以是嗜热的，嗜冷的，嗜酸的，嗜碱的，耐盐的或嗜盐的，并且能够在各种pH值、温度和盐浓度下生长。
产生抗菌剂对大多数细菌似乎是普遍现象。这些细菌产生极好的一系列的微生物防御系统，包括广谱经典抗生素，代谢副产物如有机酸和溶解剂如溶菌酶。此外，还产生几种类型的蛋白质外毒素和细菌素，它们是具有杀菌作用模式的生物活性肽部分。来自微生物的生物库在其多样性和天然丰度方面是显著的。
寻找新的抗菌剂是极为重要的领域。对抗菌剂的抗性的发展以惊人的速度增加。目前的解决方案涉及开发更合理的抗生素使用方法和发现新的抗菌剂的方法。
高度相关的专利
1.控制真菌病原体的新型细菌菌株和方法(WO/2000/015761)。
发明目的
本发明的目的是提供表现出抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的活性的新型细菌。
本发明的目的是分离和鉴定新型细菌的提取物，其中所述提取物显示出抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的活性。
本发明的目的还在于提供抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的组合物或试剂，其中所述组合物或试剂包含新型细菌和/或新型细菌的提取物。
本发明的另一个目的是提供一种通过使病原微生物和/或真菌与有效量的新型细菌和/或抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的组合物和/或试剂接触来抑制病原微生物和/或真菌的生长的方法，其中所述组合物或试剂包含新型细菌和/或新型细菌的提取物和/或新型细菌及其提取物的混合物。
本发明的另一目的是提供新型细菌以及抗菌和/或抗真菌的组合物或试剂用于抑制病原微生物和/或真菌的生长的用途，其中所述组合物或试剂包含新型细菌和/或新型细菌的提取物和/或该新型细菌及其提取物的混合物。
发明内容
本发明的一个方面是提供可用于产生抗菌和/或抗真菌代谢物或试剂的分离的新型细菌。
本发明的一个方面是提供属于芽孢杆菌属的新形式的细菌，其被命名为枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(Bacillus subtilis ssp.shriramensis)并具有登录号(MTCC-5674)。特别地，本发明中公开的新型细菌能够表现出明显的抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的性质。
本发明的另一方面是提供抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的组合物或试剂的生产工艺，其中所述组合物或试剂包含枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)和/或枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物。
提供了包含枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的组合物。所述组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂，稀释剂和/或载体。
提供了含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物的组合物。还提供了包含枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的水性提取物的组合物。所述组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂，稀释剂和/或载体。
提供了通过使病原微生物和/或真菌与有效量的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)或枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物接触来抑制病原微生物和/或真菌生长的方法。枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)和/或枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物可任选地含有一种或多种另外的抗菌和/或抗真菌剂和植物生长促进剂。
在本发明中提供了枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)和/或枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物在用于抑制病原微生物和/或真菌生长的抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的组合物或试剂的制剂中的用途。
详细说明
本发明提供属于枯草杆菌家族的被命名为枯草芽孢杆菌亚种shriramensis和具有登录号(MTCC-5674)的新型细菌，以及抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的组合物或试剂的生产方法，其中所述组合物或试剂包含枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)和/或枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物。
本发明还提供了通过使微生物和/或真菌与有效量的新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)和/或包含新型细菌或其提取物的组合物接触来抑制病原微生物和/或真菌的方法。
本发明还提供了枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)，和/或包含新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)和/或枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物的抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的组合物或试剂在用于抑制病原微生物和/或真菌中的用途。
通过在有利条件下在合适的生长培养基中培养枯草芽孢杆菌亚种shriramensis可将新型枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)用于大规模生产抗菌和/或抗真菌和促进植物生长的组合物/制剂/试剂。
通过深入细致的研究，本发明人惊奇地发现了分离的和培养的可以产生新型试剂的新型细菌。通过详细的实验研究，本发明人还发明了由所述新型微生物生产所述新型试剂的方法。
附图说明
图1-示出了枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的分离和纯化的平板。(A)示出与真菌菌丝体一起的细菌生长的母培养板；(B)示出了来自(A)中细菌菌落的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的纯化。箭头表示推定的细菌菌落。
图2-对尖孢镰刀菌菌丝体生长示出抑制的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的纯化菌落之一的克隆。
图3-枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)以及孢子的营养细菌细胞的显微照片。
图4-示出了生长活跃的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)菌落的平板。
图5–光学显微镜下的杆状枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)。
图6-示出了过氧化氢酶试验结果的图：(A)阴性对照；(B)阳性对照和(C)示出过氧化氢酶活性阳性结果的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)。
图7-示出了枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液的淀粉分解活性的平板。
图8-是示出O/F(好氧发酵)试验结果的图，(A)阴性对照(B)示出仅在培养基的顶部显示颜色变化的枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)；(C)阳性对照。
图9是示出硫化氢生产试验结果的图，(A)阴性对照(B)枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)和(C)阳性对照。
图10是示出枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的浓缩培养物滤液的SDS-PAGE结果的图。
图11–示出抗菌和/或抗真菌活性的培养板，(A)枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)菌落展示的活性和(B)枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液展示的活性。尖孢镰刀菌培养物用作试验真菌。
图12是示出通过管稀释法进行的抗菌和/或抗真菌化合物的MIC测定结果的图。1至C-2：在含有不同浓度的抗菌和/或抗真菌剂的PDB中孵育后，尖孢镰刀菌孢子的照片(在光学显微镜下观察)。1-28(稀释度1：1至1：100)，C-1-抗菌和/或抗真菌试剂(粗品)中的孢子；C-2-对照(无抗菌剂和/或抗真菌剂的PDB液体培养基中的孢子)。
图13–示出通过琼脂扩散法进行的抗菌和/或抗真菌剂的MIC测定结果的图。1至C-2：生长在检测板上的尖孢镰刀菌菌丝体的照片。1-28以1:1至1:100(v/v)稀释的抗菌和/或抗真菌剂，C1-含抗菌和/或抗真菌剂(粗品)的孔。C2-含有PDB的对照孔；C3-含有70％饱和硫酸铵的对照孔。
图14-示出抗菌和/或抗真菌剂对黑曲霉孢子的作用的图。(A，B和C)黑曲霉的孢子在PDB培养基中显示正常的萌发；(D)黑曲霉孢子在含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)提取物的PDB培养基中不能萌发。
图15-示出了细胞裂解物对尖孢镰刀菌的抗菌和/或抗真菌活性的平板；(1)仅含有溶菌酶的孔(以检查溶菌酶对真菌尖孢镰刀菌的效应)和(2)含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的细胞裂解物的孔。
图16-是示出针对多种类型的植物病原真菌和细菌种的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞/提取物的抗菌和/或抗真菌活性检测的平板。A.尖孢镰刀菌，B.鞘腐败病菌C.木霉菌D.炭疽菌属E.玉米大斑病菌F.水稻纹枯病G.球壳孢菌H.水稻黄单胞菌。
图17-是示出枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)提取物在尖孢镰刀菌存在下对水稻种子发芽的抗菌和/或抗真菌活性的结果的平板。(A)用真菌尖孢镰刀菌孢子处理的水稻种子；(B&C)用真菌尖孢镰刀菌和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)提取物处理的水稻种子。
图18-是示出枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)对各种植物物种不具有致病性的实验结果的平板。(A)水稻，(B)棉花，(C)烟草，(D)玉米和(E)番茄。
图19-是示出枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)作为生物防治剂的作用的实验结果的图。(A)感染了立枯丝核菌(NFCCI-3194)真菌的番茄植物。(B)感染了立枯丝核菌(NFCCI-3194)和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的番茄植物和(C)对照番茄植物(未感染立枯丝核菌和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)。
图20-是示出(1)草酸青霉菌(NFCCI-1997)真菌菌落和(2)枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)纯菌落的平板。
图21-是示出用抗菌/抗真菌剂枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的多种制剂包被的玉米种子的平板。1.(对照-1)用不含真菌病原体和生物防治剂的制剂处理的种子；2.(对照-2)用不含生物防治剂的制剂处理的种子；3.(对照-3)用含有商业杀真菌剂“多菌灵WP50”的制剂处理的种子；4a.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5×104cfu)的制剂处理的种子；4b.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5×105cfu)的制剂处理的种子；4c.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5×106cfu)的制剂处理的种子；4d.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5×107cfu)的制剂处理的种子，和5.用仅含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5×107cfu)的制剂处理的种子。
图22-是示出孵育2周后生物防治活性的结果的平板。1.(对照-1)用不含有真菌病原体和抗真菌剂的制剂-1处理的种子；2.(对照-2)用不含生物防治剂的制剂-2处理的种子；3.(对照-3)用含有商业杀真菌剂“多菌灵WP50”的制剂-3处理的种子；4a.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(5x104cfu)的制剂-4a处理的种子；4b.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5x105cfu)的制剂-4b处理的种子；4c.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5x106cfu)的制剂-4c处理的种子；4d.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5x107cfu)的制剂-4d处理的种子和5.用仅含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5x107cfu)的制剂-5处理的种子。
图23-是示出孵育4周后生物防治活性的结果的平板。1.(对照-1)用不含有真菌病原体和抗真菌剂的制剂-1处理的种子；2.(对照-2)用不含生物防治剂的制剂-2处理的种子；3.(对照-3)用含有商业杀真菌剂“多菌灵WP50”的制剂-3处理的种子；4a.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(5x104cfu)的制剂-4a处理的种子；4b.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5x105cfu)的制剂-4b处理的种子；4c.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5x106cfu)的制剂-4c处理的种子；4d.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5x107cfu)的制剂-4d处理的种子和5.用仅含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞(5x107cfu)的制剂-5处理的种子。
图24-针对多种人类病原性真菌物种的抗真菌和/或抗菌活性的测定。A，B和C-针对青霉菌的抗真菌和/或抗菌活性的测定，(A)青霉菌真菌菌落(B)菌丝体和(C)枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液的影响。D，E和F-针对黄曲霉的抗真菌和/或抗菌活性的测定，(D)真菌菌落(E)菌丝体和(F)枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液的影响。G，H和I-针对黑曲霉的抗真菌和/或抗菌活性的测定，(G)真菌菌落(H)菌丝体和(I)枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液的影响。J，K和L-针对引起皮肤感染的未知真菌的抗真菌和/或抗菌活性的测定，(J)真菌菌落(K)分生孢子和(L)枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液的影响。
图25-枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)制剂对玉米生长和发育的影响。用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的制剂处理的玉米种子显示出较高的生长速率，生物量和谷物产量。
新型细菌的分离和鉴定
本发明人在进行关于空气菌群研究时从海得拉巴和帕坦切鲁(泰伦加纳，印度)的18个不同位置收集空气样品。在实验室中制备含有培养基(T3培养基，Travers等人，1987)的一次性培养皿，并将其暴露于不同位置的空气。将暴露的板密封并在30℃在实验室温育器中孵育。在暴露于帕坦切鲁地区空气的平板之一中，观察到由真菌菌丝体包围的细菌菌落(图1A)。尽管继续孵育，间隙区仍保持，并且真菌菌丝体的生长保持局限于间隙区的周边。使用标准微生物学方法对来自该菌落的微生物进行纯化(图1B)。针对普通真菌尖孢镰刀菌检测个体菌落(图2)。
其中一个菌落显示抑制真菌生长，观察到间隙区(图2)。来自菌落的细菌的显微镜检查显示出杆状运动细菌(图5)。在培养基中培养6天后，细菌产生孢子。细菌的菌落是粘液状的，凸起的，圆形的，光滑的，并且奶油色至灰白色(图4)，细胞示出可变的革兰氏染色(图5)。
进行一系列生化检测，包括糖类发酵，过氧化氢酶活性，氧化发酵检测，淀粉水解，硫化氢生产检测，氧化酶活性检测，脱氧胆酸盐琼脂检测。这些试验的结果证实，细菌是过氧化氢酶阳性，具有淀粉酶活性，强好氧，不产生硫化氢，氧化酶阳性和革兰氏染色不定的。
为了鉴定细菌，进行16S DNA测序和FAME分析。两个研究的结果表明，细菌与枯草芽孢杆菌亚种subtilis在16S DNA序列上的差异为0.37％，FAME相似指数为0.827；且与萎缩芽孢杆菌在16S DNA序列上的差异为0.84％，FAME相似性指数0.749。因此，结果表明该细菌与枯草芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌相关，但不与ATCC集合中的任何编目的细菌种类相同。
16S DNA序列比较结果
FAME分析结果比较
| 序列号 | 相似指数 | 库条目名称 |
| 1 | 0.827 | 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) |
| 2 | 0.749 | 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) |
分离的细菌是芽孢杆菌属的亚种的新成员。根据细菌命名惯例，新型细菌种被命名为枯草芽孢杆菌亚种shriramensis。细菌储存在印度昌迪加尔的IMTECH的微生物典型培养物保藏中心(MTCC)中。这种新品种的储存号是(MTCC-5674)。
具有本发明提供的登录/储存编号(MTCC-5674)的新型细菌的特征
该细菌是杆状的，测量为2.45×0.88μm，活动，形成孢子，革兰氏染色不定；菌落光滑，粘液状，在早期阶段是灰白色至奶油状，但在延长了时间的孵育中起皱。当培养基中的营养物耗尽时，细菌转化成孢子，通常孢子形成过程发生在4天的孵育中，所述孵育是在30℃和200rpm振荡下、在25×150mm培养管中的含有100μl 5×108细胞接种物的10ml培养基中进行的。
具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌，表现出抗菌和/或抗真菌活性。具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物，表现出抗菌和/或抗真菌活性。细菌的潜在应用和用途的范围是广泛的。
本发明提供了从具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌产生抗菌和/或抗真菌提取物的方法。
抗菌和/或抗真菌剂的生产和分离
用于具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis生长的培养基的
组成如下：
1.胰蛋白胨:0.32％(w/v)
2.胰蛋白示:0.24％(w/v)
3.酵母提取物:0.18％(w/v)
4.NaH2PO4.H2O:0.044M
5.Na2HPO4:0.062M
6.MnCl2:0.000 5％(w/v)
pH＝6.8
1.按照附录I(I)中给出的方法制备培养基，将100ml等分试样转移到500ml锥形瓶中。将培养基通过在121℃高压灭菌15分钟灭菌。
2.每个烧瓶用单一纯菌落的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)接种，并在30℃，200rpm孵育60小时。
从培养基中分离抗菌和/或抗真菌剂
细菌在T3液体培养基中生长60小时后，将培养物在4℃以12000rpm离心10分钟。收集上清液并使用0.22μm圆盘过滤器(Millipore/Sartorius)过滤。将滤液在适当的储存条件下保存用于详细实验以研究抗菌和/或抗真菌活性。
本发明特别提供了一种具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型微生物，以及由该新型细菌和/或其提取物或该新型细菌和/或其提取物的混合物生产抗菌和/或抗真菌组合物的方法。
本发明的一个实施例提供了具有登录号(MTCC-5674)的、表现出抗菌和/或抗真菌活性的、属于枯草芽孢杆菌亚种shriramensis的分离的新型细菌。
在本发明的一个实施例中，提供了具有登录号(MTCC-5674)的、被命名为枯草芽孢杆菌亚种shriramensis的新型细菌。
在本发明的另一个实施例中，提供了具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的纯培养物。
在本发明的一个实施例中，提供了具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物，其中所述提取物表现出抗菌和/或抗真菌活性。
在本发明的另一个实施例中，提供了具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物，其中所述表现出抗菌和/或抗真菌活性的提取物是水性提取物。在本发明的另一个实施例中，提供了一种具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物的生产方法，其中在该过程中包括使得具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌在营养培养基中生长，并通过使用常规方法回收具有抗真菌活性的提取物。
在本发明的另一个实施例中，提供了具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物的生产工艺，其中所述工艺包括使所述具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌在有氧条件下生长。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物的生产工艺，其中所述工艺包括使所述枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌在营养培养基中生长，回收具有抗菌和/或抗真菌活性的提取物，和可选地包括使用常规方法浓缩提取物。
在本发明的一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的组合物，其中所述组合物具有抗菌和/或抗真菌活性。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物的组合物，其中所述组合物具有抗菌和/或抗真菌活性。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌以及具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物的组合物，其中所述组合物具有抗菌和/或抗真菌活性。
在本发明的一个实施例中，提供了一种组合物，其包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌和/或所述新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis的提取物，或其可选的包括一种或多种抗菌和/或抗真菌剂的组合。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物的组合物，其可选地包含一种或多种抗菌和/或抗真菌剂。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌与其提取物的组合的组合物，其可选地包含一种或多种抗菌和/或抗真菌剂。
在本发明的一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌或具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物或其组合的组合物，其可选的包含农业上或药学上可接受的载体。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的组合物，其可选地包含农业上或药学上可接受的载体。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的提取物的组合物，其可选地包含农业上或药学上可接受的载体。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌和所述新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis的提取物的组合的组合物，其可选地包含农业上可接受的载体(参见附录III)。
在本发明的一个实施例中，提供了用于抑制病原真菌和/或细菌生长的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或细菌与有效量的具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌或包含所述新型细菌或其提取物或其组合的组合物进行接触。
在本发明的一个实施例中，提供了抑制病原真菌和/或细菌生长的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或细菌与有效量的具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌进行接触。
在本发明的另一个实施例中，提供了抑制病原真菌和/或细菌生长的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或细菌与有效量的包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的组合物进行接触。
在本发明的另一个实施例中，提供了抑制病原真菌和/或细菌生长的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或细菌与有效量的包含枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)新型细菌的提取物的组合物进行接触，其中所述提取物具有抗菌和/或抗真菌活性。
在本发明的另一个实施例中，提供了抑制病原真菌和/或细菌生长的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或细菌与有效量的包含枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)新型细菌和所述新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis的提取物的组合物进行接触，其中所述提取物具有抗菌活性和/或抗真菌活性。
在本发明的一个实施例中，提供了具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌或包含所述新型细菌或其提取物或其组合的组合物在制备用于抑制病原真菌和/或细菌生长的抗菌和/或抗真菌组合物中的用途。
在本发明的另一个实施例中，提供了具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌在制备用于抑制病原真菌和/或细菌生长的抗菌和/或抗真菌组合物中的用途。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)在制备用于抑制病原真菌和/或细菌生长的抗菌和/或抗真菌组合物中的用途。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物的组合物在制备用于抑制病原真菌和/或细菌生长的抗菌和/或抗真菌组合物中的用途。
在本发明的另一个实施例中，提供了包含新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物和所述新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis的提取物的组合物在制备用于抑制病原真菌和/或细菌生长的抗菌和/或抗真菌组合物中的用途。
在另一个实施例中，提供了包含具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌的药物的和农业上有效的组合物。
在另一个实施例中，提供了包含新型细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的提取物的药物的和农业上有效的组合物。
在本发明的另一个实施例中，提供了从具有登录号(MTCC-5674)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis新型细菌产生所述有效组合物的方法。
在本发明的另一个实施例中，生产所述组合物/提取物所需的步骤和时间伴随着化合物的最大回收率保持在最小持续时间。
本发明的其它优点或益处
与抗菌和/或抗真菌剂一起的细菌枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)也产生强的嗜热蛋白酶和淀粉酶，其即使在暴露于高温，即121℃15分钟后，它们也是有活性的。
通过以下实施例进一步解释本发明。然而，本发明不以任何方式限于这些实施例。以下实施例旨在说明公开内容的工作，并且不旨在限制性地应用对本发明范围的任何限制。本领域技术人员将理解，本文所述的具体物质的等同替代物或相应的改进被认为在本发明的范围内。
在以下实施例中解释详细方法：
本工作中使用的方法在微生物学中是众所周知的，其中各个参数对于本研究而言是变化的和优化的。
实施例1
1.1空气样品的收集和初步筛选
在海得拉巴和帕坦切鲁(泰伦加纳，印度)的不同地点进行空气取样。在实验室中制备含有T3培养基的一次性培养皿，并将其在不同位置暴露于空气。将暴露的板密封并在30℃下在实验室培养箱中孵育。在帕坦切鲁地区暴露于空气的其中一个平板中，观察到由真菌菌丝体包围的细菌菌落。
1.2初步筛选空气样品的抗菌和/或抗真菌活性
尽管继续孵育，间隙区仍保持，并且真菌菌丝体的生长保持局限于间隙区的周边。使用标准微生物学方法对来自该菌落的微生物进行纯化(图1B)。针对普通真菌尖孢镰刀菌检测个体菌落(图2)。其中一个菌落显示抑制真菌生长，并观察到间隙区(图2)。
1.3新分离株的筛选
在显微镜下对细菌的评价显示其是杆状运动细菌(图5)。在孵育6天后，细菌产生孢子。
细菌的菌落是粘液状的，凸起的，圆形的，光滑的，并且奶油色至灰白色(图4)，并且细胞显示可变的革兰氏染色。
实施例2
2.1新型微生物的表征和鉴定
2.1.1具有登录号(MTCC-5674)的新型分离株枯草芽孢杆菌亚种shriramensis的 表征
进行了一系列生化试验，包括糖类发酵，过氧化氢酶试验，氧化发酵试验，淀粉水解，硫化氢生产试验，氧化酶活性试验。这些试验的结果证实，细菌是过氧化氢酶阳性的，淀粉酶阳性的，氧化酶阳性的和强好氧的。
2.1.1.1枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)-菌落形态
枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)的菌落是粘液状的，凸起的，圆形的，光滑的，并且在颜色上是奶油色至灰白色(图4)。
2.1.1.2培养特征
枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)在30℃(可从15℃增长至55℃)显示最佳生长。由于它是需氧细菌，其需要足够的氧气用于其生长，需要在液体培养基中连续振荡培养。
2.1.1.3细胞形态学
枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)细胞是杆状，双杆菌和运动的(图5)。
2.1.1.3.1与枯草芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌相比较，枯草芽孢杆菌亚种 shriramensis(MTCC-5674)的菌落生长和形态
2.1.1.4过氧化氢酶试验
材料
·枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的培养管
·过氧化氢
方法
·将含有LB培养基的三个管标记为“试验”，“阳性对照”和“阴性对照”，分别将整环枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)，大肠杆菌和肺炎链球菌接种在试管中。在30℃下孵育24小时后，在所有管中加入几滴过氧化氢并观察气泡的形成。
结果
在“试验”和“阳性对照”管中形成气泡，表明枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)是过氧化氢酶阳性菌(图6)。
2.1.1.5淀粉水解
材料
·枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液
·淀粉琼脂板
·碘
·保温箱
方法
根据附录I(VI)中提供的方法制备淀粉琼脂培养基。在含有淀粉琼脂培养基的平板中以相等的距离制备两个孔，并标记为“试验”和“阴性对照”。将500μl每份的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液和无菌蒸馏水分配到标记为“试验”和“阴性对照”的孔中。将平板在50℃孵育4小时。
结果
孵育4小时后，试验孔周围的蓝色消失，表明枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液具有淀粉分解活性。在对照孔周围的区域中没有观察到蓝色的变化(图7)。
2.1.1.6O/F(氧化-发酵)试验
材料
·Hugsh Leifson氧化发酵基础培养基
·试管
·大肠杆菌培养物
·枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)
·保温箱
方法
将含有Hugsh Leifson氧化发酵基础培养基(OFBM)(附录-I(VII)的三个管标记为“阴性对照”，“阳性对照”和“试验”，和整环粪产碱杆菌，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)分别接种在试管中。将试管在30℃下温育48小时，并观察颜色的变化。
结果
从观察结果得出结论，试验生物体(枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)是严格需氧的，因为其没有在培养基的深处发酵碳水化合物(既没有气体形成也没有颜色变化)。由于在培养基表面上有氧，从而观察到一些颜色变化，而大肠杆菌在培养基内部深处生长得很好，并且发酵碳水化合物(气体形成和培养基颜色变化)，表明它是兼性厌氧菌(图8)。在阴性对照中，既没有观察到气体形成也没有观察到颜色变化。
2.1.1.7硫化氢生产试验
材料
·SIM(硫化吲哚动力)培养基
·培养管
·大肠杆菌培养物
·枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)
·保温箱
方法
·含有SIM[硫化吲哚动力{附录–I(VII)}]的培养基的管被标记为“阴性对照”和”试验”，并且分别将整环大肠杆菌和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)接种在试管中，在30℃温育24小时，观察颜色变化。
结果
根据观察结果，已经得出结论，由于培养基没有变黑，因此试验生物体对于H2S的生产是阴性的。在阴性对照中观察到相同的结果(图9)。
2.1.1.8pH对枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)生长的影响
在标准条件下，使用含有调节至3.4至11.0(酸性至碱性)的不同pH值的标准培养基(LB)的培养管来生长枯草芽孢杆shriramensis(MTCC-5674)。在pH为6.4～7.2的范围内观察到了枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的生长，发现最佳pH为7.0。
2.1.1.9枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的抗生素敏感性试验
将24小时的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物铺展在T3琼脂的表面上。将不同的抗生素纸片置于用相应抗生素标记的T3琼脂板的表面上。将板在30℃孵育24小时。
表1-对枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的抗生素敏感性的观察RES-
抗性，INT-中度的，SEN-敏感的
结果
从观察结果得出结论：枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)对抗生素-氨苄青霉素，羧苄青霉素，卡那霉素，恩诺沙星，洁霉素，阿莫西林，克林霉素，新霉素，阿奇霉素是有抗性的。试验细菌对庆大霉素，妥布霉素，万古霉素，新生霉素，磺胺异恶唑，头孢霉素，氯霉素，头孢曲松钠和杆菌肽敏感，并显示出对苯唑西林，阿米卡星，链霉素和红霉素的中度抗性。
2.1.2新分离株枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的鉴定
为了鉴定细菌，进行16S DNA测序和FAME分析。两个研究的结果表明，该细菌与枯草芽孢杆菌亚种subtilis在16S DNA序列上的差异为0.37％，FAME相似指数为0.827；并且与萎缩芽孢杆菌在16S DNA序列上的差异为0.84％，FAME相似指数为0.749。因此，结果表明该细菌与枯草芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌相关，但不与ATCC集合中的任何编目的细菌种类相同。
2.1.2.1 16S DNA序列比较的结果
2.1.2.2FAME分析比较结果
分离的细菌是芽孢杆菌属的新成员。根据细菌命名惯例，新型细菌种被命名为枯草芽孢杆菌亚种shriramensis。细菌被储存在印度昌迪加尔的IMTECH的微生物典型培养物保藏中心(MTCC)中。这种新型物质的储存号是(MTCC-5674)。
实施例3
3.1抗菌和/或抗真菌剂的生产和筛选
3.1.1抗菌和/或抗真菌剂的生产
材料
·T3液体培养基-1升
·锥形瓶-容量2L
·卡那霉素(30μg/ml)
·枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)接种物
·振荡培养箱(设置在30℃温度和200rpm摇动)
方法
根据附录-I(1)中描述的方法制备T3液体培养基。将1ml枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物接种到无菌T3液体培养基中，并在振荡培养箱中在30℃下孵育60小时，同时以200rpm振荡。在枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)在T3液体培养基中培养60小时后，将培养基在12000rpm和4℃下离心10分钟。收集上清液并通过0.22μm过滤器以分离出任何残留的细菌细胞。滤液保持在4℃。
3.1.2筛选在上述步骤3.1.1中收集的培养物滤液的抗菌和/或抗真菌活性
材料
·含有抗菌和/或抗真菌剂的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液
·PDA平板
·试验真菌尖孢镰刀菌
·保温箱
方法
为了检测滤液中抗菌和/或抗真菌剂的活性，在PDA琼脂板的一个角中制备孔，将500μl滤液置于孔中。将整环真菌尖孢镰刀菌接种在同一PDA琼脂板的另一个角上，并在室温下孵育5天。将滤液对真菌尖孢镰刀菌的抑制活性记录为孔周围的以毫米计算的抑菌圈。
结果
在孔周围观察到14mm的清楚的抑菌圈，这表明用于生产抗菌和/或抗真菌剂的方法是最佳的。
3.2抗菌和/或抗真菌剂的表征
调查与枯草芽孢杆菌亚种shriramensis相关的抗菌和/或抗真菌活性以确定引起抗菌和/或抗真菌活性的试剂的性质。
材料
·T3液体培养基-1升
·锥形瓶-容量2L
·卡那霉素(30μg/ml)
·枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)接种物
·振荡培养箱
方法
根据附录-I(1)中描述的方法制备T3液体培养基。将1ml 24小时的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)接种到无菌T3液体培养基中，并在振荡培养箱中在30℃下孵育60小时，同时以200rpm振荡。在枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)在T3液体培养基中培养60小时后，将培养基在12000rpm和4℃下离心10分钟。收集上清液并通过0.22μm过滤器以除去任何残留的细菌细胞。
3.2.1用枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细菌细胞进行的抗菌和/或 抗真菌试验
为了检测细胞的抗菌和/或抗真菌剂的活性，将整环枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)接种在T3琼脂板的一个角上，并将整环真菌尖孢镰刀菌接种在同一T3琼脂板的另一角上，并在室温下孵育5天。将细菌细胞对真菌尖孢镰刀菌的抑制活性记录为细菌菌落周围的以毫米计算的抑菌圈。
结果
在细菌菌落周围观察到14mm的清楚的抑菌圈(图11A)，这表明由细菌细胞分泌的活性化合物正在培养基中扩散出来，从而产生远离细菌菌落的间隙区。
3.2.2使用枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液进行的抗菌 和/或抗真菌试验
为了检测滤液中抗菌和/或抗真菌剂的性质，在PDA琼脂板中制备孔，将500μl滤液置于孔中。将整环真菌尖孢镰刀菌接种在同一PDA琼脂板的斜对角并在室温下孵育5天。将滤液对真菌尖孢镰刀菌的抑制活性记录为孔周围的以毫米计算的抑菌圈。
结果
在孔周围观察到清楚的14mm的抑菌圈(图11B)，表明滤液保持抗菌和/或抗真菌活性，从而表明活性化合物被分泌到细菌细胞外进入培养基中。
3.3枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)抗菌和/或抗真菌剂的MIC测定
3.3.1抗菌和/或抗真菌剂的冻干
材料
·枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的培养物滤液
·硫酸铵
·冷冻干燥器
方法
通过3.1.1中解释的方法生产和纯化抗菌和/或抗真菌剂。将800ml等分培养物滤液与382.18g硫酸铵以70％(w/v)饱和度混合(Jing等人，2009修订协议)，并通过在4℃下搅拌过夜以缓慢混合溶液。将悬浮液在4℃下以10,000rpm离心10分钟。将由此获得的沉淀物在冷冻干燥器中冻干24小时，并将干燥的沉淀物在室温下储存。
3.3.2枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)抗菌和/或抗真菌剂的MIC
方法
3.3.2.1管稀释法
3.3.2.2琼脂扩散法
·制备冻干抗菌和/或抗真菌剂的储备溶液
通过将1g抗菌和/或抗真菌剂的冻干粉末溶解在50ml磷酸盐缓冲液(pH7.0)中制备储备溶液。将储备溶液的最终浓度调节至20μg/μl。该储备溶液用于以如表-1所示的不同比例的PDB培养基进行稀释。
3.3.2.1管稀释法
材料
·1.5ml管
·PDB培养基
·抗菌和/或抗真菌剂原料
·尖孢镰刀菌孢子悬浮液
方法
在1.5ml管中进行抗菌和/或抗真菌剂的MIC测定。用PDB培养基(表-2)制备从10μg/μl(1：1)至198ng/μl(1:100)的不同稀释度的抗菌和/或抗真菌剂。通过在所有管中加入30μl(5×106cfu/ml)孢子悬浮液进行针对尖孢镰刀菌的MIC测定，并在28℃下孵育2天，以180rpm摇动。
使用三个对照，一个具有未稀释的抗菌和/或抗真菌剂储备，第二个在PDB中有70％硫酸铵，第三个仅具有PDB。在所有三个管中的培养基中接种30μl(5×106cfu/ml)尖孢镰刀菌孢子悬浮液，并在28℃下孵育2天，同时以180rpm摇动。
3.3.2.2琼脂扩散法
材料
·PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板
·PDB(马铃薯葡萄糖液体培养液)培养基
·抗菌和/或抗真菌剂储备
·尖孢镰刀菌
方法
冻干的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)抗菌和/或抗真菌剂的MIC测定也通过琼脂扩散法进行实施。在PDA板上以相等的距离制作了四个孔，其中每个孔直径为9mm。在PDB(表-3)中制备10μg(1：1)至198ng(1:100)不同稀释度的抗菌和/或抗真菌剂。将每种稀释液以200μl等分置于标记有各自稀释度的孔中。将试验真菌尖孢镰刀菌接种在PDA培养基的中心，并将平板在28℃孵育4天。
使用具有三个对照的板作为对照，三个对照中一个含有未稀释的抗菌和/或抗真菌剂储备，第二个仅含有PDB液体培养基，第三个含有具有70％硫酸铵的PDB。该活性被测量为孔周围的以毫米计算的抑菌圈。
结果
管稀释法(图12)
孵育48小时后在光学显微镜下观察样品的孢子萌发。在含有按照比例为1:1,1:2,1:3和1:4稀释的抗菌和/或抗真菌剂的管中孢子不萌发。在含有以1:5,1:6,1:7,1:8和1:9的比例稀释的抗菌和/或抗真菌剂的管中观察到中度的孢子萌发，并且在含有抗菌剂和/或抗真菌剂的比例为1:10至1:100的剩余管观察到正常的孢子萌发和菌丝体形成(表2)。
表-2通过管稀释法检测抗菌和/或抗真菌剂的MIC
琼脂扩散法(图13)
在含有以比例1:1，1:2，1:3和1:4(表3)稀释的抗菌和/或抗真菌剂的孔周围，观察到真菌菌丝体生长的抑制。在含有以比例1:5,1:6和1:7稀释的抗菌和/或抗真菌剂的孔的周围观察到中度抑制，并且在剩余稀释度中没有观察到抑制(从1:8至1:100)(表 3)。
结论
从上述试验得出，粗提物粉末至其1:4(v/v)的稀释物中的抗菌和/或抗真菌剂以浓度依赖性方式抑制孢子萌发以及菌丝体生长。
表3通过琼脂扩散法测定抗菌和/或抗真菌剂的MIC
3.4检测新型分离的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的细胞裂解物 的抗菌和/或抗真菌活性
材料
·PDA琼脂板
·LB液体培养基
·枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞
·溶菌酶
·保温箱
方法
3.4.1枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的细胞裂解
根据附录I(3)中描述的方法制备LB液体培养基。将枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的单个菌落接种到无菌LB液体培养基中，并在30℃下孵育24小时。培养24小时后，以6500rpm，4℃离心收集营养细胞，将细胞用无菌蒸馏水洗涤三次，并在37℃下在溶菌酶中孵育2小时进行细胞裂解。裂解后，将悬浮液在4℃下以10,000rpm离心10分钟以除去细胞碎片。收集上清液并通过0.22μm过滤器并在4℃储存。
3.4.2细胞裂解物的抗菌和/或抗真菌测定
在Petri板中的PDA琼脂的两个对角端部钻了两个孔，并将一个标记为”试验”，另一个作为“对照”。将500μl裂解物的等分试样加入到试验孔中，向对照孔中仅加入500μl溶菌酶。将试验真菌尖孢镰刀菌接种在PDA琼脂的中间，并在室温下孵育5天。
结果
细胞裂解物对真菌尖孢镰刀菌没有表现出抗菌和/或抗真菌活性(图15)，表明抗菌和/或抗真菌剂主要分泌到培养基中。
实施例4
4.1针对其他致病真菌检测抗菌和/或抗真菌活性
材料
·枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)
·植物病原真菌
1.立枯丝核菌(在茄科家族成员中引起纹枯病)。
2.鞘腐败病菌(引起水稻中的鞘腐病)
3.炭疽菌(引起红辣椒中的炭疽病)。
4.玉米大斑病菌(引起turcicumblight)。
5.球孢菌(引起碳腐病)。
·T3-液体培养基
·T3-琼脂板
·PDA-琼脂板
·保温箱
方法
4.1.1用枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞针对各种植物病原真 菌检测抗菌和/或抗真菌活性
将整环枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞和整环试验真菌接种在标记有相应真菌的T3板的斜对角，并在28℃下孵育，直到细菌菌落附近观察到真菌菌丝体的生长。
4.1.2用滤液针对各种植物病原真菌检测抗菌和/或抗真菌活性
将500μl含有抗菌和/或抗真菌剂的培养物滤液的等分试样加入到在PDA琼脂中制作的孔中，并将整环试验真菌接种在用相应真菌标记的各个板的另一个角上，并在28℃孵育直到在含有培养物滤液的孔附近观察到真菌菌丝体的生长。
以孔周围形成的抑菌圈的毫米数记录滤液对目标真菌的抑制活性。
结果
在抗菌和/或抗真菌测定中检测了一系列引起植物疾病的真菌种类，并且在枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞及其培养滤液存在下，它们都表现出完全生长抑制。
4.2保护水稻种子免受真菌侵袭的抗菌和/或抗真菌剂功效
将水稻种子用尖孢镰刀菌孢子和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液进行处理，置于含有普通琼脂的培养皿中，检测枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)抗菌和/或抗真菌剂在抑制对发芽种子真菌侵袭的功效。
对照种子仅用尖孢镰刀菌真菌孢子处理。
结果
在枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)抗菌和/或抗真菌剂存在的条件下，真菌未能感染种子，所述水稻种子正常发芽。然而，仅用真菌处理的种子显示严重的感染并且不能发芽(图17)。
4.3检测植物的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的病原性。
材料
·可喷雾形式的在1％CMC中的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)
·水稻，棉花，烟草，玉米和番茄植株
·喷雾器
方法
如果可以的话，将枯草芽孢杆菌培养物在一系列植物物种上进行广泛的病原行为检测。
将枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)接种到2L锥形瓶中的1L无菌LB液体培养基中，30℃孵育24小时，以200rpm摇动。细菌生长后，以6,500rpm，4℃离心10分钟收集细胞。将沉淀物在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中洗涤两次，并在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1％CMC(羧甲基纤维素)中制成浆液。该悬浮液用于喷洒水稻，烟草，玉米，番茄和棉花等作物。
结果
从观察结果可以看出，喷有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的所有的植物种类(水稻，烟草，玉米，番茄和棉花)均没有出现任何疾病症状，其生长发育与对照植物相当，表明枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)对植物种类是非致病性的(图18)。
实施例5
5.1含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞的抗菌和/或抗真菌组
合物的制剂作为生物防治剂
材料
·枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)
·LB–液体培养基
·PDB(马铃薯葡萄糖液体培养液)
·磷酸盐缓冲液(pH 7.0)
·CMC(羧甲基纤维素)
方法
5.1.1枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞悬浮液的制备
将枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)接种在2L锥形瓶中的1L无菌LB液体培养基中，在30℃下孵育24小时，以200rpm摇动。枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)生长后，培养物在4℃下以6,500rpm离心10分钟。将沉淀物在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中洗涤两次，并与磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1％CMC(羧甲基纤维素)混合，制备含有6×107cfu/ml的浆液。使用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的浆液喷洒在植物上，通过浸渍处理植物幼苗根部。
5.1.2检测含有抗菌和/或抗真菌剂的制剂抑制番茄植株根系感染立枯丝核菌 (NFCCI-3194)的功效
材料
·含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的悬浮液
·立枯丝核菌(NFCCI-3194)真菌(在茄科家族成员中引起纹枯病)。
·Soil Rite
·番茄幼苗
5.1.3立枯丝核菌(NFCCI-3194)的制备
使立枯丝核菌(NFCCI-3194)在马铃薯葡萄糖液体培养基(根据附录I(V)提供的方法制备)中生长6天，随着立枯丝核菌(NFCCI-3194)的生长，将其与soil rite彻底混合，并在室温下孵育15天，含有真菌的soil rite与土壤以1：1的比例混合。
·番茄幼苗
本研究使用10厘米高的番茄幼苗。
方法
试验按如下描述实施
A.将番茄幼苗种植在含有立枯丝核菌(NFCCI-3194)的土壤中，但不用枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)处理。
B.用含有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的悬浮液处理番茄幼苗的根部，并种植在含有立枯丝核菌(NFCCI-3194)的土壤中。
C.未经任何处理的番茄幼苗。
A.用枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞和真菌立枯丝核菌 (NFCCI-3194)处理幼苗
将番茄幼苗根浸于枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞制剂中30分钟。将经过处理的幼苗种植在含有与真菌立枯丝核菌(NFCCI-3194)混合的土壤的盆中。
对照幼苗
为了在幼苗中诱导疾病，将番茄幼苗(未处理的)种植在含有与真菌立枯丝核菌 (NFCCI-3194)混合的土壤的盆中。
对于阴性对照，番茄幼苗(未处理的)种植在含有未与真菌立枯丝核菌(NFCCI- 3194)混合的土壤的盆中。
将含有番茄幼苗的所有盆栽移至温室，保持至结实期。
结果
从观察结果可以得出结论：用枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)和真菌立枯丝核菌(NFCCI-3194)的组合所处理的幼苗生长地非常好，与对照植物相当，而种植在含有真菌立枯丝核菌(NFCCI-3194)盆中的幼苗(未处理)与对照相比显示出生长阻滞，花果形成不佳。因此，可以得出结论：枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)抑制番茄幼苗根际区域的真菌立枯丝核菌(NFCCI-3194)的生长，保护幼苗免受引起疾病的真菌之害(图19)。
实施例6
6.1体外评估可以防治发芽玉米种子感染土壤和种子真菌病原体草酸青霉菌 (NFCCI-1997)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞的最小数量。
6.1.1细菌和真菌悬浮培养物的制备
材料
a.枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)
b.草酸青霉菌(NFCCI-1997)-植物病原真菌
c.多菌灵WP50(商业杀真菌剂)
d.Luria Bertani培养基(LB)
方法
6.1.1.1枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的悬浮培养物的制备
将枯草芽孢杆菌shriramensis(MTCC-5674)的纯菌落(Fig.20-1)接种在10ml LB液体培养基中，并在30℃下以180rpm孵育24小时。为了制备生物防治剂，将1ml新鲜培养物接种在100ml LB液体培养基中，并在30℃下以180rpm孵育24小时。通过定期测量培养物在625nm处的吸光度来监测培养物的生长。通过离心收集细菌细胞，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，在4℃以5500rpm离心10分钟。将细胞最终悬浮于5ml无菌磷酸盐缓冲液中。该浓缩悬浮液用于制备生物防治制剂。
6.1.1.2草酸青霉菌(NFCCI-1997)(真菌病原体)悬浮培养物的制备
将草酸青霉菌(NFCCI-1997)(图20-2)的纯菌落接种在PDA板上，在28℃下孵育至孢子形成。将整环真菌孢子接种在100ml的PDB中，并在28℃下以180rpm孵育7天。将含有真菌孢子的培养物的水相部分收集在50ml聚丙烯试管中。通过在4℃下以8000rpm离心10分钟的方式用无菌磷酸盐缓冲液洗涤所述孢子。将所述孢子悬浮在所需体积的无菌磷酸盐缓冲液中，得到6×104ml-1的cfu。
6.1.2使用草酸青霉菌(NFCCI-1997)(真菌病原体)感染土壤
为了在土壤培养基中保持足够的真菌孢子负荷，将50ml真菌孢子悬浮液(6×104cfu/ml)与1kg高压灭菌的soil rite混合并在28℃下孵育10天。用真菌定殖的soilrite与土壤以1：1的比例均匀混合，并填充在96个杯托中。
6.1.3用于生物防治土壤植物病害的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC- 5674)制剂的制备
材料
a.CMC(羧甲基纤维素)
b.蔗糖
c.红色聚合物(无杀真菌剂)
d.枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞悬液(生物防治剂)
e.多菌灵(商业杀真菌剂)
为了评估可以抑制发芽玉米种子上的草酸青霉素(NFCCI-1997)生长和病原性的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的有效浓度，设计了四种不同制剂(详细情况见下表)。将仅含有生物防治剂的制剂、仅含有商业杀真菌剂的制剂，以及不含生物防治剂的制剂或不含杀真菌剂的制剂用作对照。所有制剂都含有一种结合材料-CMC(羧甲基纤维素)，碳源(蔗糖)和红色聚合物(无杀真菌剂)。
1.对照-1(无真菌病原体和生物防治剂的制剂)
该制剂由1％CMC，2％蔗糖和红色聚合物组成。该制剂没有生物防治剂，致病剂和杀真菌剂。用该制剂处理的种子用作对照种子。
组成
| 序列号 | 组成 | 重量/体积/数量 | 最终浓度 |
| 1 | CMC | 1.71μg | 1.00％w/v |
| 2 | 蔗糖 | 3.42μg | 2.00％w/v |
| 3 | 红色聚合物 | 34μl | 19.88％v/v |
| 4 | 水 | 31.87μl | - |
| 合计 | 171μl | - |
2.对照-2(具有真菌病原体但不含生物防治剂的制剂)
该制剂由1％CMC，2％蔗糖和红色聚合物组成。其没有生物防治剂/商业杀真菌剂，但用该制剂处理的种子播种在接种有草酸青霉菌(NFCCI-1997)真菌的土壤中。由于该种子周围没有生物或化学保护，该真菌大量生长，感染种子并在幼苗中发展成疾病。用该制剂处理的种子用作患病对照。
组成
| 序列号 | 组成 | 重量/体积/数量 | 最终浓度 |
| 1 | 草酸青霉菌(NFCCI-1997) | 存在于土壤中 | - |
| 2 | CMC | 1.71μg | 1.00％w/v |
| 3 | 蔗糖 | 3.42μg | 2.00％w/v |
| 4 | 红色聚合物 | 34μl | 19.88％v/v |
| 5 | 水 | 31.87μl | - |
| 合计 | 171μl | - |
3.对照-3(具有商品杀真菌剂“多菌灵WP50”的制剂)
该制剂由1％CMC，2％蔗糖，红色聚合物和商业杀真菌剂多菌灵WP50(商品名Bavistin)组成，多菌灵以500μg/ml的浓度使用(Mohiddin等，2013)。该制剂用于比较生物防治剂和商业杀真菌剂在抑制发芽种子附近的真菌生长中的功效。
组成
| 序列号 | 组成 | 重量/体积/数量 | 最终浓度 |
| 1 | 多菌灵 | 85.50μg | |
| 2 | CMC | 1.71μg | 1.00％w/v |
| 3 | 蔗糖 | 3.42μg | 2.00％w/v |
| 4 | 红色聚合物 | 34μl | 19.88％v/v |
| 5 | 水 | 31.87μl | - |
| 合计 | 171μl | - |
4a.具有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)的制剂(5×104cfu)
该制剂由1％CMC，2％蔗糖，红色聚合物和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞组成，细胞浓度为5×104cfu/ml。该制剂具有最少数量的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞。
组成
4b.具有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞的制剂(5×105cfu)
该制剂由1％CMC，2％蔗糖，红色聚合物和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞组成，细胞浓度为5×105cfu/ml。
组成
4c.具有枯草芽孢杆菌(MTCC-5674)细胞的制剂(5×106cfu)
该制剂由1％CMC，2％蔗糖，红色聚合物和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞组成。细胞浓度为5×106cfu/ml。
组成
4d.具有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis细胞的制剂(5×107cfu)
该制剂由1％CMC，2％蔗糖，红色聚合物和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞组成，细胞浓度为5×107cfu/ml(5000万个细胞/ml载体)。该制剂具有最大数量的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞。
组成
5.仅具有枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞的制剂(5×107cfu)
该制剂由1％CMC，2％蔗糖，红色聚合物和枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞组成，细胞浓度为5×107cfu/ml。该制剂具有最大数量的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞，用于研究生物防治剂对种子发芽和植物生长的影响。
组成
种子包衣
将上面给出的组合物的生物防治制剂涂覆在玉米种子上(图21)。将每个处理的二十个玉米种子一式三份(共60个种子)用0.1％HgCl2表面灭菌10分钟，并用95％乙醇冲洗，再每个用无菌水洗涤10分钟。将干种子用不同制剂的171μl/60粒种子包被并且空气干燥2小时。
种子播种
将所有处理的种子播种在96个杯托盘中，每次处理三次重复。所有的托盘都保存在温室中并保持在受控的条件下。从种子发芽开始，托盘被监测到5周。
数据记录
发芽率
在种子播种1周后记录所有处理种子的发芽率。
疾病发病
种子播种4周后，疾病发病率以百分比记录。用于记录疾病发病率的公式(Hoffmanet al。，2002)如下：
结果
种子发芽和幼苗生存
在分别使用制剂-3(对照-3)，4c，1(对照-1)，4b，4d和5处理的种子中记录了最佳种子发芽率，即93.33％，96.66％，100.00％，100.00％，100.00％和100.00％，随后是用制剂-4a和2(对照-2)处理的种子中为83.33％，为33.33％。在用上述所有制剂处理的种子中，除了用制剂-3(其具有商业杀真菌剂)处理的种子，播种4周后的幼苗存活率记录为100.00％，这清楚地表明商业杀真菌剂“多菌灵WP50”，尽管有效地抑制真菌生长，但并不是100.00％有效。含有不同浓度枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞的制剂(除了4a-，其具有最少数量的细胞)被证明是100.00％的有效保护枯草芽孢杆菌亚种shriramensis种子免受存在于土壤中的P.oxalicum(NFCCI-1997)损害。
用制剂-4a(使用细菌细胞最少浓度的制剂，为50,000个细胞/ml载体)处理的种子的发芽率的下降明确的表明需要基础剂量的细菌细胞使发芽种子免受存在于土壤中的P.oxalicum(NFCCI-1997)的损害。因此，细菌浓度为5×105cfu/ml(50万个细胞/ml)的制剂-4b赋予了针对P.oxalicum(NFCCI-1997)的良好保护，并给予100％的种子发芽和幼苗存活率，与对照种子相同。
疾病发病率
研究结果表明，处理之间具有显著差异。用制剂1,4b，4c，4d和5处理的种子没有表现出任何疾病症状并显示出与对照幼苗相似的健康生长，表明存在于制剂中的生物防治剂枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)大大抑制了真菌P.oxalicum(NFCCI-1997)的生长和病原性，从而保护了种子免受真菌感染。用制剂-3(其具有商业杀真菌剂多菌灵50WP)处理的种子显示出3.57％的疾病发病率，表明尽管商业杀真菌剂能够有效抑制真菌生长，但不如在此研究中使用的生物防治剂好。
表-6用不同制剂处理的玉米幼苗的疾病发病率百分比。
分别用制剂4a和2处理的种子中记录了82％和100％的疾病发病率。结果表明，在制剂4a中存在的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞密度对抑制真菌生长无效，因此发芽种子被真菌感染，并在发芽2周后死亡。如预期，用制剂-2(既不具有生物防治剂，又不具有商业杀真菌剂)处理的种子显示100％的疾病发病率，表明真菌感染发芽种子并在发芽的2周内杀死幼苗。
结论
上述结果清楚地表明浓度为5×105cfu/ml(制剂-4b)的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)能有效抑制真菌病原体的生长，并对玉米发芽幼苗提供100％的保护。因此，生物防治剂可以成功地用于涂覆种子，以有效控制土壤传播的致病真菌P.oxalicum(NFCCI-1997)。
6.2检测枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞制剂在促进植物的生 长和产量中的功效
材料和方法
材料
1.用6.1.3(4b)中提及的配方处理玉米，番茄和茄子的种子。
2.控制玉米，番茄和茄子的种子。
方法
种子包衣
用6.1.3(4b)中提及的制剂处理玉米，番茄和茄子种子，风干。
种子播种
将处理和未处理(对照)的玉米，番茄和茄子种子播种在4米区域，每个重复三次，每个重复含有23个种子。保持标准间距测量，如：植物之间20厘米和60厘米行距。遵循适当的农艺栽培措施，使这些作物种植成熟。
结果
植物生长参数和田间条件下产量显著增加。用包含枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞的制剂包衣的种子在玉米，茄子和番茄中的产量分别提高了17.60％，37.15％和1.58％(表7)。玉米，茄子和番茄植物表现出更高的生长发育率和生物量积累(图25中给出了处理和未处理玉米差异的代表性图片)。早期关于植物生长促进剂的报道也证明含有枯草芽孢杆菌的制剂通过生产60种不同类型的次级代谢物来增强植物的生长并诱导对疾病保护的全身抗性(Compant等，2005和Mohan Kumar等，2015)。
表-7枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)细胞制剂对玉米，番茄和茄子产量的影响。
实施例7
7.1筛选抗真菌/抗菌剂抑制人类病原真菌生长的功效
从各种皮肤和肺部感染的人群中分离出一系列引起人类疾病的真菌物种。针对所有分离的人类病原真菌检测抗真菌和/或抗菌活性。
材料和方法
材料
1.青霉亚种
2.黄曲霉
3.黑曲霉
4.构巢曲霉
5.PDA板
6.从枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)中分离的抗真菌/抗菌剂
方法
将500μl含有抗菌和/或抗真菌剂的培养物滤液的等分试样加入到在PDA琼脂中制备的孔中，并将整环试验真菌接种在用相应真菌标记的各个板的另一个角上并在28℃孵育直到在含有培养物滤液的孔附近观察到真菌菌丝体的生长。
以孔周围形成的抑菌圈的毫米数记录滤液对目标真菌的抑制活性。
结果
从各种皮肤和肺部感染的人群中分离出一系列引起人类疾病的真菌物种并对其进行抗菌和/或抗真菌测定，并且在枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)培养物滤液存在下，它们都表现出枯草芽孢杆菌亚种shriramensis完全抑制生长(图24)。
结论
从观察结果可以看出，从枯草芽孢杆菌亚种shriramensis(MTCC-5674)中分离的抗真菌/抗菌剂也可用于制药应用。
参考文献
1.Compant,S.,Duffy,B.,Nowak,J.,Clement,C.and Barka,E.A.(2005).Use ofplants growth promoting bacteria for biocontrol of plant diseases:Principles,Mechanisms of action,and future prospects.Appl.Environ.Microbiol.71:4951-4959.Sci.World J.,Vol 2012,pp.001-012.
2.Hoffmann,W.A.and Poorter,H.2002.Avoiding Bias in Calculations ofRelative Growth Rate.Ann.Bot.,Vol.90(1),pp.37-42.
3.Li,J.Yang,Q.Zhao,L-H,Zhang,S.M.,Wang,Y.X.Xiao-yu and Zhao,X.Y.2009.Purification and characterization of a novel antifungal protein fromBacillus subtilis strain B29.J.Zhejiang Univ.Sci.B.,Vol.10(4)pp.264–272.
4.
E.Sas-Paszt,L.and Ciesielska,J.2012.Technologies forBeneficial Microorganisms Inocula Used as Biofertilizers.The Scientific WorldJournal Volume 2012,Article ID 491206,pp.1-12.
5.Mena-Violante,H.G.and Olalde-Portugal,V.2007.Alteration of tomatofruit quality by root inoculation with plant growth-promoting rhizobacteria(PGPR):Bacillus subtilis BEB-13bs.Sci.Hort.,Vol.1(113),pp.103–106.
6.Mohan Kumar,S.P.,Chowdappa,P.and Krishna,V.(2015).Development ofseed coating formulation using consortium of Bacillus subtilis OTPB1 andTrichoderma harzianum OTPB3 for plant growth promotion and induction ofsystemic resistance in field and horticultural crops.Indian Phytopath.68(1):25-31.
7.Mohiddin,F.A.and Khan,M.R.2013.Tolerance of fungal and bacterialbio-control agents to six pesticides commonly used in the control of soilborne plant pathogens.Global J.Pests,Dis.Crop Prot.,Vol.1(1),pp.001-004.
相关专利
1.A novel strain of Bacillus for controlling plant diseases and cornrootworm.(EP981540A1).
2.Strain of Bacillus subtilis for agricultural use.(WO2009031874A1).
3.Antifungal Bacillus subtilis and a microorganism wettable powdercontaining the same(KR2011075132A).
附录I
使用的培养基的组成
注意：下面提供了培养基制备的一般方法。以下给出的所有培养基组合物为100ml体积。组分根据所需数量而改变。
(I)T3液体培养基的制备(pH-6.8)
T3培养基的组成
| 序列号 | 组成 | 数量 |
| 1 | 胰蛋白胨 | 0.32％(w/v) |
| 2 | 胰蛋白示 | 0.24％(w/v) |
| 3 | 酵母提取物 | 0.18％(w/v) |
| 4 | NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O | 0.044M |
| 5 | Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 0.062M |
| 6 | MnCl<sub>2</sub>.4H<sub>2</sub>O | 0.0005％(w/v) |
方法
将所有培养基成分称重收进玻璃瓶中并溶于蒸馏水中。将具有培养基的容器在121℃下高压灭菌15分钟。
(II)T3琼脂板的制备(pH-6.8)
T3培养基的组成
| 序列号 | 组成 | 数量 |
| 1 | 胰蛋白胨 | 0.32％(w/v) |
| 2 | 胰蛋白示 | 0.24％(w/v) |
| 3 | 酵母提取物 | 0.18％(w/v) |
| 4 | NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 0.044M |
| 5 | Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 0.062M |
| 6 | MnCl<sub>2</sub> | 0.0005％(w/v) |
| 7 | 琼脂 | 2.0％(w/v) |
方法
将所有培养基成分称重收进玻璃瓶中并溶于蒸馏水中。将具有培养基的玻璃瓶在121℃下高压灭菌15分钟。高压灭菌后，将培养基倒入无菌培养皿中。
(III)LB液体培养基的制备(pH-7.0)
LB培养基的组成
| 序列号 | 组成 | 数量 |
| 1 | 胰蛋白胨 | 1.0％(w/v) |
| 2 | 酵母提取物 | 0.5％(w/v) |
| 3 | NaCl | 1.0％(w/v) |
方法
将所有培养基成分称重收进玻璃瓶中并溶于蒸馏水中。将具有培养基的容器在121℃下高压灭菌15分钟。
(Ⅳ)LB琼脂板的制备(pH-7.0)
LB培养基的组成
| 序列号 | 组成 | 数量 |
| 1 | 胰蛋白胨 | 1.0％(w/v) |
| 2 | 酵母提取物 | 0.5％(w/v) |
| 3 | NaCl | 1.0％(w/v) |
| 4 | 琼脂 | 2.0％(w/v) |
方法
将所有培养基成分称重并收进玻璃瓶中并溶于蒸馏水中。将具有培养基的玻璃瓶在121℃下高压灭菌15分钟。高压灭菌后，将培养基倒入无菌培养皿中。
(V)PDB液体培养基的制备(pH-6.0)
PDB培养基的组成
| 序列号 | 组成 | 数量 |
| 1 | 马铃薯粉 | 2.0％(w/v) |
| 2 | 葡萄糖 | 2.0％(w/v) |
| 3 | 壮观霉素(可选) | 100μg/ml |
方法
称量马铃薯粉(2.0g)并收进含有50ml蒸馏水的250ml玻璃瓶中并煮沸5分钟。用棉布过滤煮沸的马铃薯水。将滤液收集到新鲜的250ml玻璃瓶中，并向其中加入2.0g葡萄糖。使总体积达到100ml后，将具有培养基的瓶子在121℃高压灭菌15分钟。
(VI)PDA琼脂板的制备(pH-6.0)
PDA培养基的组成
方法
称量马铃薯粉(2.0g)收进含有50ml蒸馏水的250ml玻璃瓶中并煮沸5分钟。用棉布过滤煮沸的马铃薯水。将滤液收集在新鲜的250ml玻璃瓶中，加入2.0g葡萄糖和2.0g琼脂。使总体积达到100ml后，将具有培养基的瓶子在121℃高压灭菌15分钟。将熔融的PDA倒入无菌培养皿中。
(VII)Hugh和Leifson OF基础培养基(OFBM)的制备(pH-7.1)
OFBM培养基的组成
| 序列号 | 组成 | 数量 |
| 1 | 酪蛋白胨(胰蛋白胨)0.2％ | 0.2％(w/v) |
| 2 | NaCl | 0.5％(w/v) |
| 3 | K<sub>2</sub>HP0<sub>4</sub> | 0.03％(w/v) |
| 4 | 琼脂 | 2.0％(w/v) |
| 5 | 溴百里酚蓝 | 0.004％(w/v) |
方法
将所有培养基成分称重并收进玻璃瓶中并溶于蒸馏水中。将具有培养基的玻璃瓶在121℃下高压灭菌15分钟。高压灭菌后，将培养基倒入无菌培养管中。
(VI)SIM(硫化吲哚动力)培养基(pH-7.3)的制备
SIM培养基的组成
| 序列号 | 组成 | 数量 |
| 1 | 蛋白胨 | 3.0％(w/v) |
| 2 | 牛肉提取物 | 0.3％(w/v) |
| 3 | 硫酸亚铁铵 | 0.02％(w/v) |
| 4 | 硫代硫酸钠 | 0.0025％(w/v) |
| 7 | 琼脂 | 2.0％(w/v) |
方法
将所有培养基成分称重收进玻璃瓶中并溶于蒸馏水中。将具有培养基的玻璃瓶在121℃下高压灭菌15分钟。高压灭菌后，将熔融阶段的培养基倒入无菌培养管中。
附录II
制备磷酸盐缓冲液
方法
将两种磷酸盐都收进玻璃烧杯中，将50毫升蒸馏水加入到盐中，并使用磁棒在磁力搅拌器上搅拌。确保磷酸盐完全溶解后，用蒸馏水将溶液加至100ml。
附录III
实验中使用的载体和其他试剂
缩写词
| 序列号 | 简写 | 全称 |
| 1 | ATCC | 美国典型培养物保藏中心 |
| 2 | CMC | 羧甲基纤维素 |
| 3 | CFU | 菌落形成单位 |
| 4 | L | 升 |
| 5 | LB | Luria-Bertani |
| 6 | μl | 微升 |
| 7 | MTCC | 微生物典型培养物保藏中心 |
| 8 | Ml | 毫升 |
| 9 | MIC | 最低抑菌浓度 |
| 10 | Min | 分钟 |
| 11 | M | 摩尔 |
| 12 | NFCCI | 印度国家真菌培养物保藏中心 |
| 13 | OFBM | 氧化发酵基础培养基 |
| 14 | PDA | 马铃薯葡萄糖琼脂 |
| 15 | PDB | 马铃薯葡萄糖培养液 |
| 16 | RPM | 每分钟转速 |
| 17 | Ssp | 亚种 |
| 18 | SIM | 硫化吲哚动力 |
| 19 | v/v | 体积相比体积 |
| 20 | w/v | 重量相比体积 |
| 21 | w/w | 重量相比重量 |
| 22 | WP | 可湿性粉剂 |
Claims (12)
1.一种属于芽孢杆菌属的细菌，其表现抗真菌和促进植物生长的活性，其中所述细菌是具有登录号MTCC-5674的分离的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis。
2.如权利要求1所述的属于芽孢杆菌属的细菌的提取物，其具有抗真菌活性，其中该提取物的生产方法包括以下步骤：
a.使登录号MTCC-5674的枯草芽孢杆菌亚种shriramensis在30℃下、在振荡培养器里具有pH 6.8的T3培养基中生长60小时；
所述T3培养基的组成如下：胰蛋白胨0.32％(w/v)、胰蛋白示0.24％(w/v)、酵母提取物0.18％(w/v)、NaH2PO4.H2O0.044 M、Na2HPO40.062 M、MnCl2.4H2O0.0005％(w/v)，将上述组分溶于蒸馏水中；
b.回收具有抗真菌活性的提取物。
3.如权利要求1所述的细菌的纯培养物。
4.如权利要求2所述的提取物，其中所述枯草芽孢杆菌亚种shriramensis在有氧条件下生长。
5.如权利要求2所述的提取物，其中生产方法可选地包括使用常规方法浓缩所述提取物。
6.一种包含如权利要求1所述的细菌的组合物，其中所述组合物在细菌浓度为5×105cfu/ml至5×107cfu/ml之间具有抗真菌和促进植物生长的活性。
7.一种包含如权利要求2所述的提取物的组合物，其中所述组合物在所述提取物浓度为4μg/μl至20μg/μl之间具有抗真菌活性。
8.一种包含权利要求1所述的细菌和权利要求2所述的提取物的组合物，其中所述组合物具有抗真菌和促进植物生长的活性。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，可选地包含一种或多种抗真菌剂和植物生长促进剂。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，可选地包含农业上可接受的载体。
11.一种抑制植物病原真菌生长的方法，其中所述方法包括使所述植物病原真菌与有效量的5×105cfu/ml至5×107cfu/ml的如权利要求1所述的细菌或根据前述任一项权利要求中所述的组合物接触，所述植物病原真菌为尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、鞘腐败病菌、炭疽菌、玉米大斑病菌、球孢菌或草酸青霉菌。
12.如权利要求1或2所述的细菌或提取物制备用于抑制植物病原真菌生长的抗真菌和植物生长促进的组合物的应用，所述植物病原真菌为尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、鞘腐败病菌、炭疽菌、玉米大斑病菌、球孢菌或草酸青霉菌。
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Legal Events
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 2nd floor, West Wing, World Tower 1, New Delhi, India Applicant after: DCM SHRIRAM Ltd. Address before: Yin Duxindeli Applicant before: DCM SHRIRAM Ltd. |
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| GR01 | Patent grant | ||
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