CN109022318B - 枯草芽孢杆菌l1及其在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌L1及其在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素的应用，所述应用是将枯草芽孢杆菌L1经发酵培养获得的发酵液接种至林可霉素菌渣中，于25～37℃、80~220rpm培养，实现菌渣中林可霉素的降解。本发明枯草芽孢杆菌L1降解林可霉素菌渣中残留的林可霉素，在六天之内降解林可霉素降解率达到95.39%；降解抗生素的微生物也可用于自来水或土壤中抗生素的降解。

Description

枯草芽孢杆菌L1及其在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素的 应用

技术领域

本发明涉及一种无害化处理林可霉素发酵菌渣中林可霉素的菌株及方法，属于环境保护领域。

背景技术

我国是抗生素生产大国，主要种类抗生素年产超过14万吨，抗生素生产过程中产生的固体废弃物(菌丝体和蛋白质)即抗生素菌渣，每年产量超过140万吨。

抗生素菌渣是发酵生产抗生素的过程中产生的固体发酵废弃物，其主要成分是抗生素产生菌的菌丝体、未利用完的培养基、发酵过程中产生的代谢产物、培养基的降解物以及少量的抗生素等，是一种特殊的危险废物，如处置不当，会对生态环境以及人体健康产生潜在的危害，其危害具有隐蔽性、滞后性、累计性、协同性和连带性等特点。

抗生素菌渣中由于有少量残留的抗生素及其降解物，对生态环境存在着潜在的危害性。环境生态系统是由不同种属的生物群类以食物链的形式组成。畜禽等食品动物长期低剂量摄入抗生素，会导致畜禽对抗生素产生耐药性，同时，抗生素在动物体内蓄积，导致动物食品肉、蛋、奶及内脏中产生抗生素残留。动物食品中的抗生素沿食物链传递到人，一方面会引起人群过敏反应，严重时引起人群食物中毒；部分药物还有致癌、致畸、致突变等作用，严重干扰人类各项生理功能。另一方面，含有抗生素的动物食品会对人体肠道内正常菌群产生不良影响，破坏肠道内生态区系平衡，使致病菌大量繁殖；还会将动物中耐药菌传递给人类，威胁人类健康。同时由于菌渣有机质含量较高，可引起二次发酵，颜色变黑，产生恶臭味，严重影响环境，

抗生素菌渣已被国际社会视为抗生素生产的主要公害之一，这也是世界上一些发达国家将抗生素原料药生产转入第三世界国家的主要原因。

目前对抗生素菌渣的处理处置技术包括焚烧、肥料化（堆肥）、饲料化（被禁止）、填埋、能源化（厌氧发酵产沼气）及其他处理处置技术。菌渣的主要组成是水分，其干燥需要消耗大量的能量，且菌渣的热值不高；很多抗生素菌渣含有较多的硫和氮等元素，在燃烧时增加了锅炉的脱硫负担和氮氧化合物的污染。可能存在的抗生素残留问题致使肥料化不被大众接受。由于土地紧缺，填埋不是长久之计。抗生素菌渣成分的复杂性增加了其固体发酵的难度；菌渣中残留的抗生素抑制发酵用微生物的生长；菌渣腐化快，固体发酵时间较长，发酵过程中臭味严重，产生二次污染。把菌渣用作发酵氮源是另一个资源化的思路。

菌渣中残留的抗生素会抑制微生物的生长，因此，将此降解掉有利于其后续应用。关于林可霉素降解的报道有两篇：一株梭菌经与菌渣共培养10天，对于100 mg L 1林可霉素降解率为62.03%，而如果初始浓度为500 mg L 1，降解率只有15.61%；一株白地霉与菌渣共培养10天后，对林可霉素的降解率为37 %。

发明内容

本发明提供了一种林可霉素降解菌新菌株--枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）L1，该菌株能够降解抗生素菌渣中林可霉素。

本发明具体的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一株新菌株--枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）L1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2018年4月8日，保藏编号CGMCC No.15560，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

第二方面，本发明提供一种所述枯草芽孢杆菌L1在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素中的应用，所述应用是将枯草芽孢杆菌L1经发酵培养获得的发酵液接种至林可霉素菌渣中，于25～37℃（优选35℃），实现菌渣中林可霉素的降解。

所述发酵液制备方法为：将枯草芽孢杆菌L1接种至发酵培养基，在25～37℃、150~200 r/min培养至OD600为0.6~2.5（优选37℃、200 r/min培养至OD600为2.5），获得发酵液；所述发酵培养基质量浓度组成为：麦芽糖 0.2％～5 %，蛋白胨 0.2％～5 %，溶剂为去离子水，pH 5.0-9.0。优选所述YEPD培养基质量终浓度组成为：麦芽糖 2%，蛋白胨 2%，溶剂为蒸馏水，初始pH8.0。

进一步，所述枯草芽孢杆菌L1在接种前先进行斜面活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度2~10%（优选10%）的接种量接种至斜面培养基，所述斜面活化方法为：将枯草芽孢杆菌L1接种至斜面培养基，20～37℃培养12～72 h（优选37℃培养24 h），获得斜面菌体；所述斜面培养基（即普通肉汤琼脂培养基）质量终浓度组成为葡萄糖0.5～2%、蛋白胨0.5～2%、牛肉膏0.1～2%、氯化钠0.5～2%、琼脂2%，溶剂为蒸馏水，pH值6.0～7.5；优选斜面培养基终浓度组成为葡萄糖 0.5%，蛋白胨 1%，牛肉膏 0.1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，溶剂为蒸馏水，pH值7.3～7.4；所述种子扩大培养方法为：将斜面菌体接种至种子培养基，在20～37℃、80～220 r/min培养12～72 h（优选37℃、200 r/min，12h），获得种子液；所述种子培养基（即普通肉汤培养基）终浓度组成为：葡萄糖0.5～2%、蛋白胨0.5～2%、牛肉膏0.5～2%、氯化钠0.5～2%、溶剂为蒸馏水，pH值6.0～7.5，优选种子培养基终浓度组成为：葡萄糖 0.5%，蛋白胨 1%，牛肉膏 0.1%，NaCl 0.5%，溶剂为蒸馏水，pH值7.3～7.4。

进一步，所述菌渣中林可霉素含量为5~20 mg/g，本发明所述林可霉素菌渣主要来自河南天方药业有限公司，是由林可霉素发酵液压滤后产生的固体废物。

进一步，发酵液加入量以菌渣重量计为0.2~2 mL/g（优选0.5 mL/g）。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明提供了一种降解林可霉素降解的新菌株--枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）L1，及利用该菌株降解林可霉素菌渣中残留的林可霉素，在六天之内降解林可霉素降解率达到 95.39%；降解抗生素的微生物也可用于自来水或土壤中抗生素的降解。

附图说明

图1 不同菌株显微镜观察结果。a，b, c, d分别为为菌株L1、L2、L3、L4放大1000倍的显微镜局部放大照片；e、f、g、h分别为菌株L1、L2、L3、L4放大1000倍的显微镜全景照片。

图2降解抗生素菌株的生长曲线。

图3不同菌株降解抗生素的趋势图，a林可霉素含量变化，b降解率变化趋势。

具体实施方式

为对本发明进行更好地说明，特举实施例如下，但本发明的保护范围不限于此。

普通肉汤培养基质量终浓度组成：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.1%、氯化钠0.5%，溶剂为去离子水，pH值7.3～7.4。

普通肉汤琼脂培养基质量终浓度组成：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.1%、氯化钠0.5%，琼脂2%、溶剂为去离子水，pH值7.3～7.4。

YEPD(一)培养基质量终浓度组成：葡萄糖2%、酵母膏1%、蛋白胨2%，溶剂为去离子水，pH自然。

YEPD(二) 培养基质量终浓度组成：葡萄糖2%、蛋白胨2%，溶剂为去离子水，pH自然。

实施例1菌种的筛选及鉴定

1、菌株筛选

肉汤琼脂培养基质量终浓度组成：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化钠0.5%，琼脂 2％，溶剂为水，pH值7.4。

将从河南天方药业污水处理厂的好氧池里取得的污水稀释不同倍数（分别为2.5倍、25倍、250倍、2500倍和25000倍），并加入林可霉素，使每个稀释度污水中林可霉素终浓度分别为0.6 g/L和6g/L，配制成一系列的污水林可霉素混合物。

在每个培养皿中趁热倒入20 mL肉汤琼脂培养基，制成平板。然后将上述污水林可霉素混合物涂布到平板上。于37℃培养12 h，根据菌落形态，筛选出四种菌株，分别记为菌株L1、菌株L2、菌株L3、菌株L4。

2、菌株鉴定

1）菌落特征

菌株 L1的菌落表现为：白色，边缘不规则的圆形，内部湿润，有一定粘度。

菌株L2的菌落表现为：白色，边缘不规则的圆形，中心环形向内凹陷，较 L1干燥。

菌株 L3的菌落表现为：白色，不规则形，中间向四周逐渐变薄，内部粘稠。

菌株 L4的菌落表现为：鲜红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。

根据菌落特征的显微镜观察结果判断L1～L3为细菌，L4为酵母菌。

2）分子特征

a、菌株L1～L3的鉴定方法

（1）水煮法提取细菌的 DNA

用接种针挑取斜面保存或者普通肉汤培养平板上的单菌落，接种到灭过菌的普通肉汤培养基中，设置恒温摇床温度为37℃，转速 200 r/min，在此条件下发酵培养 12 h；取生长好的适当浓度（OD值：1.3～2.0）的菌株发酵液200 μL置于1.5 mL离心管，室温条件下以13000 r/min的转速离心2 min；离心好的菌液弃去上清，加 200 μL pH 8.5的1×TE，在室温条件下，再次以 13000 r/min的转速离心2 min；再次弃去上清，加入pH 8.5的1×TE100μL，在水浴锅中100℃煮10 min，水浴结束后立即取出于冰上放置 2 min室温条件下再次以13000 r/min的转速离心2 min。吸取离心好的上清 60 μL于干净的1.5 mL的EP管中作为PCR检测模板，放置于4℃冰箱内备存。

（2）PCR扩增及电泳检测

利用 16S rDNA序列通用引物27F（5-ACAGTTTCATCCTGCGTCAG-3）和1429R（5-GCTTACGTTGTTAGGACTT-3）扩增片段长度约 1400 bp。

配制PCR检测体系20 μL：上下游引物各 0.5 μL，提取的 DNA模板0.5 μL，灭过菌的超纯水8.5 μL，最后加入 2×Ex Tap酶10 μL，检测体系完成。

PCR扩增程序的运行参数：

(94℃，5 min) + { (94℃, 30 s) + (55℃, 30 s) + (72℃, 1 min) } ×30 +(72℃, 7 min)。

扩增后的 PCR产物的电泳检测：扩增结束的PCR产物，使用 1 × TE作为电泳的缓冲液，采用 1 %琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为：电压 150 V，时间20 min，电泳结束后拍照，利用特定分析软件进行分析，将 PCR原液（不少于 10 μL）送杭州金唯智公司进行测序。

b、菌株L4的鉴定

（1）菌丝体的制备

将纯化后的菌体接种于普通肉汤培养基中，28℃培养36～48 h小时。待菌丝体生长至直径 4 mm以上(比绿豆大一些比一般黄豆小一些)时最佳。

（2）菌丝体的分离与保存

将制备好的菌丝体移入 10 mL离心管中，-20℃冷冻保存24 h。具体操作方法如下：取 5 mL移液枪头，用剪刀将枪头前端6 mm处（确保能吸入菌丝体且不外漏）剪掉，用此枪头吸取菌液向离心管中转移。将装有菌液的离心管放入离心机中 5000 r/min离心20min，弃上清液。至于菌液的加入量，保证离心后菌丝体高度在离心管 1 mL刻度线附近即可。若一次离心后发现菌丝体量不足，可向弃去上清液的离心管中再次加入菌液再次离心，直到菌丝体足够多为止。

（3）超声法提取DNA

取出盛有冷冻菌丝体的离心管，加入 5 mL无菌水待解冻（可以加热一下，不要超过 40℃）后摇匀，放入超声仪中超声震荡10 min。震荡完成后 5000 r/min离心 10 min，弃上清液，加入氯化苄提取缓冲液 (pH=9.0) 3 mL，20% SDS溶液0.4 mL，氯化苄原液 2.4mL。充分震荡摇匀，50℃水浴1～2 h，每隔 10 min摇匀一次，待菌丝体完全溶解（水浴 1 h后观察菌丝体溶解状态，若溶解状态和水浴前区别不大可以提高温度至 60℃再水浴1 h）。加入0.1 M乙酸钠溶液(pH=5.2) 2.4 mL，冰浴 15 min。冰浴后 5000 r/min离心15 min。取上清液 4 mL至新的离心管中，加入异丙醇 4 mL，小心混匀后室温沉淀 20 min后 5000 r/min离心10 min。弃上清液，用 80%乙醇洗涤沉淀两次，在超净台中将乙醇吹干（要保持沉淀的湿润）。加入 300 μL 1×TE重溶DNA沉淀，溶解时摇匀要轻，至此 DNA粗提完成。

取 200 μL粗提DNA于1.5 mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，轻轻上下颠倒 30次，使用制冷离心机，18℃条件下12000 r/min离心5 min，取上清液100 μL于新的1.5 mL离心管中。至此真菌DNA提取完成。

（4）PCR扩增及电泳检测

采用 18S rRNA通用模板 NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’）和NS2（5’-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3’）对真菌的 DNA进行扩增。

PCR扩增体系20 μL：上下游引物各 0.5 μL，提取的 DNA模板 0.5 μL（10～100ng/μL），灭过菌的超纯水8.5 μL，最后加入 2×Ex Tap酶10 μL。

PCR扩增程序的运行参数：PCR扩增程序的运行参数：

(94℃，5 min) + { (94℃, 30 s) + (55℃, 30 s) + (72℃, 1 min) } ×30 +(72℃, 7 min)。

扩增后的 PCR产物的电泳检测：扩增结束的PCR产物，使用 1 × TE作为电泳的缓冲液，采用 1 %琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为：电压 150 V，时间20 min，电泳结束后拍照，利用特定分析软件进行分析。将 PCR原液（不少于10 μL）送杭州金唯智公司进行测序。

经16 sRNA鉴定，菌株 L1（16 sRNA核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示）和L2（16 sRNA核苷酸序列见SEQ ID NO.2所示）均为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；菌株 L3（16sRNA核苷酸序列见SEQ ID NO.3所示）为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；菌株 L4（16 sRNA核苷酸序列见SEQ ID NO.4所示）为粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。

实施例2 菌种培养

将实施例1所筛选出的菌株L1-菌株L4分别接入普通肉汤琼脂培养基中，于37℃培养24 h得到斜面培养，以备后用；将斜面种子接种于普通肉汤培养中，于37℃、200 r/min培养12 h得到种子。将种子按10％（v/v）接种于普通肉汤培养基中于37℃、200 r/min培养并定时取样，在显微镜下观察菌种的增殖情况并测定600 nm的吸光度，生长曲线见图2。从图中可以看出，这几个菌株的对数期在不同的时间出现，L1为4~12 h，L2为4~10 h，L3为6~12h，L4为20~28 h。

实施例3林可霉素标准曲线的建立

固定相：液相色谱用十八烷基硅烷键合硅胶（5 µm）柱，4.6 mm×200 mm，流动相：0.05 M的硼砂溶液（用85%的磷酸溶液调节pH值至6.1）和甲醇混合（体积比为42:58），流速：1 mL/min。柱温：30℃，检测器：紫外检测器，检测波长：214 nm。

在上述条件下，在 0～8.0 mg/mL范围内林可霉素标准品水溶液浓度（x）与紫外吸收（峰面积，y）成线性关系，线性回归方程是y = 1.1013x –0.0203，R²= 0.9997。

实施例4菌种降解抗生素试验

菌渣取自河南天方药业有限公司，是由林可霉素发酵液压滤后产生的固体废物，林可霉素含量为16.77 mg/g。

称取10 g林可霉素菌渣于培养皿中，高温灭菌，然后进行以下试验以验证试验菌种降解林可霉素的能力：

a）将5 mL按实施例2方法培养至稳定期的菌液(OD600值1.262)接入菌渣中；

b）将5 mL用无菌水稀释5倍的实施例2方法培养至稳定期菌液接入菌渣中；

c）将5 mL无菌水接入菌渣中。

分别放入培养箱中在37℃下培养。

在培养不同时间后取样，溶于10倍体积的甲醇中摇匀，过滤，用实施例3所述高效液相测定其抗生素的峰面积。将所得峰面积的数据代入实施例3林可霉素标准曲线的公式中计算出林可霉素的浓度。发现所筛菌种对菌渣中残留的抗生素有很好的降解作用，见图3中a和b。其中菌株L1效果最好，将其送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No.15560。

实施例5菌株L1培养基和培养条件优化

将菌株L1分别接种至YEPD(一)培养基、YEPD(二)培养基和普通肉汤培养基中，37℃培养11 h（对数期内）后，OD600分别为0.712，1.264和0.864，说明在YEPD(二)培养基中生长最快。在YEPD(二)培养基的基础上每次改变一个因素，培养11 h取样测600 nm的吸光度，依次对碳源种类及氮源种类，培养基初始pH、培养温度、装液量及转速进行优化。

(一)发酵培养基的优化：

(1) 碳源的选择

固定 YEPD(二)培养基的其他成分（蛋白胨 2%），只改变不同的碳源，37℃培养11h（对数期内）后，测定OD600。

表1 碳源的影响

碳源	淀粉	蔗糖	糊精	麦芽糖	葡萄糖
						OD600	0.726	1.035	1.464	1.772	1.264

L1用麦芽糖作为碳源时，生长状况最好。

(2)氮源的选择

固定YEPD(二)培养基的其他成分（麦芽糖2%），只改变氮源，37℃培养11 h（对数期内）后，测定OD600。

表2 氮源的影响

氮源	尿素	酵母粉	玉米粉	蛋白胨
					OD600	0.0054	0.791	0.856	1.964

用蛋白胨作为氮源时，长势最好。

(3)pH的选择

在优化的培养基（麦芽糖2%、蛋白胨2%）基础上，分别调节培养基 pH至5.0~8.0，37℃培养11 h（对数期内）后，测定OD600，结果如表3所示：

表3 pH影响

pH	5.0	6.0	7.0	8.0
					OD600	1.218	1.227	1.419	2.162

由表中结果可知，L1最适pH值为8.0，生长条件偏碱性；

(4)温度的选择

在优选的培养基（麦芽糖2%，蛋白胨 2%，pH 8.0）基础上，分别设置不同温度对菌株培养11 h（对数期内）后测定OD600，结果如表4所示。

表4 温度的影响

温度/℃	25	30	35	37
					OD600	1.239	1.218	2.208	1.264

由表中结果可知：最佳培养温度为35℃。

（5）装液量的选择在上述优选的培养基（麦芽糖 2%，蛋白胨 2%，溶剂为去离子，pH8.0）的基础上，35℃。改变容器中各菌液的装液量，考察培养11h后不同装液量对菌株生长浓度的影响，结果如表5所示：

表5 装液量的影响

装液量（%）	10	20	30	40
					OD600	2.455	1.664	1.596	1.506

如表5所示，装液量均为10%时生长情况较好。

（6）转速的选择

在上述优选的培养基（麦芽糖 2%，蛋白胨 2%，溶剂为去离子水，pH 8.0，35℃，装液量 10%）的基础上。考察不同转速对菌株生长情况的影响，结果如表6所示：

表6 转速的影响

转速/r/min	150	180	200
				OD600	1.263	1.420	2.472

结果显示，三种菌株的最适转速均为 200 r/min。

实施例8在最优条件下培养菌株L1并进行菌渣降解试验

在最优条件（培养基配方：麦芽糖2%，蛋白胨 2%，pH 8.0。于35℃，装液量10％，转速200 r/min）培养24 h，菌液的OD值达到2.5。将5 mL菌液接种于10 g实施例4灭菌林可霉素菌渣（林可霉素含量为16.77 mg/g）中，于37℃培养6天后，林可霉素降解率达到95.39％。

序列表

<110> 河南道地生物科技有限公司

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 1000

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

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ttagagactt ctgtcacctt cggcggctgg ctcctaaaag gttacctcac cgacttcggg 60

tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg 120

cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac gcagtcgagt tgcagactgc 180

gatccgaact gagaacagat ttgtgggatt ggcttaacct cgcggtttcg ctgccctttg 240

ttctgtccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca 300

tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaccttag agtgcccaac tgaatgctgg 360

caactaagat caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc 420

tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag gggacgtcct atctctagga 480

ttgtcagagg atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg 540

ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc 600

cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact 660

tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc 720

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atccgaactg agaacagatt tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgt 240

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tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg 120

cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccagcttcac gcagtcaagt tgcaaactgc 180

gatccgaact gaaaacagat ttgtgggatt ggtttatcct cgcggtttcc ctgccctttg 240

ttctgtccat tgtaccacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca 300

tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaccttaa agtgcccaac tgaatgctgg 360

caactaagat caagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc 420

tgacgacaac catgcaccac ctgtcactct gcccccgaag gggacgtcct atctctagga 480

ttgtcagagg atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg 540

ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc 600

cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctgc agaactaagg ggcggaaacc ccctaacact 660

tagcactcat cgtttacggc gtgaactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc 720

tttcgctcct cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca 780

catctctaca catttcaccg ctacacgtga aattccactc tcctcttctg cactcaagct 840

gccccagttt caatgactct ccccggttag agccgggggc tttcacatca gacttaagaa 900

ccgccgtgcg agcctttacg cccaatattt ccaggacacg ctggccactc tacgatatta 960

ccgcggctgc tggcacgata g 981

<210> 4

<211> 597

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 4

gggcatcctg aggaggacgt ccacttaact tggagtccga actctcactt tctaaccctg 60

tgcacttgtt tgggatagta actctcgcaa gagagcgaac tcctattcac ttataaacac 120

aaagtctatg aatgtattaa attttataac aaaataaaac tttcaacaac ggatctcttg 180

gctctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca 240

gtgaatcatc gaatctttga acgcaccttg cgctccatgg tattccgtgg agcatgcctg 300

tttgagtgtc atgaatactt caaccctcct ctttcttaat gattgaagag gtgtttggtt 360

tctgagcgct gctggccttt acggtctagc tcgttcgtaa tgcattagca tccgcaatcg 420

aacttcggat tgacttggcg taatagacta ttcgctgagg aattctagtc ttcggactag 480

agccgggttg ggttaaagga agcttctaat cagaatgtct acattttaag attagatctc 540

aaatcaggta ggactacccg ctgaacttaa gcatatcaaa gcggggaaag ggaaagc 597

Claims (7)

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）L1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2018年4月8日，保藏编号CGMCC No.15560，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

2.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌L1在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用是将枯草芽孢杆菌L1经发酵培养获得的发酵液接种至林可霉素菌渣中，于25～37℃培养，实现菌渣中林可霉素的降解。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液制备方法为：将枯草芽孢杆菌L1接种至发酵培养基，在25～37℃、150~200 r/min培养至OD600为0.6~2.5，获得发酵液；所述发酵培养基质量浓度组成为：麦芽糖 0.2％～5 %，蛋白胨 0.2％～5 %，溶剂为去离子水，pH5.0～9.0。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述枯草芽孢杆菌L1在接种前先进行斜面活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度2~10%的接种量接种至发酵培养基，所述斜面活化方法为：将枯草芽孢杆菌L1接种至斜面培养基，20～37℃培养12～72 h，获得斜面菌体；所述斜面培养基质量终浓度组成为：葡萄糖0.5～2%、蛋白胨0.5～2%、牛肉膏0.1～2%、氯化钠0.5～2%、琼脂2%，溶剂为蒸馏水，pH值6.0～7.5；所述种子扩大培养方法为：将斜面菌体接种至种子培养基，在20～37℃、80～220 r/min培养12～72 h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖0.5～2%、蛋白胨0.5～2%、牛肉膏0.5～2%、氯化钠0.5～2%、溶剂为蒸馏水，pH值6.0～7.5。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述菌渣中林可霉素含量为5~20 mg/g。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液加入量以菌渣重量计为0.2~2 mL/g。

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