CN113862169A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在羽毛降解中的应用 - Google Patents

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在羽毛降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了贝莱斯芽孢杆菌NLG1及其在降解羽毛中的应用。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌NLG1，已于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCC No.20920。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌NLG1，培养方法简单、生长速度快、能高效降解羽毛、安全性高。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌NLG1可应用于如下方面：(1)由于其具有较强的羽毛降解能力，可用于羽毛废弃固形物的处理；(2)由于其可显著提高羽毛中可溶蛋白含量，可用于发酵羽毛粉，发酵羽毛粉可用于发酵饲料的制备。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在羽毛降解中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌，以及该贝莱斯芽孢杆菌在羽毛降解方面的应用。
背景技术
羽毛是禽类养殖中常见且数量巨大的废弃物。据统计，我国年屠宰鸡只一百亿只，按羽毛约占禽体重总量的5％～7％计，每年能产生至少一百万吨羽毛。家禽羽毛由角蛋白为主的蛋白质组成，其蛋白质含量通常在90％以上。角蛋白由半胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸等18种氨基酸通过交联作用形成，其二级结构具有较强的抗张性和较小的延展性，因此角蛋白很难被动物消化利用或者消化利用率极低。高蛋白含量的羽毛没有被合理利用是一种资源的浪费，而堆积在环境中由于其降解速度过慢，造成了环境污染。所以，羽毛开发利用不仅能缓解蛋白资源短缺问题，还能解决养殖业固废污染难题，实现养殖中废弃物循环利用、降低饲料成本，从而提高家禽养殖效益。
研究表明，角蛋白是羽毛中的主要抗营养因子，动物饲料中添加羽毛生粉超过动物承受范围会造成动物消化利用率低、生长性能下降等危害。而传统的羽毛饲用加工措施大都采用物理法、化学法，虽然也能在一定程度上对羽毛产生降解作用，但成本较高且会对环境造成二次污染。微生物发酵法可利用特定微生物的复杂酶系对羽毛进行降解，从而克服理化处理方法的诸多缺陷，具有较大的开发价值和较好的应用前景。
国内外大量的实验研究表明大多数可产生角蛋白酶的细菌是芽孢杆菌，包含了地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，嗜热、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，Bacillis pseudofirmus FA30-01，Bacillis pseudofirmus AL-8等(徐子龙等，角蛋白降解的研究现状及应用，生物化工，3(4):77-83，2017)。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，在农业生产上有促进植物生长和抵御病原微生物作用，具有广谱抗菌活性，是开发生物药剂潜力较大的微生物。西班牙科学家Ruiz-García等从西班牙南部马拉加贝莱斯河采集的苦咸水样品中分离得到两株能够大量合成脂肽类物质并能产生抗菌活性的细菌，将其命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并于2005年在International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology上合格发表。
迄今为止的研究中，对于贝莱斯芽孢杆菌降解羽毛或者降解角蛋白，未见任何相关记载。
发明内容
本发明提供一株具有羽毛降解能力和生产可溶性蛋白能力的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NLG1，用来高效降解羽毛和生产羽毛可溶性蛋白，提高羽毛降解效率。
本发明提供贝莱斯芽孢杆菌NLG1。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌NLG1于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.20920。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NLG1 CGMCC No.20920，简称贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NLG1。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌NLG1在羽毛降解中的应用。在本发明中，羽毛是指普通禽类羽毛，包括但不限于鸡羽毛、鸭羽毛、鹅羽毛。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌NLG1的培养物。
在本发明中，贝莱斯芽孢杆菌NLG1的培养物可以是贝莱斯芽孢杆菌NLG1的菌悬液。在本发明中，菌悬液具体可通过用无菌生理盐水重悬菌体得到。
本发明还提供一种产品，该产品包含贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液。该产品的功能如下：(a)降解羽毛；(b)降解羽毛角蛋白；(c)生产可溶性蛋白；和/或(d)生产蛋白酶。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液的应用，该应用如下：(a)降解羽毛；(b)降解羽毛角蛋白；(c)生产可溶性蛋白；和/或(d)生产蛋白酶。本发明的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液可以用于饲料制备和/或羽毛废弃物的垃圾处理回收再利用。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液在羽毛降解中的应用。在本发明中，羽毛降解具体可为降解羽毛中的主要抗营养因子角蛋白。在本发明的羽毛降解的应用中，降解温度可以是25℃～29℃。在本发明的羽毛降解的应用中，pH可以是7.0～10.0。
本发明还提供贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液在提高羽毛可溶性蛋白含量和提高蛋白酶活性中的应用。
本发明还提供一种降解羽毛的方法，包括如下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液在一定的反应条件下对羽毛进行发酵处理，实现羽毛的降解。
本发明还提供一种降解羽毛角蛋白的方法，包括如下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液在一定的反应条件下对羽毛进行发酵处理，实现羽毛蛋白的降解，提升羽毛失重率。
本发明还提供一种提高羽毛粉可溶性蛋白含量的方法，包括如下步骤：将贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液在一定的反应条件下对羽毛进行发酵处理，实现羽毛粉可溶性蛋白含量的提高。
本发明还提供使用贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液对羽毛进行发酵处理后的产物。
本发明还提供使用贝莱斯芽孢杆菌NLG1、其培养物或其菌悬液对羽毛进行发酵处理后的产物在饲料制备中的应用。
具体而言，本发明如下。
1.贝莱斯芽孢杆菌NLG1，所述菌的菌种已于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCC No.20920。
2.根据项1所述贝莱斯芽孢杆菌NLG1的培养物。
3.根据项2所述贝莱斯芽孢杆菌NLG1的培养物，所述培养物为菌悬液。
4.一种产品，所述产品包含项1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、项2所述的培养物或项3所述的菌悬液。
5.项1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、项2所述的培养物或项3所述的菌悬液的应用，所述应用为：(a)降解羽毛；(b)降解羽毛角蛋白；(c)生产可溶性蛋白；和/或(d)生产蛋白酶。
6.一种降解羽毛的方法，包括如下步骤：将项1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、项2所述的培养物或项3所述的菌悬液与羽毛粉混合发酵。
7.根据项6所述的方法，其特征在于，发酵条件如下：发酵培养基为羽毛粉浓度(m/v)1％～3％，初始pH为7～10，接种量为2％～4％(v/v)，发酵培养温度为25℃～29℃。
8.一种降解羽毛角蛋白的方法，包括如下步骤：将项1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、项2所述的培养物或项3所述的菌悬液与羽毛粉混合发酵。
9.根据项8所述的方法，其特征在于，发酵条件如下：发酵培养基为羽毛粉浓度(m/v)1％～3％，初始pH为7～10，接种量为2％～4％(v/v)，发酵培养温度为25℃～29℃。
10.一种提高羽毛粉可溶性蛋白含量的方法，包括如下步骤：将项1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、项2所述的培养物或项3所述的菌悬液与羽毛粉混合发酵。
11.根据项10所述的方法，其特征在于，发酵条件如下：发酵培养基为羽毛粉浓度(m/v)1％～3％，初始pH为7～10，接种量为2％～4％(v/v)，发酵培养温度为25℃～29℃。
12.使用权利要求6至11中任一项所述的方法生成的产品。
13.项12所述的产品在饲料制备中的应用。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌NLG1，培养方法简单、生长速度快、能高效降解羽毛、安全性高。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌NLG1可应用于以下方面：(1)由于其具有较强的羽毛降解能力，可用于羽毛废弃固形物的处理；(2)由于其可显著提高羽毛中可溶性蛋白含量，可用于发酵羽毛粉，发酵羽毛粉可用于发酵饲料的制备。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌NLG1的菌落图片。
图2为贝莱斯芽孢杆菌NLG1的显微镜图片(×100)。
图3为贝莱斯芽孢杆菌NLG1生长曲线。
图4表示温度对贝莱斯芽孢杆菌NLG1降解羽毛的影响。
图5表示初始pH对贝莱斯芽孢杆菌NLG1降解羽毛的影响。
图6表示底物浓度对贝莱斯芽孢杆菌NLG1降解羽毛的影响。
图7表示接种量对贝莱斯芽孢杆菌NLG1降解羽毛的影响。
图8表示外加碳源对贝莱斯芽孢杆菌NLG1降解羽毛的影响。
图9表示发酵时间对贝莱斯芽孢杆菌NLG1降解羽毛生产可溶性蛋白的影响。
图10表示发酵时间对贝莱斯芽孢杆菌NLG1降解羽毛失重率的影响。
贝莱斯芽孢杆菌NLG1(Bacillus velezensis NLG1)，保藏登记号为CGMCCNo.20920，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏时间为2020年10月20日。
具体实施方式
本发明提供以下的实施例以便于更好地理解本发明，但是，本发明提供的实施例仅用于说明本发明而不是对本发明进行限定。在不违背本发明构思的情况下，对本发明做出的任何改变和变形、任何等同替代，都在本发明的保护范围之中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，用于制备各个培养基的水均为去离子水。以下实施例中，使用OD600nm值表征菌体生长量。以下实施例中，如无特殊说明，所用羽毛生粉均为北京市昌平南口中试基地采集新鲜鸡羽毛，清洗、粉碎、过筛制得。
本发明使用的培养基如下：
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，121℃灭菌20min。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，琼脂粉15，121℃灭菌20min。
酪蛋白培养基(g/L)：酪蛋白10，牛肉浸粉3，琼脂粉15，NaCl 5，KH2PO4 2，pH 7.0，121℃灭菌20min。
发酵培养基(/L)：羽毛粉1g、营养盐溶液100mL，初始PH为7，121℃灭菌20min。发酵培养基中，羽毛粉为发酵底物。
在上述发酵培养基中，营养盐溶液成分如下：
营养盐溶液(g/L)：NaCl 0.5、K2HPO4 1.4、KH2PO4 0.7、MgSO4 0.1、pH 7.0。
可溶性蛋白含量的测定方法采用考马斯亮蓝(G250)法测定。
羽毛降解失重率的测定方法采用失重法测定，发酵前羽毛称重记为M0，过滤前滤纸称重记为M1，发酵后过滤发酵液，将其残渣与滤纸烘干称重记为M2。计算公式如下：
Figure BDA0002864184130000041
实施例1、贝莱斯芽孢杆菌NLG1的筛选及鉴定
一、贝莱斯芽孢杆菌NLG1的筛选
1、羽毛降解菌的活化、纯化
本发明选取实验室保藏的可用于蛋白质降解的所有菌株进行羽毛降解试验。
将保藏在甘油管的菌株接种在LB液体培养基中放置在37℃摇床180r/min培养24h活化。将活化菌株在LB固体培养基中划线纯化，并置于37℃生化培养箱24h。培养24h后，挑取单一菌落于LB液体培养基中制作种子液。
2、羽毛降解菌的初筛
将取1μL种子液滴在酪蛋白培养基的中央，培养24h后用刻度尺分别测量透明降解圈直径(D)和菌落直径(d)的大小，以D/d的结果为指标，选取比值结果较大的8株菌进行复筛并保藏。
3、羽毛降解菌的复筛
将初筛得到的8株菌接种于发酵培养基，恒温37℃，摇床180r/min培养72h。测定各试验发酵液中羽毛可溶性蛋白含量，选取可溶性蛋白含量高的一株菌NLG1菌株并保藏。
本发明筛选得到的菌株NLG1分离自牛瘤胃液。
二、菌种的鉴定
1、形态观察
将NLG1菌株接种在LB固体培养基平板上，观察菌落形态特征。NLG1菌株的菌落照片见图1，显微镜染色照片见图2。
NLG1菌株在LB琼脂培养基上生长后，单菌落形态接近圆形、浅黄色且不透明。培养初期菌落表面光滑边缘整齐；在培养后期菌落颜色呈白色或灰白色，表面粗糙不规则、有皱褶隆起，边缘不整齐，中间有突起或凹陷，四周云雾状扩散样。在显微镜(×100)下，菌体染色呈紫色，主要生物学特性为革兰氏阳性菌(G+)，杆状或杆状排列。
2、分子生物学鉴定
对NLG1菌株的16S rDNA进行扩增，将纯化后的PCR产物测序，测序结果如序列表序列1所示。
综合形态鉴定、分子生物学鉴定的结果，NLG1菌株属于贝莱斯芽孢杆菌。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NLG1，已于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.20920。在本发明中，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NLG1 CGMCC No.20920，简称贝莱斯芽孢杆菌NLG1。
实施例2、贝莱斯芽孢杆菌NLG1降解羽毛的研究
一、贝莱斯芽孢杆菌NLG1生长曲线
贝莱斯芽孢杆菌NLG1生长曲线测定实验采用LB液体培养基。
将分离得到的贝莱斯芽孢杆菌NLG1平板划线培养，挑取平板上单菌落于10mL液体LB培养基中37℃恒温震荡培养24h制成种子液，并按1％的接种量接种于100mL液体LB培养基中，37℃恒温震荡培养24h，每1h取样一次，在紫外可见分光光度计600nm处测其光密度(OD)值，并绘制OD600nm与时间的关系曲线图。
贝莱斯芽孢杆菌NLG1生长曲线见图3，贝莱斯芽孢杆菌NLG1经过短暂的延滞期，在第3～5h进入对数生长期，在第14h达到最大生长浓度，随后进入衰亡期。因此，在后续培养与发酵试验中均选取培养5h的活化菌液作为种子液。
二、贝莱斯芽孢杆菌NLG1在羽毛降解中的应用
羽毛粉制备：北京昌平南口中试基地采集新鲜鸡羽毛，经除杂、清洗、晾干、粉碎、过筛工序制备的新鲜羽毛生粉，在本发明中简称羽毛粉。
种子液制备：挑取LB固体平板上贝莱斯芽孢杆菌NLG1单菌落于10mL LB液体培养基，于37℃、180r/min培养24h，制备种子液。将种子液以2％(v/v)转接于100mL LB液体培养基中，37℃、180r/min培养5h。培养5h的活菌数约为1.2×107cfu/mL～1.3×107cfu/mL。
菌悬液制备：将接种量所需体积的种子液置于无菌离心管中，4000r/min，离心5min，去除上清液，留沉淀，用无菌生理盐水将沉淀重悬，反复2次以上操作，得到2mL的菌重悬液。
发酵培养基(g/L)：羽毛粉1g、营养盐溶液100mL，初始pH为7，121℃灭菌20min。发酵培养基以羽毛为唯一氮源，羽毛粉底物浓度1％(m/v)，不另加碳源。
在上述发酵培养基中，营养盐溶液成分如下：
营养盐溶液(g/L)：NaCl 0.5、K2HPO4 1.4、KH2PO4 0.7、MgSO4 0.1、pH 7.0。
使用上述发酵培养基基本发酵培养条件如下：
温度37℃，初始pH 7，接种量2％(v/v)，发酵时间72h。
1、贝莱斯芽孢杆菌NLG1对羽毛降解的影响
试验方法
发酵培养基；羽毛粉浓度(m/v)为1％，初始pH为7。
取菌液以2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，于37℃恒温、180r/min、培养72h，设置三个重复。
发酵结束后，以过滤方式分离液体和固形物。取滤液，4℃、5000r/min离心10min，以考马斯亮蓝(G250)法测定滤液可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白标准曲线计算发酵液中可溶性蛋白含量，结果见表1。
表1、贝莱斯芽孢杆菌NLG1对羽毛降解的影响
Figure BDA0002864184130000061
如表1所示，贝莱斯芽孢杆菌NLG1能有效降解羽毛产生可溶性蛋白，可溶性蛋白含量为21.14μg/mL。
2、温度对贝莱斯芽孢杆菌NLG1羽毛降解的影响
试验方法
发酵培养基：羽毛粉浓度(m/v)为1％，初始pH为7。
取种子液以2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，不同温度条件下分别培养。温度分别设置为：25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、41℃、43℃。摇床180r/min培养72h，不另加碳源，设置三个重复。
发酵结束后，以过滤方式分离液体和固形物。取滤液，4℃、5000r/min离心10min，以考马斯亮蓝(G250)法测定滤液可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白标准曲线计算发酵液中可溶性蛋白含量，结果见图4。图4中，折线上数据点的上方以字母表示差异程度，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
如图4所示，贝莱斯芽孢杆菌NLG1有效降解羽毛的最适温度为27℃。
3、初始pH对贝莱斯芽孢杆菌NLG1羽毛降解的影响
试验方法
发酵培养基：羽毛粉浓度(m/v)为1％，不另加碳源。
取种子液以2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，不同初始pH条件下分别培养。初始pH分别设置为：5、6、7、8、9、10、11、12。摇床180r/min培养72h，温度为37℃，设置三个重复。
发酵结束后，以过滤方式分离液体和固形物。取滤液，4℃、5000r/min离心10min，以考马斯亮蓝(G250)法测定滤液可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白标准曲线计算发酵液中可溶性蛋白含量，结果见图5。图5中，折线上数据点的上方以字母表示差异程度，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
如图5所示，贝莱斯芽孢杆菌NLG1有效降解羽毛的最适初始pH为10。
4、底物浓度对贝莱斯芽孢杆菌NLG1羽毛降解的影响
试验方法
发酵培养基：羽毛粉浓度(m/v)为1％，不另加碳源，初始pH为7。
取种子液以2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，不同底物浓度条件下分别培养。底物浓度分别设置为：0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％。温度为37℃，摇床180r/min培养72h，设置三个重复。
发酵结束后，以过滤方式分离液体和固形物。取滤液，4℃、5000r/min离心10min，以考马斯亮蓝(G250)法测定滤液可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白标准曲线计算发酵液中可溶性蛋白含量，结果见图6。图6中，折线上数据点的上方以字母表示差异程度，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
如图6所示，贝莱斯芽孢杆菌NLG1有效降解羽毛的最适底物浓度为2.5％。
5、接种量对贝莱斯芽孢杆菌NLG1羽毛降解的影响
试验方法
菌重悬液制作方法如下：将接种量所需体积的种子液置于无菌离心管中，4000r/min，离心5min，去除上清液，留沉淀，用无菌生理盐水将沉淀重悬，反复2次以上操作，得到2mL的菌重悬液。
发酵培养基：羽毛粉浓度(m/v)为1％，不另加碳源，初始pH为7。
取种子液以不同比例的接种量(v/v)制成菌重悬液接种于发酵培养基中，接种量分别设置为：2％、4％、6％、8％、10％。使用不同接种量接种进行发酵培养，温度为37℃，摇床180r/min培养72h，设置三个重复。
发酵结束后，以过滤方式分离液体和固形物。取滤液，4℃、5000r/min离心10min，以考马斯亮蓝(G250)法测定滤液可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白标准曲线计算发酵液中可溶性蛋白含量，结果见图7。图7中，折线上数据点的上方以字母表示差异程度，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
如图7所示，贝莱斯芽孢杆菌NLG1有效降解羽毛的最佳接种量为6％。
6、外加碳源对贝莱斯芽孢杆菌NLG1羽毛降解的影响
试验方法
发酵培养基：羽毛粉浓度(m/v)为1％，初始pH为7，额外在发酵培养基中添加2％碳源，碳源分别为，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或可溶性淀粉。
取种子液以2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，进行发酵培养，温度为37℃，摇床180r/min培养72h，设置三个重复。
发酵结束后，以过滤方式分离液体和固形物。取滤液，4℃、5000r/min离心10min，以考马斯亮蓝(G250)法测定滤液可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白标准曲线计算发酵液中可溶性蛋白含量，结果见图8。图8中，折线上数据点的上方以字母表示差异程度，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
如图8所示，贝莱斯芽孢杆菌NLG1有效降解羽毛的最佳外加碳源为可溶性淀粉。
7、发酵时间对贝莱斯芽孢杆菌NLG1羽毛降解的影响
试验方法
基于温度、初始pH、接种量、底物浓度、外加碳源的最佳条件，在不同时长的发酵时间下培养，发酵时间设置为(h)：0、24、48、72、96、120、144、168。
菌重悬液制作方法如下：将接种量所需体积的种子液置于无菌离心管中，4000r/min，离心5min，去除上清液，留沉淀，用无菌生理盐水将沉淀重悬，反复2次以上操作，得到2mL的菌重悬液。
发酵培养基：羽毛粉浓度(m/v)为2.5％，外加碳源为2％可溶性淀粉，初始pH为10。
取种子液以6％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，进行发酵培养，温度为27℃，摇床180r/min培养，设置三个重复。
发酵结束后，以过滤方式分离液体和固形物。取滤液，4℃、5000r/min离心10min，以考马斯亮蓝(G250)法测定滤液可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白标准曲线计算发酵液中可溶性蛋白含量，结果见图9。图9中，折线上数据点的上方以字母表示差异程度，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
滤纸与固形物烘干称重，以失重法计算失重率。结果见图10。图10中，折线上数据点的上方以字母表示差异程度，不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
如图9、图10所示，贝莱斯芽孢杆菌NLG1有效降解羽毛的最适发酵时间为144h。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在羽毛降解中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1484
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)
<400> 1
tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt 60
gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 120
ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcagac 180
ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 240
aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300
gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360
acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 420
gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag 480
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540
ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 600
gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 660
ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 720
ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 780
ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 840
ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 1020
gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1140
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200
cctgggctac acacgtgcta caatgggcag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1260
ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1320
ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380
caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttagg 1440
agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt cgta 1484

Claims (10)

1.贝莱斯芽孢杆菌NLG1，所述菌的菌种已于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCC No.20920。
2.根据权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌NLG1的培养物。
3.根据权利要求2所述贝莱斯芽孢杆菌NLG1的培养物，所述培养物为菌悬液。
4.一种产品，所述产品包含权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌悬液。
5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌悬液的应用，所述应用为：(a)降解羽毛；(b)降解羽毛角蛋白；(c)生产可溶性蛋白；和/或(d)生产蛋白酶。
6.一种降解羽毛的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌悬液与羽毛粉混合发酵。
7.一种降解羽毛角蛋白的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌悬液与羽毛粉混合发酵。
8.一种提高羽毛粉可溶蛋白含量的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NLG1、权利要求2所述的培养物或权利要求3所述的菌悬液与羽毛粉混合发酵。
9.使用权利要求6至8中任一项所述的方法生成的产品。
10.权利要求9所述的产品在饲料制备中的应用。
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