CN110607261A - 高效降解羽毛的蜡样芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

高效降解羽毛的蜡样芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)FRIL1902，该菌种已于2019年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.17336。本发明还公开了蜡样芽孢杆菌FRIL1902其培养物及其菌悬液，以及它们在降解羽毛中的应用。本发明提供的蜡样芽孢杆菌FRIL1902可应用于以下方面：(1)由于其具有较强的羽毛降解能力，可用于羽毛的发酵；(2)由于其可显著降解羽毛，可用于发酵羽毛饲料的制备；(3)由于该菌株较强的羽毛降解能力，可用于角蛋白酶的科学研究及商业开发。

Description

高效降解羽毛的蜡样芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及蜡样芽孢杆菌、以及蜡样芽孢杆菌在降解羽毛方面的应用。
背景技术
羽毛是家禽养殖业过程中产生的一种副产品，占家禽全部体重的8～10％。一般情况下，羽毛的粗蛋白含量在80％以上，羽毛含有丰富的胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甘氨酸等十几种对动物生长有重要影响的氨基酸。研究表明，羽毛中90％左右的蛋白为角蛋白，这些角蛋白的基本组成是β-角蛋白。β-角蛋白分子中有大量的疏水性氨基酸包裹在角蛋白的最外层，且其蛋白分子结构中的肽链由大量的二硫键和氢键连接起来，形成锁状的空间结构，性质稳定，不易被降解。
我国是养殖业大国，每年羽毛产量有五十万吨左右，但由于羽毛生物学利用率较低，一直以来，羽毛都被作为废弃物随意丢弃，大量废弃的羽毛不仅是一种资源浪费，还给环境带来了巨大的压力。开发废弃羽毛作为动物饲料蛋白原料具有非常重要的意义，目前饲用废弃羽毛在我国畜禽养殖中已经得到了广泛的应用。目前，羽毛加工处理的主要方式包括高温高压水解法、化学水解法、酶解法、膨化法和微生物降解法。研究表明，将蛋鸡日粮中2.5％的豆粕替换成酶解羽毛粉对蛋鸡的采食量、产蛋率、产蛋量、料蛋比没有不良影响；5％的酶解羽毛粉替代鱼粉对仔猪消化率和腹泻率没有不良影响。相对于其他方法，微生物降解法的优势在于成本低、工艺简单、降解效率高，并且对环境的污染及对原料的破坏相对较少，在羽毛饲用品质改良方面具有较高的应用价值。
发明专利申请CN 107868762 A公开了一株蜡样芽孢杆菌具有降解羽毛的能力，在培养蜡样芽孢杆菌96h时的羽毛降解率达到了90％。
尽管一些蜡样芽孢杆菌可以降解羽毛，但是在实际应用中，希望获得具有更强降解羽毛能力的菌种，以提高降解效率、缩短降解时间、提高设备利用率、获得高品质的羽毛降解产品。
发明内容
本发明涉及一株能高效降解羽毛的微生物，在开发羽毛饲用价值方面有较大的应用潜力。
本发明的目的在于提供蜡样芽孢杆菌FRIL1902及其在羽毛降解中的应用。
本发明提供蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)FRIL1902，该菌的菌种已于2019年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.17336。蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)FRIL1902 CGMCC No.17336，简称蜡样芽孢杆菌FRIL1902。
本发明还提供蜡样芽孢杆菌FRIL1902发酵培养的培养物。
本发明还提供蜡样芽孢杆菌FRIL1902发酵培养的培养物的培养方法，包括以下步骤：(1)将菌种接种于LB培养基；(2)在37℃恒温振荡培养。
本发明还提供蜡样芽孢杆菌FRIL1902的菌悬液。
本发明还提供蜡样芽孢杆菌FRIL1902的菌悬液的制备方法，可通过用无菌生理盐水重悬菌体得到。所述菌悬液中的菌浓度具体可为8.0×108cfu/mL～9.0×108cfu/mL。
本发明还提供蜡样芽孢杆菌FRIL1902、其培养物或其菌悬液在降解羽毛中的应用。该应用如下：(a)降解羽毛；和/或(b)产蛋白酶；和/或(c)降解角蛋白。所述羽毛为普通家禽羽毛。具体而言，所述羽毛例如可以是鸡毛、鸭毛、鹅毛等。降解条件为pH 4.5～7.0，具体可为pH 7.0。所述降解羽毛具体可为降解羽毛中的角蛋白。
本发明还提供一种降解羽毛的方法，包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌FRIL1902、其培养物或其菌悬液和羽毛在一定的反应条件下混合，进行发酵处理，实现羽毛的降解。
本发明还提供一种降解羽毛角蛋白的方法，包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌FRIL1902、其培养物或其菌悬液和羽毛在一定的反应条件下混合，进行发酵处理，实现羽毛的降解。
本发明还提供一种改善羽毛营养价值与风味的方法，包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌FRIL1902、其培养物或其菌悬液和羽毛在一定的反应条件下混合，进行发酵处理，实现羽毛的降解。
本发明还提供一种产品，其活性成分为蜡样芽孢杆菌FRIL1902、其培养物或其菌悬液；本发明提供的产品的功能如下：(a)降解羽毛；和/或(b)产蛋白酶；和/或(c)降解角蛋白。所述羽毛为普通家禽羽毛。具体而言，所述羽毛例如可以是鸡毛、鸭毛、鹅毛等。
本发明还提供该产品在饲料中的使用。
具体而言，本发明如下。
1.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)FRIL1902，所述菌的菌种已于2019年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCC No.17336。
2.项1所述蜡样芽孢杆菌FRIL1902发酵培养的培养物。
3.项1所述蜡样芽孢杆菌FRIL1902的菌悬液。
4.项2所述培养物的培养方法，包括以下步骤：1)将所述菌种接种于LB培养基；2)在37℃恒温振荡培养。
5.项3所述菌悬液的制备方法，包括以下步骤：1)挑取蜡样芽孢杆菌FRIL1902单菌落，接种于100mL LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养24～36h，使培养体系中的菌体浓度达到8.0～9.0×108cfu/mL，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次；2)取步骤1)得到的菌体，用无菌生理盐水重悬，得到菌浓度为8.0～9.0×108cfu/mL的菌悬液。
6.蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液在降解羽毛中的应用，所述应用包括：降解羽毛和/或产蛋白酶、降解角蛋白。
7.一种降解羽毛的方法，包括以下步骤：1)将蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的培养基中；2)在37℃条件下振荡培养进行发酵降解。
8.一种降解羽毛大分子蛋白的方法，包括以下步骤：1)将蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的培养基中；2)在37℃条件下振荡培养进行发酵降解。
9.一种改善羽毛营养价值与风味的方法，包括以下步骤：1)将蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的培养基中；2)在37℃条件下振荡培养进行发酵降解。
10.一种产品，其活性成分包括蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液。
11.项10所述的产品在饲料制备中的使用。
本发明提供的蜡样芽孢杆菌FRIL1902，培养方法简单、生长速度快、安全性高。本发明提供的蜡样芽孢杆菌FRIL1902可应用于以下方面：(1)由于其具有较强的羽毛降解能力，可用于羽毛的发酵；(2)由于其可显著降解羽毛，可用于发酵羽毛饲料的制备；(3)由于该菌株较强的羽毛降解能力，可用于角蛋白酶的科学研究和商业开发。
附图说明
图1为蜡样芽孢杆菌FRIL1902的菌落照片。
图2为蜡样芽孢杆菌FRIL1902的电子显微镜照片。
图3为蜡样芽孢杆菌FRIL1902的生长曲线。
图4为蜡样芽孢杆菌FRIL1902降解羽毛的实例。
生物材料保藏信息
蜡样芽孢杆菌FRIL1902(Bacillus cereus FRIL1902)，保藏登记号为CGMCCNo.17336，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏时间为2019年3月15日。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，本发明人给出以下的实施例。然而，以下的实施例仅用于对本发明进行说明，而不能用于对本发明做出任何形式的限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购买自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，用于制备各个培养基的水均为去离子水。以下实施例中用OD600nm值表征菌体生长量。以下实施例，如无特殊说明，所用羽毛均为普通白羽肉鸡羽毛。
实施例1、羽毛降解菌的筛选
酪蛋白培养基(g/L)：酪蛋白15.0，Na2HPO4 2.0、NaCl 5.0、琼脂15.0，121℃灭菌20min。
普通富集培养基(g/L)：葡萄糖10.0、NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0，pH自然，121℃灭菌20min。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，氯化钠10.0，121℃灭菌20min。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，氯化钠10.0，琼脂15.0，121℃灭菌20min。
羽毛富集培养基(g/L)：羽毛10.0、蛋白胨10.0、葡萄糖7.0、酵母浸膏3.5、NH4NO34.0、(NH4)2SO4 12.35、K2HPO4 0.1、KH2PO4 0.7、MgSO4 0.1、NaCl 10.0、pH自然，121℃灭菌20min。
一、样品采集
于中国农业科学院南口中试基地养殖场采集地下的半腐烂羽毛，置于-4℃冰箱中保存备用。
二、菌株分离
称取10g半腐烂羽毛，加入到装有200mL无菌生理盐水的锥形瓶中，于37℃、200r/min充分振荡20min，随后静置30min，取上清液制备菌悬液，用无菌生理盐水将半腐烂羽毛菌悬液梯度稀释，取10-3、10-5、10-6梯度的稀释液各100μL涂布在酪蛋白培养基平板上，于37℃倒置培养36h，进行选择性筛选。挑取17株生长快、菌落大的菌株在普通富集培养基上进行划线、分离、纯化并保存。
三、菌株筛选
将纯化后的17株菌株点种于酪蛋白培养基平板，37℃倒置培养48h后测定水解透明圈的菌落HE值(透明圈直径与菌落直径的比值)，同时将该17株菌株扩大培养后分别接种到于羽毛富集培养基中，于37℃、180r/min条件下摇床发酵48h，取培养液于4℃、10000rpm离心15min后取上清，利用考马斯亮蓝法测定发酵上清液中可溶性蛋白含量。试验结果见表1，选取17株菌中可溶性蛋白含量增加量最高的菌株H8，保存并鉴定。
表1羽毛降解菌筛选结果
四、菌种鉴定
1、形态观察
将筛选到的菌株H8接种在LB固体培养基平板上，观察菌落形态特征。H8菌株的菌落照片见图1，电镜照片见图2。该菌株呈圆形透明菌落，边缘整齐，菌落光滑，在倒置显微镜下观察菌体细胞呈棒状。
2、分子生物学鉴定
对该菌株的16S rDNA进行扩增，将纯化后的PCR产物测序，测序结果如序列表的序列1所示。
综合形态鉴定、分子生物学鉴定的结果，该菌株属于蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，将其命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)FRIL1902。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)FRIL1902，已于2019年03月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏登记号为CGMCC No.17336。
实施例2、蜡样芽孢杆菌FRIL1902生长条件研究
蜡样芽孢杆菌FRIL1902生长曲线
1、培养基
LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母膏5.0、NaCl 10.0，121℃灭菌20min。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母膏5.0、NaCl 10.0、琼脂20.0，121℃灭菌20min。
2、将分离得到的蜡样芽孢杆菌FRIL1902进行平板划线培养，挑取平板上单菌落于10ml液体LB培养基中在37℃恒温培养24h制成种子液，并按1％的接种量接种于150ml液体LB培养基中，37℃恒温振荡培养48h，每3h取样一次，在紫外可见分光光度计600nm处测其光密度(OD)值，并绘制OD600nm与时间的关系曲线图。
生长曲线结果见图3，蜡样芽孢杆菌FRIL1902经过短暂的延滞期，在第3～21h处于对数生长期，在第33h达到最大生长浓度，随后进入衰亡期。因此，在后续培养与发酵试验中均选取培养21h的活化菌液作为种子液。
实施例3、蜡样芽孢杆菌FRIL1902对羽毛降解能力的研究
1、制备培养基与发酵液
(1)制备培养基
摇瓶LB液体培养基(g/L)：NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0，pH自然，121℃灭菌20min。
单根羽毛培养基(g/L)：1根完整白羽肉鸡羽毛、NaCl 0.5、K2HPO4 1.4、KH2PO40.7、MgSO4 0.1，pH自然，121℃灭菌20min。
(2)挑取蜡样芽孢杆菌FRIL1902单菌落，接种于100mL LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养24h，使培养体系中的菌体浓度达到8.0～9.0×108cfu/mL，取培养液于4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。
(3)取步骤(2)得到的菌体，用无菌生理盐水重悬得到菌浓度为8.0～9.0×108cfu/mL的菌悬液。
(4)将0.8ml步骤(3)得到的菌悬液接种至80mL摇瓶LB液体培养基，37℃恒温振荡培养21h，制成发酵液。
2、取步骤1所制发酵液按2％的接种量接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的单根羽毛培养基中，于37℃、180r/min条件下振荡培养进行羽毛降解，每12h观察羽毛降解情况，结果发现，第2天羽毛有明显降解情况，第4天羽毛基本被降解完全。
降解结果见图4。当接种量为2％，37℃、180r/min发酵4天后，羽毛基本被降解完全。蜡样芽孢杆菌FRIL1902以羽毛粉为唯一氮源和碳源，生长代谢过程中同时代谢产生蛋白酶类物质进一步降解羽毛，大分子折叠蛋白转化为更易被动物消化吸收的小分子蛋白，改善羽毛适口性与风味，使其能够更好地被动物消化吸收与利用。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 高效降解羽毛的蜡样芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1005
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
actctgtccc cttaggcggc tggctccaaa ggttacccca ccgacttccg gtggtaccaa 60
ctctcgtggt gggacgggcg gtggggacaa gggccgggaa cgtattcccc gcggcatggt 120
gatccgcgat tactaacgat tccagcttca tggaggggaa ttgcagccta caatccgaac 180
tgaaaacggg tttatgaaat taactccccc tcccggtctt gcagctcttt gtaccgtcca 240
ttggaacacg tgtgtaaccc agggcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300
tcctccggtt tggcaccggc agtcacctta aaatggccaa cttaatgatg gcaactaaaa 360
acaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgaa ctgacgacaa 420
ccatgcacca cctggcactc tggtcccgaa agaaaagccc tatctctaag gttgtcaaaa 480
gaaggcaaga actggtaagg gtcttcccgt tgcttccaat taaaccacat ggtccaccgc 540
ttgggcgggc ccccgtcaat tcctttgaat ttcagccttg cggccggact ccccaggggg 600
aatggttaat gggttaactt caacactaaa gggcggaaac cctctaacac ttaacactca 660
tcgtttacgg ggtggactac caaggtatct aatcctggtt gctccccacg ctttcgcgcc 720
tcaatggcag ttacagacca gaaagtcgcc ttcgccactg gtggtcctcc atatctctac 780
gccatttcac ccgcctacac aatgggaatt ccactttcct ccttctgcac tcaagtctcc 840
caagtttcca atgaccctcc acggatgaag ccgtgggctt tcacatcaga ctaaggaacc 900
acctggcgcg cgctttacgc ccatatccgg ataacgctgc actacggtat aacgcgctgc 960
ctgcacgtag ttaggccatg gctttctggg taaggtaccg ctcag 1005

Claims (10)

1.蜡样芽孢杆菌FRIL1902，所述菌的菌种已于2019年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCC No.17336。
2.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌FRIL1902发酵培养的培养物。
3.权利要求1所述蜡样芽孢杆菌FRIL1902的菌悬液。
4.权利要求2所述培养物的培养方法，包括以下步骤：1)将所述菌种接种于LB培养基；2)在37℃恒温振荡培养。
5.蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液在降解羽毛中的应用，所述应用包括：降解羽毛和/或产蛋白酶、降解角蛋白。
6.一种降解羽毛的方法，包括以下步骤：
1)将蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的培养基中；
2)在37℃条件下振荡培养进行发酵降解。
7.一种降解羽毛大分子蛋白的方法，包括以下步骤：
1)将蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的培养基中；
2)在37℃条件下振荡培养进行发酵降解。
8.一种改善羽毛营养价值与风味的方法，包括以下步骤：
1)将蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的培养基中；
2)在37℃条件下振荡培养进行发酵降解。
9.一种产品，其活性成分包括蜡样芽孢杆菌FRIL1902或其培养物或其菌悬液。
10.权利要求9所述的产品在饲料制备中的使用。
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