CN110218664A

CN110218664A - 一株高效降解羽毛的菌株及其应用

Info

Publication number: CN110218664A
Application number: CN201910386874.8A
Authority: CN
Inventors: 田久东; 陈达; 任婉丽; 邓雪娟; 杨继帅; 张列飞; 于继英; 刘世杰
Original assignee: Boyide Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Boyide Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2019-09-10

Abstract

本发明提供了一种可高效降解羽毛的蜡样芽孢杆菌，属于微生物技术领域。该菌株为Bacillus cereus CTYM‑9，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2018年12月21日，保藏编号为CGMCC NO.17020。本发明菌株降解羽毛速度快、效率高，适用于解决废弃羽毛带来的资源浪费和环境污染的问题，具有良好的应用前景。

Description

一株高效降解羽毛的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种可高效降解羽毛的菌株，属于微生物技术领域。

背景技术

羽毛是鸟类和禽类表皮细胞角质化的衍生物，占其体重的10％。随着养禽业的集约化发展，家禽生产产生的废弃羽毛规模可观。虽然羽毛的主要成分是蛋白质，但其中角蛋白的含量高达90％左右，因此难以被降解，更不容易被动物肠道的消化酶所消化，不仅造成资源浪费，也带来了一定程度的环境污染。

由于物理法-高温高压、化学法-酸碱水解存在高耗能、污染环境等固有缺陷，更重要的是，经过这些过程处理后，所得的羽毛粉的营养价值会遭到一定程度的破坏。相较而言微生物降解法，反应条件温和，耗能少，经济环保的同时还避免了大部分氨基酸的损失，提高了羽毛降解产物的可吸收利用性，因此，微生物降解法更适用于解决废弃羽毛带来的资源浪费和环境污染的问题。

近年来已有不少关于微生物降解法的专利及研究报道，专利文件 CN107099472A公布了一种蜡样芽孢杆菌，菌株号为NJ-02，对多种羽毛能够有效降解，但是降解速度较慢，效率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可高效降解废弃羽毛的菌株，其能快速的降解羽毛，降解效率高，发酵周期短，避免了大部分氨基酸的损失，提高了羽毛降解产物的可吸收利用性。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一株高效降解羽毛的菌株，该菌株为Bacillus cereus CTYM-9,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，位于中国北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，保藏日期为2018年12月21日，保藏编号为CGMCC NO.17020。

本发明可降解羽毛的菌株是利用以羽毛为唯一氮源和碳源的培养基经连续多次转接培养所筛选出能够降解羽毛的菌株，再经分离纯化、酪蛋白培养基点种实验和单根羽毛降解实验分离筛选出的一株高效降解羽毛的菌株。

菌株CTYM-9的主要生物学特征：菌落呈乳白色，圆形凸起，表面湿润光滑，边缘刺状，无光泽，不透明。菌落革兰氏染色为阳性，菌体短杆状，芽孢中生。

经过16S rDNA扩增和序列对比分析以及结合其主要生物学特征，鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

本发明所述菌株CTYM-9 16S rDNA基因序列，见SEQ ID NO.1所示。

本发明所述可降解废弃羽毛的菌株的筛选方法：

1)采样：采集养殖场的半腐烂羽毛埋于地下深度10-20cm处，5个月后取出；

2)富集：称取10g取出的半腐烂羽毛两份，分别加入到装有200mL的普通富集培养基和羽毛富集培养基中，制备菌悬液，于37℃、180r/min的摇床中震荡培养24h；

所述普通富集培养基(g/L)：葡萄糖10.0、NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨 10.0，pH自然；

所述羽毛富集培养基(g/L)：羽毛10.0、蛋白胨10.0、葡萄糖7.0、酵母浸膏3.5、NH₄NO₃ 4.0、(NH₄)₂SO₄ 12.35、K₂HPO₄ 0.1、KH₂PO₄ 0.7、MgSO₄ 0.1、NaCl 10.0、pH自然；

3)初筛：取两种富集培养基菌悬液各2mL分别加入到两个初筛培养基中，于37℃、180r/min条件下培养，每隔12h观察羽毛有无降解现象，取有降解现象的培养液2mL加入到新的筛选培养基中，同样条件培养，分别重复至少3次和6次；

所述初筛培养基(g/L)：羽毛10.0、NaCl 0.5、K₂HPO₄ 1.4、KH₂PO₄ 0.7、 MgSO₄ 0.1，pH自然；

4)分离纯化：将最终得到的初筛培养基菌液分别进行10^-4、10^-5、10^-6三个梯度稀释，分别取稀释后的菌液100μL涂布于羽毛固体培养平板上，37℃培养箱倒置培养48h。挑取菌落形态良好、长势较好的菌落于LB固体培养基进一步划线纯化，37℃培养箱倒置培养48h；

所述羽毛固体培养基(g/L)：羽毛10.0、NaCl 0.5、K₂HPO₄ 1.4、KH₂PO₄ 0.7、 MgSO₄0.1琼脂17.5，pH自然；

所述LB固体培养基(g/L)：NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、琼脂17.5， pH自然；

5)复筛：将经分离纯化后的菌株接种到酪蛋白选择性分离培养基中进行平板点种试验，37℃培养48h，比较水解圈直径(Dp)和菌落直径(Dc)比值(HC) 的大小，HC值越高，菌株产蛋白酶的能力越强，筛选出产蛋白酶能力强的菌株；

所述选择性分离培养基(g/L)：干酪素4.0、CaCl₂ 3.0、NaCl 5.0、牛肉膏5.0、琼脂粉16.0，pH自然。

本发明还提供所述的菌株在降解角蛋白质物质中的应用。在本发明中，角蛋白质物质是指富含角蛋白的生物质，例如富含角蛋白的纤维，如羽毛，动物的毛发等等，此外对鳞、甲、蹄、角、爪、喙等角蛋白含量高的动物组织也具有较好的降解能力。

本发明还提供上述菌株降解羽毛的方法，其是将羽毛作为碳源和氮源制成发酵培养基，向该羽毛发酵培养基中加入该菌株种子液，在37℃、180r/min条件下培养，即可实现对羽毛的高效降解。所述羽毛可以是完整羽毛，也可以是羽毛碎料。

本发明降解羽毛的方法，其包括如下步骤：

1)种子液制备将菌株CTYM-9接种于种子培养基中培养，获得种子液；

2)降解发酵处理以羽毛或含羽毛的羽毛培养基为发酵底物用步骤1)所获种子液进行发酵处理。

其中，所述步骤1)中种子培养基配方如下(g/L)：NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0，pH自然。

其中，所述步骤2)中的羽毛培养基配方如下(g/L)：1根完整羽毛0.1～100、 NaCl0.5、K₂HPO₄ 1.4、KH₂PO₄ 0.7、MgSO₄ 0.1，pH自然。

其中，步骤1)中种子液制备条件为：搅拌转速为160～220r/min，温度为30～38℃，培养36～48h；优选地，搅拌转速为180r/min，温度为37℃，培养48h。

其中，所述发酵处理条件为：接种量2％～10％，搅拌转速为160～220r/min，温度为30～40℃；优选地，接种量2％，搅拌转速为180r/min，温度为37℃。

有益效果：

1、本发明提供了一种微生物菌株Bacillus cereus CTYM-9，该菌株可高效降解羽毛，在第4天时以羽毛为唯一氮源、碳源的单根羽毛培养液已经基本澄清，羽毛几乎完全降解，降解率达到95％，降解时不需对羽毛进行特殊处理。

2、本发明还提供了一种分离筛选能够高效降解羽毛的菌株的方法，其基本过程是利用以羽毛为唯一氮源和碳源的培养基经连续多次转接培养筛选出能够降解羽毛的菌株，再经分离纯化、酪蛋白培养基点种实验和单根羽毛降解实验分离筛选出一株高效降解羽毛的菌株。本方法利用以羽毛为唯一氮源和碳源的培养基筛选菌株、具有菌株筛选方向明确、筛选方法简单、筛选的菌株专一性强等特点。

3、本发明提供的一种微生物菌株Bacillus cereus CTYM-9可高效产角蛋白酶，还可用于处理处羽毛外其他不容易降解又含角蛋白较高的物质，如发、毛、鳞、甲、蹄、角、爪、喙等，使之变成短肽或游离氨基酸,而能够被畜禽利用。

附图说明：

图1为10株菌分别降解单根羽毛的情况图；

图2为CTYM-5的羽毛降解情况图；

图3为CTYM-7的羽毛降解情况图；

图4为CTYM-9的羽毛降解情况图；

图5为CTYM-9菌落形态图；

图6为CTYM-9革兰氏染色图；

图7为CTYM-9采用已公开条件试验的羽毛降解效果图。

具体实施方式：

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。以下具体实施例为对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但并不意味这本发明上述主体的范围仅限于以下实施案例。凡基于本发明的上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：可高效降解废弃羽毛的细菌菌株的筛选

1、具体筛选步骤如下：

1)采样：采集养殖场的半腐烂羽毛埋于地下深度10-20cm处，5个月后取出，并迅速带回实验室置于-4℃冰箱中保存备用；

2)富集培养：分别称取10g取出的半腐烂羽毛分别加入到装有200mL的普通富集培养基和羽毛富集培养基中，制备菌悬液，于37℃、180r/min的摇床中震荡培养24h；

所述普通富集培养基(g/L)：葡萄糖10.0、NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨 10.0，pH自然。

所述羽毛富集培养基(g/L)：羽毛10.0、蛋白胨10.0、葡萄糖7.0、酵母浸膏3.5、NH₄NO₃ 4.0、(NH₄)₂SO₄ 12.35、K₂HPO₄ 0.1、KH₂PO₄ 0.7、MgSO₄ 0.1、NaCl 10.0、pH自然。

3)初筛：分别取羽毛富集培养基、普通富集培养基溶液各2mL分别加入到2个以羽毛为唯一氮源、碳源的筛选培养基中，于37℃、180r/min条件下培养，每隔12h观察羽毛有无降解现象，取有降解现象的培养液2mL于筛选培养基中，同样条件培养，分别重复至少3次和6次，以筛选出能够降解羽毛的菌株；

所述筛选培养基(g/L)：羽毛10.0、NaCl 0.5、K₂HPO₄ 1.4、KH₂PO₄ 0.7、 MgSO₄ 0.1，pH自然。

4)分离纯化：将最终得到的筛选培养基菌液分别进行10^-4、10^-5、10^-6三个梯度稀释，分别取稀释后的菌液100μL涂布于以羽毛为唯一氮源、碳源的羽毛固体培养平板上，每个梯度3个平行，37℃培养箱倒置培养48h；

挑取25个菌落形态良好、长势较好的菌落于LB固体培养基进一步划线纯化，37℃培养箱倒置培养48h；

所述羽毛固体培养基(g/L)：羽毛10.0、NaCl 0.5、K₂HPO₄ 1.4、KH₂PO₄ 0.7、 MgSO₄0.1、琼脂17.5，pH自然。

所述LB固体培养基(g/L)：NaCl5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0、琼脂17.5， pH自然。

5)菌种复筛:将经分离纯化后的25株菌接种到酪蛋白选择性分离培养基中进行平板点种试验，37℃培养48h，比较水解圈直径(Dp)和菌落直径(Dc) 比值(HC)的大小(如下表1)，以此判断该菌株产蛋白酶的能力，HC值越高，菌株产蛋白酶的能力越强，筛选出产蛋白酶能力较强的10株菌；

所述选择性分离培养基(g/L)：干酪素4.0、CaCl₂ 3.0、NaCl 5.0、牛肉膏5.0、琼脂粉16.0，pH自然；

表1酪蛋白平板点种试验

将上述10株菌分别接种到种子培养基中，于37℃、180r/min条件下振荡培养48h，分别取培养液以2％的接种量接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的羽毛培养基中，于37℃、180r/min振荡培养，每12小时观察羽毛降解的情况(图1)。第4天时，菌株编号为CTYM-9的菌种降解现象最为明显，可将单根羽毛完全降解。

所述种子培养基(g/L)：NaCl 5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0，pH自然。

所述羽毛培养基(g/L)：1根完整羽毛、NaCl 0.5、K₂HPO₄ 1.4、KH₂PO₄ 0.7、 MgSO₄0.1，pH自然。

2、菌种降解羽毛效果

取复筛过程中羽毛降解效果明显的CTYM-5、CTYM-7和CTYM-9纯培养液按2％的接种量分别接种到以羽毛为唯一氮源、碳源的单根羽毛培养基中，于 37℃、180r/min条件进行降解每12h观察羽毛降解情况(图2、3、4)。

结果显示：CTYM-5和CTYM-7在第4天时仍然存在散乱的羽毛小枝， CTYM-9第4天时液体已经澄清，羽毛几乎完全降解可见菌株CTYM-9降解羽毛能力最强。

实施例2：可高效降解羽毛的CTYM-9菌株菌种鉴定

1、菌落及菌体形态观察：

CTYM-9菌落形态(图5)：菌落呈乳白色，圆形凸起，表面湿润光滑，边缘刺状，无光泽，不透明。菌落革兰氏染色(图6)为阳性，菌体短杆状，芽孢中生。

2、16S rDNA菌种鉴定

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因DNA，通过PCR扩增细菌16S rDNA序列，其中菌株的PCR引物序列的上游引物P1和下游引物P2分别为：

P1：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

P2：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'。

按表2的反应体系，在PCR反应管内配制PCR反应液：

表2 PCR反应管体系

PCR反应循环条件如下：

电泳检测及测序：

PCR循环结束后取PCR产物2μl，加6μl上样缓冲液，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。检测为目的PCR产物则填写测序登记单，进行测序反应。

经16S rDNA引物进行扩增后，得到约1400bp左右的PCR扩增片段。经过 16SrDNA序列检测，序列表如SEQ ID NO:1所示，将获得菌株的16SrDNA序列在NCBI网站中Genebank/EMBL/DDBJ数据库中进行序列比对，结果表明菌株CTYM-9鉴定为蜡样芽孢杆菌。

实施例3：菌株CTYM-9与菌株NJ-02降解效果对比

专利文件107099472A公开了一种蜡样芽孢杆菌NJ-02，以5％-10％的接种量接种于5ml高压灭菌15磅121℃15min，冷却后的降解羽毛基础培养基(单根鸡毛、NaCl 0.5g/L、K2HPO4 0.4g/L、FeSO4 0.1g/L，pH7.5)，置37℃培养箱培养，观察发现：第5天羽枝松软，羽枝钩溶解；第10天，羽小枝完全溶解消失；第15天羽毛绝大数溶解；

对比试验采用专利文件107099472A中公开的蜡样芽孢杆菌NJ-02作为对比菌，采用该专利文件中公开的降解羽毛培养基以及培养方法，CTYM-9以5％的接种量接种，置37℃培养箱中培养，观察结果(图7)：第5天羽毛枝被降解、大部分羽毛散乱分布在培养基中；第7天羽毛枝完全被降解；第10天羽毛几乎被完全降解。由对比实验结果可知，菌株CTYM-9降解羽毛效果明显优于菌株 NJ-02。

实施例4：菌株CTYM-9在降解羽毛中的应用

(1)菌种活化：从-80℃的冰箱中取出已冻存的CTYM-9菌种甘油管，置于 4℃冰箱融化至变成液体状。将融化后的菌种接种到LB液体培养基中，37℃、 180r/min摇瓶培养2d。用接种环蘸取上述菌液划线接种于LB固体培养基，分离出单菌落。

(2)种子液制备：挑取典型菌落接种于种子培养基中，37℃、180r/min振荡培养至对数生长期，即获得CTYM-9种子液。

(3)降解发酵处理：取步骤(2)制备的种子液以2％的接种量接种到单根羽毛培养基中，于37℃、180r/min振荡培养发酵处理，即可完成对羽毛的高效降解。

以上所述，仅为本发明已探索的并取得良好效果的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变；都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 博益德（北京）生物科技有限公司

<120> 一株高效降解羽毛的菌株及其应用

<130> P1910109

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> Bacillus cereus

<400> 1

actatgcggc gtgctataca tgcaagtcga gcgaatggat taagagcttg ctcttatgaa 60

gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc cataagactg ggataactcc 120

gggaaaccgg ggctaatacc ggataacatt ttgaaccgca tggttcgaaa ttgaaaggcg 180

gcttcggctg tcacttatgg atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc 240

tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga 300

cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct 360

gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg 420

aagaacaagt gctagttgaa taagctggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg 480

ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg 540

ggcgtaaagc gcgcgcaggt ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt 600

ggagggtcat tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt 660

agcggtgaaa tgcgtagaga tatggaggaa caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg 720

taactgacac tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc 780

acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa 840

cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

aggtcttgac atcctctgac aaccctagag atagggcttc tccttcggga gcagagtgac 1020

aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080

gcgcaaccct tgatcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140

acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200

acacgtgcta caatggacgg tacaaagagc tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat 1260

aaaaccgttc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta 1320

gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380

cacaccacga gagtttgtaa cccccgaagt cggtggggta acctttttgg agccagccgc 1440

ctaagtgaca tagacctaag tgggacagat gattggggtg agtct 1485

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagagtttga tcctggctca g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac 20

Claims

1.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)CTYM-9，其保藏编号为CGMCC NO.17020。

2.权利要求1所述的菌株在降解角蛋白质物质中的应用。

3.权利要求1所述的菌株在降解羽毛中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述羽毛为鸡毛、鸭毛、鹅毛或鸽毛。

5.一种降解羽毛的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中种子培养基配方如下(g/L)：NaCl5.0、牛肉膏5.0、蛋白胨10.0，pH自然。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的羽毛培养基配方如下(g/L)：羽毛0.1～100、NaCl 0.5、K₂HPO₄ 1.4、KH₂PO₄ 0.7、MgSO₄ 0.1，pH自然。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中种子液的制备条件为：搅拌转速为160～220r/min，温度为30～38℃，培养36～48h；

优选地，搅拌转速为180r/min，温度为37℃，培养48h。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵处理条件为：接种量2％～10％，搅拌转速为160～220r/min，温度为30～40℃；

优选地，接种量2％，搅拌转速为180r/min，温度为37℃。

10.如权利要求5～9所述方法，其特征在于，所述羽毛为鸡毛。