CN108070540A - 一株产表面活性剂微生物及其在堆肥中的应用 - Google Patents

一株产表面活性剂微生物及其在堆肥中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产表面活性剂微生物及其在堆肥中的应用，微生物为Bacillus velezensisSW‑1，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60285。本发明提供的产表面活性B.velezensisSW‑1碳源利用率广，适应性强；同时，将本发明菌株用于有机物堆肥时，能够降低表面张力，提高有机物料与微生物的接触面积，从而提高有机质的发酵效率，缩短堆肥发酵周期并提高堆肥处理效率。

Description

一株产表面活性剂微生物及其在堆肥中的应用
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种产表面活性剂的微生物及其在有机废物生物堆肥中的应用。
背景技术
有机废物高温好氧堆肥是利用微生物分解有机物，同时释放出热能，并将有机碳转化为类腐殖质的过程，是有机固废资源化的重要手段。但是，由于有机废物如城市污泥、畜禽粪便来源广泛，有机成分复杂，大部分有机成分不溶或微溶于水，与微生物接触面小，可生物降解速度慢。因此，在堆肥过程初始阶段添加表面活性剂，能够降低表面张力，增加水相中不溶性有机物与微生物的接触面积，加快微生物的增长与繁殖，从而加速腐殖化过程和提高堆肥效率和产品质量。
作为一种接种剂，产表面活性微生物可加速生物堆肥的腐熟过程。产表面活性微生物是一种在代谢过程中能分泌出具有一定表面活性代谢产物如糖脂、多糖脂、脂肽或中性类脂衍生物等的微生物，其种类主要包括铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、不动杆菌、酵母等。与传统化学表面活性剂比较，产表面活性微生物因产生的生物表面活性剂具有无毒、环境友好等特点，已被广泛应用在石油工业、制药工业和化妆品及有机废物生物堆肥等领域。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是2005年Cristina发现的一种革兰氏阳性、好氧生长的芽孢杆菌。现有研究发现，贝莱斯芽孢杆菌能够产生脂肽类表面活性剂，然而其产量不足，但尚未发现有利用贝莱斯芽孢杆菌促进有机废物生物堆肥腐熟的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisSW-1及其在有机废物生物堆肥中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明从高温期污泥堆肥中，经高温富集、分离纯化得到嗜热菌B.velezensisSW-1菌株。该菌株于2017年11月24日保藏在位于广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏中心给予的保藏号为GDMCC No.60285。
本发明的有益效果是：本发明提供的产表面活性B.velezensisSW-1碳源利用率广，适应性强；同时，将本发明菌株用于有机物堆肥时，能够降低表面张力，提高有机物料与微生物的接触面积，从而提高有机质的发酵效率，缩短堆肥发酵周期并提高堆肥处理效率。
附图说明
图1是嗜热菌B.velezensisSW-1表面活性剂表面张力分析结果。
具体实施方式
嗜热菌B.velezensisSW-1的分离
称取10g高温期污泥堆肥样品接种至装有100mL富集培养基的锥形瓶中，置于恒温振荡摇床上37℃、200rpm/min培养3d，吸取10mL培养好的液体培养液接种于100mL灭菌的富集培养基中，恒温振荡摇床上37℃、200rpm/min培养3d。如此发复培养4次，然后吸取1mL培养液进行平板稀释并涂布于血琼脂平板，置于培养箱中37℃培养。培养24h后，根据溶血环进行初步筛选。挑产挑选溶血圈大且透明的单菌落接种于LB平板上划线分离4次，直至得到单菌落。
其中，LB培养基的配制方法是：酵母提取物5.0g，细菌蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g、去离子水1000mL，pH 7.2，在121℃下灭菌25min；血琼脂平板配置方法为：将蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL煮沸至充分溶解，高压灭菌15-20min，待冷却至50℃左右时加入50mL抗凝羊血(除去纤维)，摇匀后倒平板。
产表面活性微生物嗜热菌B.velezensisSW-1的鉴定特征：
(1)革兰氏阳性，好氧，菌体呈杆状，周生鞭毛，具运动性；在温度为15～45℃、pH为5.0～9.0时能生长。
(2)在LB培养基上培养2～3d，菌落乳白色，直径2～3mm，边缘不规则，中央凸起。
(3)利用引物(27f)：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGTTACCTT GTT ACG ACT T-3′经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，将获得序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示该菌与Bacillus velezensis CR-502T的相似性最高，为99.5％。
嗜热菌B.velezensisSW-1表面活性剂分析
表面活性剂的提取：挑取B.velezensisSW-1菌苔接种至LB液体培养基中37℃、200rpm/min培养96h。取一定量发酵液，用NaOH溶液将pH值调至7.5-9.0，10000r/min离心15min，取上清液，用盐酸调pH值至2.0，离心收集沉淀，用等体积的CHCl3/CH3OH(体积比3∶1)连续萃取3次；合并萃取相，浓缩，用pH值2.0的盐酸水溶液洗涤5次，减压蒸发除去有机相，用NaOH溶液将沉淀物的pH值调至7.0，真空干燥后加入正己烷洗涤3次，除去脂肪酸，离心收集沉淀物并干燥。最后50℃抽提10h，除去CH2Cl2，即得生物表面活性剂。
表面活性剂的定性分析：取提取的生物表面活性剂粗品溶于二氯甲烷中，将样品点在硅胶板上，展开，用茚三酮原位水解显色检测。发现硅胶板出现红色斑点，说明表面活性剂为脂肽类物质。
表面张力测定：采用TVT2液滴体积界面张力仪对不同浓度表面活性剂进行测定。结果发现，随着脂肽浓度的增加，界面张力逐渐下降，当稀释40倍时，即脂肽浓度为25mg/L时，表面张力降到最低为3.0m N/m，再继续增加浓度表面张力不再下降。实验结果如图1所示。
嗜热菌B.velezensisSW-1接种剂的制备
1)摇瓶培养：从B.velezensisSW-1斜面培养基上挑取1环接入菌苔接种于装有100mLLB液体培养基的锥形瓶中，37℃、200rpm/min摇床上振荡培养12h即为摇瓶种子培养液。所述的LB液体培养基配方为(g/L)：酵母浸膏5.0g；胰蛋白胨10.0g；NaCl5.0g；水1000mL；pH 7.2。
2)种子罐发酵：以3％的接种量将摇瓶菌液移入装有LB培养基的种子罐，进行发酵培养。条件为：罐温37℃、罐压0.005MPa、通气量1:1.0(V/V/分)、搅拌速度rpm/min、发酵时间36h。
3)发酵罐发酵：以3％的接种量将发酵好的种子罐发酵液接种至装有LB培养基的发酵罐，进行发酵培养。条件为：罐温37℃、罐压0.005MPa、通气量1:1.0(V/V/分)、搅拌速度200rpm/min、发酵时间36h。所得的发酵液即为B.velezensisSW-1接种剂。
嗜热菌B.velezensisSW-1接种剂的应用
以下以城市污泥生物堆肥说明本发明接种剂的应用效果。
按重量比1:1:1取市政污泥、木屑、秸秆初步混合均匀后，按总物料2％添加制备的SW-1接种剂，好氧堆肥发酵25d。另设不接种SW-1接种剂作为对照。堆肥过程中每3d或温度超过60℃进行翻堆。通过堆肥温度变化、堆肥C/N及种子发芽指数判定堆肥的腐熟度。实验结果如表1和表2所示。
表1.SW-1接种剂对堆肥温度的影响
表2.SW-1接种剂对堆肥腐熟度的影响
实验处理 堆肥C/N 种子发芽指数(GI)(％) GI大于85％的时间(d)
接种 14.35 94.3 13
对照 16.54 89.5 17
从表1可以看出，堆肥接种SW-1接种剂后，最高温度可达75℃，达到最高温度时间为发酵后第3d，高温期可达10d，其最高温度、升温速度及高温期维持时间均高于对照，说明SW-1接种剂可明显促进堆肥前期发酵升温，并提高堆肥温度，而且高温持续时间长，堆肥发酵效率高。
表2为SW-1接种剂对堆肥腐熟度的影响。从表2可以看出，至发酵完成后，接种SW-1处理的堆肥C/N降至14.35，发芽指数为94.3％。与对照比较，C/N降低13.2％，发芽指数提高5.3％，并且发芽指数大于85％的时间明显提早，说明SW-1接种剂可明显促进堆肥快速腐熟，并缩短堆肥发酵周期，提高污泥的无害化与稳定化。
嗜热菌B.velezensisSW-1接种剂的应用
以下以畜禽粪污生物堆肥说明本发明接种剂的应用效果。
物料成分为沼渣、猪粪及鸡粪。猪粪及鸡粪分别取自养猪场及养鸡场，沼渣为猪粪厌氧消化产物。将取回的新鲜堆肥原料放置于阴凉通风处，以降低其含水率。所取沼渣、猪粪和鸡粪的C/N分别为31.40、25.30和9.10；有机质质量分数分别为35.4％、80.1％和45.50％。按重量比1:1:1取沼渣、猪粪及鸡粪初步混合均匀后，按总物料2％添加实施例3中制备的SW-1接种剂，好氧堆肥发酵25d。另设不接种SW-1接种剂作为对照。堆肥过程中每3d或温度超过60℃进行翻堆。通过堆肥温度变化、C/N比、种子发芽指数判定堆肥的腐熟度。
表3.SW-1接种剂对堆肥温度的影响
表4.SW-1接种剂对堆肥腐熟度的影响
实验处理 堆肥C/N 种子发芽指数(GI)(％) GI大于85％的时间(d)
接种 11.25 94.65 12
对照 13.45 90.26 14
表3为SW-1接种剂对畜禽粪污堆肥温度的影响。从表3可以看出，堆肥接种SW-1接种剂后，达到55℃时间为发酵后48h，高温期可达10d，其发酵最高温度及高温期维持时间均高于对照，并且达到55℃时间的时间也早于对照，说明SW-1接种剂可明显促进堆肥前期发酵升温，并提高堆肥温度，且高温持续时间长，堆肥效率高。
表4为SW-1接种剂对堆肥腐熟度的影响。从表4可以看出，堆肥接种SW-1接种剂后，堆肥C/N降低。与对照比较，发芽指数降低，并且发芽指数大于85％的时间明显提早，说明SW-1接种剂可明显促进堆肥腐熟。

Claims (10)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisSW-1，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60285。
2.一种微生物制剂，含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisSW-1。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于：微生物制剂为液体菌剂。
4.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于：微生物制剂为浓缩菌剂，浓缩菌剂的有机填料混合质量比为：麦麸：秸秆：米糠：黄豆粉＝(1～2)：(1～3)：(1～3)：(1～2)。
5.根据权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于：浓缩菌剂的浓缩倍数为5～10倍。
6.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisSW-1在制备有机质堆肥促进剂中的应用。
7.一种有机质的堆肥方法，包括在堆肥过程中添加权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisSW-1。
8.根据权利要求7所述的堆肥方法，其特征在于：贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisSW-1以权利要求3～5任一项所述的微生物制剂的形式添加至有机质中。
9.根据权利要求6所述的堆肥方法，其特征在于：贝莱斯芽孢杆菌BacillusvelezensisSW-1的活菌加入量为1g～100g/kg有机质干重。
10.根据权利要求6～8任一项所述的堆肥方法，其特征在于：有机质的初始含水率为55～65％、C/N为25-35、pH 6～8。
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