CN114525223B - 一种恶臭假单胞菌及其在降解马铃薯淀粉废水中应用 - Google Patents

一种恶臭假单胞菌及其在降解马铃薯淀粉废水中应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一种恶臭假单胞菌及其在降解马铃薯淀粉废水中的应用。所述菌株具体为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX‑L，保藏编号：CGMCC No.24360。本发明将菌株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX‑L接种到马铃薯淀粉废水中，发现其不仅可以降解马铃薯淀粉废水中蛋白质，同时可以减少臭味物质的产生，解决了马铃薯淀粉行业废水的排放问题及废水发酵过程中产生臭味物质污染环境的问题，同时为马铃薯淀粉废水的再利用提供了一定依据。

Description

一种恶臭假单胞菌及其在降解马铃薯淀粉废水中应用
技术领域：
本发明属于微生物应用领域，具体涉及一种恶臭假单胞菌及其在降解马铃薯淀粉废水中的应用。
背景技术：
近年来，马铃薯产业在国内迅速发展，在西北地区(内蒙古、宁夏、甘肃等)形成了产业化基地。在马铃薯产业日益发展的同时，其自身也带来了重大的挑战，约90％的马铃薯淀粉废水来自生产土豆淀粉、土豆粉等产品加工工业，而加工马铃薯需要大量的水，大约每加工1000吨马铃薯时就会产生600立方米的马铃薯淀粉废水。
马铃薯淀粉废水的主要来源包括三部分：一是马铃薯流送渠和洗涤废水；二是从筛网或离心机提取淀粉后的废水、薯浆脱水的压榨机和沉淀池排出的蛋白质废水；三是淀粉精制和洗涤中排出的蛋白质废水。这种废水没有毒性，但如果直接排放，废水中存在的有机物质非常有利于微生物或致病菌的大量生长繁殖，可能造成环境中的生物污染问题，且废水中的有机质会在自然发酵后释放出硫化氢、氨气、腐胺、尸胺等恶臭气味污染环境。
目前，马铃薯淀粉废水处理方法有物理法，其主要原理在于将有机质进行沉淀，过滤等，具有占地面积大，处理时间长，处理效果不理想等问题，且不能从根本上解决污染的问题；化学法是通过加酸加碱等处理，或在固定配套设备下进行，此处理具有设备复杂，运行费用高等问题；利用生物法处理能够较为有效的降解有机质，技术设施简单，处理效率高，运行费用低等特点，更符合2010年环保部和国家质量监督检验局发布实施的《淀粉工业水污染物排放标准》和2015年环保部发布实施的《淀粉废水工程治理技术规范》的要求。
发明内容：
本申请筛选出一株恶臭假单胞菌，能够在实际生产中有效降解马铃薯淀粉废水中的蛋白质，且降低其发酵过程中的恶臭气味。为采用生物法处理马铃薯淀粉废水提供新的可能。
本发明提供的技术方案之一，是一株能够降解马铃薯淀粉废水的恶臭假单胞菌，该菌株具有在低温条件下降解马铃薯淀粉废水中蛋白质及减少发酵过程中臭味物质的产生的特性。
所述恶臭假单胞菌具体为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L，是通过鱼塘中水样进行降解蛋白质菌的筛选获得具有较强降解蛋白质的菌株之后，经过进一步筛选获得的。通过对所获菌株进行形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列测定及系统发育分析确定其为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L已于2022年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No.24360。
所述菌株TX-L具有如下理化特性：
(1)菌落颜色为黄绿色，质地粘稠，中央凸起，四周边缘较整齐，镜检为革兰氏阴性小短杆菌，无芽孢。
(2)最适生长条件温度13～20℃、pH5.5～7.2。
(3)对马铃薯淀粉废水中蛋白质的降解率达到65.88％。
(4)对马铃薯淀粉废水中氨氮的降解率达65.16％。
(5)对马铃薯淀粉废水中挥发性臭味物质吲哚含量降低3.41％、硫化氢产生量降低了17.6％。
(6)对马铃薯淀粉废水中生物胺具有降解能力，减少生物胺臭味物质产生达86.94％。
本发明提供的技术方案之二，是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L在降解马铃薯废水中的应用；
进一步地，采用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L降解马铃薯废水的方法如下：
将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L培养至对数生长期，按3～6％的接种量接种到马铃薯淀粉废水中，13～20℃静置发酵2～3天；
进一步地，在NB液体培养基中将恶臭假单胞菌TX-L培养至对数生长期。
有益效果：
本发明将菌株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L接种到马铃薯淀粉废水中，发现其不仅可以降解马铃薯淀粉废水中蛋白质，同时可以减少臭味物质的产生。
其中，马铃薯淀粉废水中蛋白质由17.12g/L降低到5.84g/L，降解率达65.88％；氨氮含量由3.33g/L降低到1.16g/L，降解率达65.16％；挥发性臭味物质吲哚含量由5.14％降低到1.73％，降低了3.41％；硫化氢含量由19.39％降低到了1.79％，降低了17.6％；总的生物胺(尸胺、腐胺、色胺、组胺、精胺、亚精胺、酪胺)含量由52.352mg/L降低到6.835mg/L，减少臭味物质产生达86.94％。
且经过发酵后马铃薯淀粉废水中的磷酸盐含量由1.63mg/dL上升到2.37mg/dL，提高了31.22％；腐植酸(具有肥料增效、改良土壤、刺激作物生长、改善农产品质量等功能有助于植物生长)含量由8.55mg/L上升到了11.21mg/L，提高了31.11％；发酵后菌株TX-L可以将蛋白质等物质分解成了小分子的氨基酸等物质，且磷酸盐的含量和腐植酸含量也得到了一定程度的提高，将发酵后的马铃薯淀粉废水应用与线辣椒和芹菜的种植，可以使线辣椒和芹菜的品质及产量等得到一定程度的提高。
本发明解决了马铃薯淀粉行业废水的排放问题及废水发酵过程中产生臭味物质污染环境的问题，同时为马铃薯淀粉废水的再利用提供了一定依据。
附图说明：
图1为菌株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L菌体形态图；
图2为菌株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L在选择培养基上48h的菌落图；
图3为菌株恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L系统发育树。
图4各处理对线辣椒产量、品质的影响。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L的分离、筛选及鉴定
(1)降解菌的分离和筛选
将采集的鱼池水样5mL加入45mL无菌生理盐水中混匀，再从中取1mL于9mL NB液体培养基中富集培养24h，采用稀释梯度法，取0.1mL菌悬液涂布在酪蛋白培养基上，15℃培养48h，挑取产生透明圈的单菌落。将单菌落分别接种于马铃薯淀粉废水中进行复筛，15℃静置发酵，测定其发酵前后蛋白质的降解情况，以及氨氮、磷酸盐、腐植酸、生物胺及挥发性物质含量。将复筛得到的菌株命名为TX-L。
(2)降解菌的鉴定
①形态特征、生理生化鉴定
将复筛得到的菌株TX-L活化，接种于酪蛋白培养基中，15℃培养48h，发现菌落颜色为淡黄绿色，质地粘稠，四周边缘交整齐，镜检为革兰氏阴性小短杆菌，无芽孢(见图1、2)。
以下为菌株TX-L生理生化鉴定结果(表1)：
表1：菌株TX-L生理生化鉴定
Figure BDA0003527913820000041
②PCR扩增内生菌16S rDNA序列及测序、序列比对及系统发育分析
细菌基因组DNA的提取参照试剂盒的说明书进行。将收集到的DNA作为模板，采用16S rDNA细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增及克隆测序引物正向序列27F(5'-AGAGTTTGACCTGGCTCAG-3')，反向序列1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')，直至扩增出菌株的16S rDNA片段，进行电泳检测，之后将产物送至测序机构进行测序。测序后将菌株的基因序列通过GenBank数据库中Blasting程序与NCBI中的核酸数据进行比对分析。选择合适的序列，使用MEGA11软件测得的DNA序列与标准数据库中16SrDNA基因序列相关种属代表菌株进行系统发育及同源分析。并进行置信度检测，自举数据集为1000次。绘制菌株系统发育树(见图3)。菌株TX-L与标准菌株MZ540339.1同一支系，相似度达到99％以上，故菌株TX-L鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
实施例2恶臭假单胞菌TX-L发酵马铃薯淀粉废水
将菌株置于15℃的马铃薯淀粉废水(马铃薯淀粉加工过程主要分为五个过程，一：马铃薯冲洗，为了去除马铃薯上的泥沙等，这部分废水可进行沉淀循环利用；二：磋磨过程，利用磋磨机将马铃薯粉碎，释放出游离的淀粉颗粒；三：筛分浓缩过程：将粉碎后的马铃薯进行离心筛分，将薯渣和淀粉乳分开，在将淀粉乳通入浓缩旋流器中去除淀粉乳中的大部分汁液(含有大量蛋白质、细纤维等)；四：洗涤淀粉：将浓缩后的淀粉乳置于洗涤精制旋流器中进一步洗涤；五：淀粉脱水干燥：洗涤后的淀粉乳进入真空吸滤机中进行脱水，再进气流干燥后形成成品淀粉。其中，本发明中马铃薯淀粉废水指淀粉加工过程的后四个过程中产生的废水。)中进行单因素及响应面试验优化，优化后在15℃下，将菌株TX-L在NB液体培养基中培养至对数生长期，按3％的接菌量接种到pH6.5的马铃薯淀粉废水中，15℃静置发酵2天。
其中，发酵结束后，马铃薯淀粉废水中蛋白质由17.12g/L降低到5.84g/L，降解率达65.88％；氨氮含量由3.33g/L降低到1.16g/L，降解率达65.16％；挥发性臭味物质吲哚含量由5.14％降低到1.73％，降低了3.41％；硫化氢含量由19.39％降低到了1.79％；总的生物胺(尸胺、腐胺、色胺、组胺、亚精胺、酪胺)含量由52.352mg/L降低到6.835mg/L，减少臭味物质产生达86.94％(这里指生物胺的含量)。磷酸盐含量由1.63mg/dL上升到2.37mg/dL，提高了31.22％；腐植酸(具有肥料增效、改良土壤、刺激作物生长、改善农产品质量等功能有助于植物生长)含量由8.55mg/L上升到了11.21mg/L，提高了31.11％。挥发性气味物质变化见表2(以未添加菌株TX-L的马铃薯淀粉废水进行空白发酵作为对照)。
表2马铃薯淀粉废水挥发性臭味气味变化
Figure BDA0003527913820000051
Figure BDA0003527913820000061
实施例3恶臭假单胞菌TX-L发酵后马铃薯淀粉废水浇灌西芹
该试验采用单因素随机区组设计。设置了5个处理，分别是：采用实施例2所述方法通过菌株TX-L发酵获得的马铃薯废水发酵液，整个生育期总施用量分别为250kg/亩(W1)、500kg/亩(W2)、1000kg/亩(W3)，常规肥施用W4(尿素：硫酸钾：磷酸二铵＝30：30：30kg/亩)，以不施肥CK作为对照，每个处理重复三次。本发明同时使用了实施例2空白发酵的马铃薯淀粉废水做对照，结果为直接灌溉，会出现烧苗等情况。
芹菜全生育期为75天左右，采用平垄双行栽培，垄宽1.2m，株距30cm，每垄种3行，1垄为一个小区，小区面积为8.4m2。利用马铃薯淀粉废水发酵液/常规肥灌溉，分别在发芽期灌溉1次、幼苗期灌溉2次、叶丛生长期灌溉4次、心叶肥大期灌溉3次，全生育期共灌10次，每次等量。在试验期间，各处理芹菜的田间管理按照常规的管理方法进行。在芹菜的成熟期采集样品，测定芹菜的各指标，发现施用发酵后的马铃薯废水的W2和W3组根系长度和株高均高于常规肥施用组和对照组(见表3)；根、茎、叶的鲜重以及产量W2和W3组均高于常规肥施用组和对照组(见表4)。
表3 5个处理组对芹菜株高、根长的影响
Figure BDA0003527913820000062
注：同列数据后无相同字母表示在5％水平上(P<0.05)差异显著。
表4 5个处理组对芹菜生理指标的影响
Figure BDA0003527913820000063
Figure BDA0003527913820000071
注：同列数据后无相同字母表示在5％水平上(P<0.05)差异显著。
实施例4恶臭假单胞菌TX-L发酵后马铃薯淀粉废水浇灌线辣椒
该试验采用单因素随机区组设计。设置了6个处理，分别是：采用实例2所述方法通过菌株TX-L发酵获得的马铃薯废水发酵液进行浇灌，具体如下：600kg/亩(Q1)、900kg/亩(Q2)、1200kg/亩(Q3)、1500kg/亩(Q4)、常规施肥Q5(尿素：硫酸钾：磷酸钙＝20：10：20kg/亩)，平均分为6次进行灌溉，以不施肥CK为对照，设置3个平行。本发明还使用了实施例2空白发酵的马铃薯淀粉废水直接灌溉，会出现烧苗等情况。
试验期间，定植密度为2300株/亩，各处理辣椒植株的田间管理按照常规田间管理方法进行。在线辣椒成熟期采集样品，测定线辣椒产量和品质(可溶性糖、维生素C、可溶性固形物)，结果(见图4)发现不同马铃薯淀粉废水浇灌量的线辣椒其产量、辣椒素、可溶性糖和维生素C的含量都比对照组高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (3)

1.一株恶臭假单胞菌，其特征在于，具体为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L，保藏编号：CGMCC No.24360。
2.权利要求1所述恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L在马铃薯废水降解中的应用，其特征在于，用于降解马铃薯淀粉废水中蛋白质，同时减少臭味物质的产生。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，采用TX-L降解马铃薯废水的方法如下：
将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TX-L培养至对数生长期，按3～6％的接种量接种到马铃薯淀粉废水中，13～20℃静置发酵2～3天。
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