CN113174334B - 一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法，包括以下具体步骤：土壤采集、宿主介导筛选微生物群和构建甘蔗根际简化的细菌群落。本发明的优点：本发明所述方法为采用甘蔗介导筛选方法富集根际优势微生物，之后利用含有甘蔗根系分泌物的寡营养培养基分离对根际营养竞争能力强的菌株，再利16s rRNA基因高通量测序技术分析菌群在根际的定殖能力，构建简化的甘蔗根际细菌群落。

Description

一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法
技术领域
本发明涉及菌群筛选技术领域，具体是指一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法。
背景技术
生产上过高的化肥投入已成为我国甘蔗产业发展的重要限制因子，减少化肥施用量是甘蔗高效环保生产的根本要求。利用微生物肥料或植物根际促生菌(plan growthpromoting rhizobact-eria,PGPR)菌剂改善和保护甘蔗根际的生态环境，是减少化肥施用量最为有效的途径，甘蔗PGPR资源的挖掘和利用对甘蔗可持续发展具有重要实践意义。由于不同甘蔗品种、土壤类型、土壤理化性质以及环境因子等生态条件均可影响PGPR对甘蔗的接种效果，同时，由于甘蔗生长周期较长(1年以上)，所以获得稳定的甘蔗PGPR接种菌群，以及证明哪些菌株才是甘蔗的核心PGPR成为开发甘蔗PGPR菌剂的关键。
许多不同的标准被用于高效根际促生菌的筛选，如根据细菌分泌促生长物质(IAA、乙烯、细胞分裂素等)、产铁载体、解磷解钾功能、固氮功能等判断。然而，综合使用两种或两种以上的方法则可以获得更有效的PGPR菌株。关于植物根际促生菌的筛选，目前应用最广泛的方法是对根际土壤悬浮液中获得的大量根际细菌进行体外促生能力测定，剔除一部分菌株，保留具有促生潜力的菌株。然而此方法不仅工作量大且存在一定的局限性，往往会出现在实验室条件下有效的一些PGPR菌株回接至根际条件后却失去原有作用的现象然。为了获得具有较高定殖能力的菌株，学者们采用常规稀释平板法从植物根际筛选PGPR菌株，并提取植物种子凝集素进行复筛，获得与植物亲和性较好的菌株，利于菌株更好的定殖。但是，该方法不适合应用于甘蔗等非种子繁殖作物。
发明内容
本发明为了解决上述的各种问题，提供了一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法，从而克服甘蔗PGPR分离工作量大，筛选菌株定殖及促生长效果不稳定的缺点。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一：土壤采集
在甘蔗拔节期，采集根际土壤，小区按“Z”字形五点采样，每点选取生长健壮的4个蔗兜，采用抖根法采集根际土壤，再按四分取样法收集土壤；
步骤二：宿主介导筛选微生物群，包括以下具体步骤：
1)步骤一中采集的土壤混合后，取适量，装育苗杯；
2)取甘蔗无菌组培苗，于上述土壤中种植；期间只浇灭菌水，不做其他处理；种植15 天，将幼苗根取出，去除土壤，取10g幼苗的根在PBS缓冲液中研磨粉碎，制成根组织悬浮液；
3)用根组织悬浮液接种无菌甘蔗组培苗，并种植于1/2MES琼脂培养基中，需将所述 1/2MES琼脂培养基中的pH调节至与所采集的土壤一致，培养15天，然后通过超声清洗从幼苗根部释放细菌；
4)将甘蔗用改良的Hoagland’s1×营养液培养30天，期间每7天换液1次，培养液通气2小时，停2小时循环，培养室条件同上；进行分泌物收集前将根系用去离子水冲洗2-3次，然后移入分泌液收集瓶，中加入800mL去离子水，连续通气培养10-14小时后取出，收集培养液；用0.45μm滤膜抽滤去掉固体不溶物；根系分泌物在-80℃冷冻，后置于冷冻干燥机浓缩至粉末；将根系分泌物用无菌水溶解，使根系分泌物的终质量浓度为20mg·L-1；根系分泌物过0.22μm滤膜除菌后，置于60℃水浴预热，40mg·L-1琼脂培养基高压蒸汽灭菌后，水浴冷却至60℃，然后二者以体积比为1∶1混合，即得初筛培养基；
5)将步骤二内3)中的细菌稀释液涂在含有甘蔗根系分泌物的初筛培养基上，获得单菌落；挑取生长迅速、不同形态的单个典型菌落，即获得对根际营养竞争能力强的菌株；对菌株进行16srRNA基因测序，明确菌株分类地位；
步骤三：构建甘蔗根际简化的细菌群落，具体包括以下步骤：
1)将步骤二中选出的菌株进行培养，制成1×108个细胞/ml菌剂后，分别用浸根法接种10株无菌甘蔗苗，并种植于1/2MES琼脂培养基中，培养10天，接种灭菌水进行无菌处理；通过观察甘蔗幼苗生长情况，选择对甘蔗幼苗促生长效果好的菌株进行下步试验；
2)将上一步选出的菌株进行培养，制成1×108个细胞/ml菌剂等体积混合后，接种于 10株无菌甘蔗苗，并种植于1/2MES琼脂培养基中，培养5天取甘蔗根，采用Power
Figure GDA0003853753710000021
DNA Isolation Kit试剂盒进行植物根总基因组DNA的提取，实验方法按试剂盒的说明进行提取基因组DNA；
3)以上述提取的各样品总基因组DNA为模板，为确定PCR反应需要加入DNA的量，利用 Qubit3.0 DNA检测基因组DNA浓度；所用的引物为IonSSTMXL测序平台的V5-V7引物799F和1193R；
4)数据分析，用FLASH拼接测序的原始数据；使用Cutadapt对reads进行低质量部分剪切完成初步质控，进一步去除嵌合体序列；通过denovo识别检测并除去原始序列中的嵌合体序列，得到有效序列；有效数据用Usearch以0.97相似性聚类得到许多OTUs，从OTU中选取代表性序列与SILVA数据库进行比对，然后进行物种分类；按最小序列数随机抽平以保证结果均匀度，得到的的数据重新进行聚类和分析，然后生成OTU表进行群落结构分析；
5)简化菌群构建，根据分析结果明确各菌株在根际的定殖能力，剔除无定殖能力和定殖能力较差的菌株，最终确定根际简化微生物菌群。
优选的，所述步骤二中培养室的条件为植株在25℃下以16/8小时昼夜循环生长，相对湿度设置为80％，光照水平设置为20000lx。
优选的，所述步骤三内3)中测序使用的是Illumnia Miseq测序平台，采用PE2x250bp 进行测序。
优选的，所述步骤三内3)中引物799F的基因序列为5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’和 1193R的基因序列为5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明所述方法为采用甘蔗介导筛选方法富集根际优势微生物，之后利用含有甘蔗根系分泌物的寡营养培养基分离对根际营养竞争能力强的菌株，再利16s rRNA基因高通量测序技术分析菌群在根际的定殖能力，构建简化的甘蔗根际细菌群落。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一：土壤采集
甘蔗拔节期(6月份)采集根际土壤，小区按“Z”字形五点采样，每点选取生长健壮的 4个蔗兜，采用抖根法采集根际土壤，再按四分取样法收集土壤。
步骤二：宿主介导筛选微生物群
1)采集的土壤混合后取适量装育苗杯；
2)取甘蔗无菌组培苗种植于上述土壤中种植(培养室条件：植株在25℃下以16/8小时昼夜循环生长。相对湿度设置为80％，光照水平设置为20000lx)。期间只浇灭菌水，不做其他处理。种植15天，将幼苗根取出去除土壤，取10g幼苗的根在PBS缓冲液中研磨粉碎，制成根组织悬浮液。
3)用根组织悬浮液接种无菌甘蔗组培苗，并种植于1/2MES琼脂培养基中(pH调节至与所采集的土壤一致)，培养15天，然后通过超声清洗从幼苗根部释放细菌；
4)将甘蔗用改良的Hoagland’s(霍格兰氏)1×营养液培养30天，期间每7天换液1次，培养液通气2h，停2h循环，培养室条件同上。进行分泌物收集前将根系用去离子水(蒸馏水)冲洗2-3次，然后移入分泌液收集瓶中，加入800ml去离子水，连续通气培养10-14h 后取出，收集培养液。用0.45μm滤膜(Milipore)抽滤去掉固体不溶物。根系分泌物在-80 ℃冷冻，后置于冷冻干燥机浓缩至粉末。将根系分泌物用无菌水溶解，使根系分泌物的终质量浓度为20mg·L-1。根系分泌物过0.22μm滤膜除菌后置于60℃水浴预热，40mg·L-1 琼脂培养基高压蒸汽灭菌后水浴冷却至60℃，然后二者以体积比为1∶1混合即得初筛培养基。
5)将3)的细菌稀释液涂在含有甘蔗根系分泌物的初筛培养基上，获得单菌落。挑取生长迅速、不同形态的单个典型菌落，即获得对根际营养竞争能力强的菌株。对菌株进行16s rRNA基因测序，明确菌株分类地位。
步骤三：构建甘蔗根际简化的细菌群落
1)将选出的菌株进行培养，制成1×108个细胞/mL菌剂后分别用浸根法接种10株无菌甘蔗苗，并种植于1/2MES琼脂培养基中(pH调节至与所采集的土壤一致)，培养10天，接种灭菌水进行无菌处理。通过观察甘蔗幼苗生长情况，选择对甘蔗幼苗促生长效果好的菌株进行下步试验；
2)将上一步选出的菌株进行培养，制成1×108个细胞/ml菌剂等体积混合后接种于10 株无菌甘蔗苗。并种植于1/2MES琼脂培养基中(pH调节至与所采集的土壤一致)，培养5 天取甘蔗根，采用Power
Figure GDA0003853753710000041
NA Isolation Kit(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA,US) 试剂盒进行植物根总基因组DNA的提取，实验方法按试剂盒的说明进行提取基因组DNA；
3)以上述提取的各样品总基因组DNA为模板，为确定PCR反应需要加入DNA的量，利用 Qubit3.0 DNA检测基因组DNA浓度。所用的引物为IonSSTMXL测序平台的V5-V7引物799F(5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’)和1193R(5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’)，V5-V7可变区相对于V3-V4更适合植物内生菌菌群，能最大限度减少植物宿主DNA的影响。PCR扩增产物纯化后，扩增子委托上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。测序使用的是IllumniaMiseq测序平台，采用PE 2x250bp进行测序；
4)数据分析
用FLASH(version 1.2.3)拼接[89]Illumnia Miseq测序的原始数据。使用Cutadapt (V1.9.1)对reads进行低质量部分剪切完成初步质控，进一步去除嵌合体序列。通过de novo(V8.1.1861)识别检测并除去原始序列中的嵌合体序列，得到有效序列(CleanReads)。有效数据用Usearch(V8.1.1861)以0.97相似性聚类得到许多OTUs，从OTU中选取代表性序列与SILVA(Release 128)数据库进行比对，然后进行物种分类。按最小序列数随机抽平以保证结果均匀度，得到的的数据重新进行聚类和分析，然后生成OTU表进行群落结构分析。
5)简化菌群构建
根据分析结果明确各菌株在根际的定殖能力，剔除无定殖能力和定殖能力较差的菌株，最终确定根际简化微生物菌群。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的步骤并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的实施方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法，其特征在于:包括以下步骤：
步骤一：土壤采集
在甘蔗拔节期，采集根际土壤，小区按“Z”字形五点采样，每点选取生长健壮的4个蔗兜，采用抖根法采集根际土壤，再按四分取样法收集土壤；
步骤二：宿主介导筛选微生物群，包括以下具体步骤：
1)步骤一中采集的土壤混合后，取适量，装育苗杯；
2)取甘蔗无菌组培苗，于上述土壤中种植；期间只浇灭菌水，不做其他处理；种植15天，将幼苗根取出，去除土壤，取10g幼苗的根在PBS缓冲液中研磨粉碎，制成根组织悬浮液；
3)用根组织悬浮液接种无菌甘蔗组培苗，并种植于1/2MES琼脂培养基中，需将所述1/2MES琼脂培养基中的pH调节至与所采集的土壤一致，培养15天，然后通过超声清洗从幼苗根部释放细菌；
4)将甘蔗用改良的Hoagland’s1×营养液培养30天，期间每7天换液1次，培养液通气2小时，停2小时循环，培养室条件同上；进行分泌物收集前将根系用去离子水冲洗2-3次，然后移入分泌液收集瓶中，加入800mL去离子水，连续通气培养10-14小时后取出，收集培养液；用0.45μm滤膜抽滤去掉固体不溶物；根系分泌物在-80℃冷冻，后置于冷冻干燥机浓缩至粉末；将根系分泌物用无菌水溶解，使根系分泌物的终质量浓度为20mg·L-1；根系分泌物过0.22μm滤膜除菌后，置于60℃水浴预热，40mg·L-1琼脂培养基高压蒸汽灭菌后，水浴冷却至60℃，然后二者以体积比为1∶1混合，即得初筛培养基；
5)将步骤二内3)中的细菌稀释液涂在含有甘蔗根系分泌物的初筛培养基上，获得单菌落；挑取生长迅速、不同形态的单个典型菌落，即获得对根际营养竞争能力强的菌株；对菌株进行16s rRNA基因测序，明确菌株分类地位；
步骤三：构建甘蔗根际简化的细菌群落，具体包括以下步骤：
1)将步骤二中选出的菌株进行培养，制成1×108个细胞/ml菌剂后，分别用浸根法接种10株无菌甘蔗苗，并种植于1/2MES琼脂培养基中，培养10天，接种灭菌水进行无菌处理；通过观察甘蔗幼苗生长情况，选择对甘蔗幼苗促生长效果好的菌株进行下步试验；
2)将上一步选出的菌株进行培养，制成1×108个细胞/ml菌剂等体积混合后，接种于10株无菌甘蔗苗，并种植于1/2MES琼脂培养基中，培养5天取甘蔗根，采用Power
Figure FDA0003853753700000011
DNAIsolation Kit试剂盒进行植物根总基因组DNA的提取，实验方法按试剂盒的说明进行提取基因组DNA；
3)以上述提取的各样品总基因组DNA为模板，为确定PCR反应需要加入DNA的量，利用Qubit3.0 DNA检测基因组DNA浓度；所用的引物为IonSSTMXL测序平台的V5-V7引物799F和1193R；
4)数据分析，用FLASH拼接测序的原始数据；使用Cutadapt对reads进行低质量部分剪切完成初步质控，进一步去除嵌合体序列；通过denovo识别检测并除去原始序列中的嵌合体序列，得到有效序列；有效数据用Usearch以0.97相似性聚类得到许多OTUs，从OTU中选取代表性序列与SILVA数据库进行比对，然后进行物种分类；按最小序列数随机抽平以保证结果均匀度，得到的的数据重新进行聚类和分析，然后生成OTU表进行群落结构分析；
5)简化菌群构建，根据分析结果明确各菌株在根际的定殖能力，剔除无定殖能力和定殖能力较差的菌株，最终确定根际简化微生物菌群。
2.根据权利要求1所述的一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法，其特征在于：所述步骤二中培养室的条件为植株在25℃下以16/8小时昼夜循环生长，相对湿度设置为80％，光照水平设置为20000lx。
3.根据权利要求1所述的一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法，其特征在于：所述步骤三内3)中测序使用的是Illumnia Miseq测序平台，采用PE 2x250 bp进行测序。
4.根据权利要求1所述的一种甘蔗根际促生长细菌的简化菌群的筛选方法，其特征在于：所述步骤三内3)中引物799F的基因序列为5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’和1193R的基因序列为5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’。
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