CN114480190B

CN114480190B - 一种三叶青块根内生菌及其应用

Info

Publication number: CN114480190B
Application number: CN202210085425.1A
Authority: CN
Inventors: 洪春桃; 章建红; 沈登锋; 魏斌; 黄宗兴; 蒋笑丽
Original assignee: Ningbo Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Ningbo Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2023-05-19
Anticipated expiration: 2042-01-25
Also published as: CN114480190A

Abstract

本发明公开了一种三叶青块根内生菌及其应用，特点是该菌为四川肠杆菌6D1（Enterobacter sichuanensis 6D1），于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23610，具有产生长素、铁载体和溶磷特性，在促进三叶青块根发育方面、提高药用植物总黄酮含量方面、提高三叶青根部脂氧化酶LOX基因表达量方面和提高三叶青根部扩展蛋白Thexp基因表达量方面的应用，优点是促进三叶青块根生长和提高总黄酮含量。

Description

一种三叶青块根内生菌及其应用

技术领域

本发明属于植物益生菌制剂领域，尤其涉及一种从中药三叶青块根中分离的肠杆菌（Enterobacter）在促进三叶青块根生长和提高总黄酮含量中的应用。

背景技术

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum）为葡萄科（Vitaceae）崖爬藤属（Tetrastigma）植物，全株可入药，其中块根药效最佳，具有清热解毒、活血止痛和祛风化痰等方面的功效。现代药理学研究表明，三叶青具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎镇痛、保肝等作用，且长期应用未见毒副作用，是西药无法代替的“植物抗生素”。临床上已广泛用于肝癌、肺癌、白血病及艾滋病等疾病的治疗。由于野生三叶青对生长环境要求比较苛刻，其分布范围较小，且自然条件下生长非常缓慢，野生资源较少。近些年，因市场需求量不断增加，野生资源过度采挖，生态环境破坏严重，三叶青资源匮乏。市场上三叶青价格不断攀升，供不应求。因此三叶青人工栽培技术迅速推广，江浙地区种植面积大大增加。由于三叶青栽培时间较长，一般需种植3-5年才能采挖，且采挖劳动力等成本较大，人工栽培产量较低，因此需要进一步优化人工栽培技术，提高三叶青亩产量。

植物体内普遍存在着内生菌，研究表明植物内生菌可以分泌生长素、抗生素等代谢物质，这些代谢物质能促进植物生长或诱导植物产生抗性。因此，对植物施用植物内生菌产生的生长素、抗菌剂等，可促进植物生长、增强植物抗逆性，还能减少化学药剂对环境的污染，保证植物的产量和品质。因此研究能够促进三叶青生长内生菌，是当前解决三叶青产量低的有效途径之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有产生长素和溶磷特性的三叶青块根内生菌及其在促进三叶青块根生长和提高总黄酮含量中的应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种三叶青块根内生菌，该菌为四川肠杆菌6D1（Enterobacter sichuanensis 6D1），于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23610。该菌株为革兰氏阴性菌，在LB琼脂培养基上30℃培养24 h，菌落表面光滑，边缘整齐，为乳白色；采用Salkowski溶液显色法和铁载体检测培养基（CAS）定性检测发现该菌株具有较强产IAA和铁载体的能力；该菌株也具有较好的溶磷能力，接种于蒙金娜固体培养基上，置于30℃恒温培养箱培养5 d后，可形成透明圈。

上述三叶青块根内生菌在制备吲哚乙酸IAA方面的应用。

上述三叶青块根内生菌在制备铁载体方面的应用。

上述三叶青块根内生菌在提高土壤有效磷方面的应用。

上述三叶青块根内生菌在促进三叶青块根发育方面的应用。

上述三叶青块根内生菌在提高药用植物总黄酮含量方面的应用。

上述的三叶青块根内生菌在提高三叶青根部脂氧化酶LOX基因表达量方面的应用。

所述的三叶青根部脂氧化酶LOX基因的上下游扩增引物分别为：上游扩增引物LOX-F：5’- TCC TTC AAA GAT TCA AGC AAC A -3’；下游扩增引物LOX-R：5’- AAT GGC TTCAAG AGT TCA TAT G-3’。

上述三叶青块根内生菌在提高三叶青根部扩展蛋白Thexp基因表达量方面的应用。

优先的所述的三叶青根部扩展蛋白Thexp基因的上下游扩增引物分别为：上游扩增引物Thexp-F：5’-CCC TGG TAG ATG GCG AAC TT-3’；下游扩增引物Thexp-R：5’-AAC CGCCAC TAA TTT CTG CC-3’。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种三叶青块根内生菌及其应用，该菌株具有较强的产IAA和铁载体能力，该菌株还具有较强的溶磷能力，其溶磷圈直径和菌落直径的比值为1.8；三叶青产生长素和溶磷特性的内生菌能有效促进三叶青生长，使用该菌株作为药用植物如三叶青的益生菌添加剂，可以显著增加三叶青的生物量和总黄酮含量，诱导块根发育基因表达；本发明筛选的Enterobacter sichuanensis 6D1菌株使用后不仅可以提高三叶青块根的产量和质量，还不会有环境污染、农药残留等化学农药常见问题，具有广阔的应用前景。

综上所述，本发明从三叶青块根中分离纯化得到1株具有产生长素和溶磷特性的内生细菌（命名为6D1），其具有促进三叶青块根生长和提高总黄酮含量的作用，以期本发明能进一步提升三叶青人工栽培技术，促进三叶青产业蓬勃发展。

上述三叶青内生菌，该菌株分类命名为四川肠杆菌6D1（Enterobacter sichuanensis 6D1），于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23610，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为本发明菌株产IAA和铁载体的定性检测；

图2为本发明菌株在蒙金娜固体培养基上培养后产生的透明晕圈；

图3 为本发明菌株对三叶青组培苗植株生长的影响；

图4为本发明菌株应用对三叶青脂氧化酶和扩展蛋白基因表达的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

1、三叶青块根内生细菌的分离纯化

取新鲜无病害的三叶青植物块根，先用流水冲洗30~60 min，70%乙醇浸泡1 min，再用含2~3滴吐温-20的0.1wt%氯化汞溶液浸泡15 min，期间不断摇动，最后用无菌水清洗5次，用无菌滤纸吸干水分备用。在超净工作台中，用灭菌剪刀将块根剪碎，加入1 mL无菌磷酸缓冲液于无菌研钵中研磨成匀浆，吸取100 μL涂布于LB固体培养基上，于30℃倒置培养1~2 d至菌落长出，挑取颜色、大小或形态不同的菌落在LB固体培养基表面划线纯化2次，共获得15株菌株。采用Salkowski溶液显色法和铁载体检测培养基（CAS）定性检测以上15种菌株产吲哚乙酸IAA和铁载体能力，筛选出一株产IAA和铁载体能力较强的菌株6D1用于后续实验（图1）。

所用的LB固体培养基配方为：酵母提取物 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L和氯化钠10g/L，琼脂粉15 g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0；Salkowski显色溶液配方为：将30 ml的浓硫酸溶于50 mL水中，再加入1.5 mL 0.5 mol/L FeCl₃·6H₂O溶液；所述的CAS培养基配方为：铬天青S 0.0605 g/L，十六烷基三甲基溴化铵0.0729 g/L，10 mL 1 mM FeCl₃, 50 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液，琼脂粉15 g/L，其余为蒸馏水。

产IAA定性检测方法为：将分离纯化后的菌株接种于L-色氨酸浓度为100 mg/L的LB液体培养基中，30℃、180 r/min条件下摇床培养24 h。取50 μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入等量Salkowski显色液进行显色反应，以加入50 μL培养基作为阴性对照。白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30 min后观察，颜色变红者表示能够产IAA。颜色越深，表示分泌的量越大，不变色为阴性，表示不能分泌IAA。产铁载体定性检测方法为：分离纯化后的菌株接种到LB液体培养基中，置于37±2℃的恒温摇床，180~220 rpm培养12 h。然后用移液器取5 μL培养液接种于CAS平板的中心，于37±2℃恒温培养箱倒置培养3~5天。若菌落周围出现橘黄色透明晕圈，表明有铁载体产生，透明晕圈越大，表示分泌量越大。经测定发现5种菌株有产IAA和铁载体能力，其定性检测结果见表1。

表1. 三叶青块茎内生细菌分泌吲哚乙酸和铁载体的能力

注：+表示产IAA和铁载体能力低；++表示产IAA能力较高；+++表示产IAA和铁载体能力最高；-表示无此能力。

2、较强产IAA和铁载体菌株6D1溶磷能力测定

将6D1菌株接种到LB液体培养基中，置于37±2℃的恒温摇床，180~220 rpm培养12h。然后用移液器取5 μL培养液接种于蒙金娜固体培养基平板的中心，于37±2℃恒温培养箱倒置培养3~5天，于菌落周围发现透明晕圈，用透明晕圈直径与菌株直径比值表示该菌株的溶磷能力，其比值约为1.8（图2）。

所用的LB液体培养基配方为：酵母提取物 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L和氯化钠10g/L，蒸馏水1000毫升，pH 7.0；蒙金娜固体培养基配方为：葡萄糖10 g/L，FeSO₄·6H₂O 0.03g/L，MgSO₄·6H₂O 0.3 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L，MnSO₄·6H₂O0.03 g/L，Ca₃(PO₄)₂ 5.0 g/L，蒸馏水1000 mL，pH 7.2~7.4。

3、本发明菌株的鉴定

16S rDNA 基因的PCR扩增：将6D1菌株的发酵液用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'；1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3'。

PCR反应体系为(20 μL)：模板2 μL，kodaq 2×PCR MasterMix (Cat. No. G497，Abm，Canada)10 μL，引物1 0.5 μL，引物2 0.5 μL，ddH₂O 7 μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，其条带为1500 bp 左右，然后割胶回收纯化后送上海生工公司测序，测得16S rDNA序列为1387 bp。将该序列提交到EZBioCloud比对后发现，模式菌株Enterobacter sichuanensis WCHECl1597(T)的相似度为99.71%。因此，将该6D1菌株命名为四川肠杆菌6D1（Enterobacter sichuanensis 6D1），于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23610。

4、利用上述6D1菌株制备菌剂

将保藏号为CGMCC No.23610的菌株接种到LB液体培养基中进行种子培养，然后将种子液以2.0%的接种量接种到LB培养液中，在30℃、180 r/min条件下摇床培养24 h获得发酵液，即为菌剂。菌剂中6D1促生菌浓度为2.0×10⁸~1.0×10⁹ CFU/mL。所用的LB液体培养基配方为：酵母提取物 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L和氯化钠10 g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

实施例2

1、利用上述实施例1获得的菌剂应用于三叶青盆栽试验

采用大小一致的无菌组培三叶青幼苗测定菌剂应用对三叶青的促生作用，组培幼苗用无菌水洗掉粘在根部的琼脂，然后将幼苗根部全部浸泡在稀释10倍实施例1中的菌剂中（活菌浓度约为10⁸ CFU/mL），对照组用稀释10倍的无菌LB培养基浸泡，浸泡20 min后栽种于装有灭菌土的盆钵中，每个处理10盆，每盆1株幼苗，培养10 d后，用同浓度菌剂灌根1次，培养20 d后连根拔出，统计根长、株高和鲜重。结果表明添加菌剂的三叶青生长更好（图3），其根长、株高和鲜重显著高于对照组，分别为对照组的1.8、2.4和2.1倍。其中三叶青组培幼苗生长于琼脂培养基中，配方为：1/2MS+0.5mg/L IBA；所述的LB培养基配方为：酵母提取物 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L和氯化钠10 g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.0。

2、三叶青总黄酮含量的测定

剪取步骤1中三叶青幼苗的叶片，于-50℃真空冷冻干燥，用超微粉碎机进行粉碎。准确称取0.1g，按1:25（g/mL）料液比加入70%乙醇溶液，超声提取2次，每次超声温度为50℃，时间为25min，合并提取液，离心，取上清液测定总黄酮含量。吸取0.1 mL上清液，置于10mL容量瓶中，加入5wt% NaNO₂溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加10wt% AlCl₃溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加4wt% NaOH溶液4.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀放置15 min，于500nm处测定吸光度，并根据标准曲线计算总黄酮含量。制定的标准曲线公式为：y=0.0057x+0.0336，R²=0.9973。根据以上方法测得对照组叶片总黄酮含量为3.50%，而菌剂组总黄酮含量为4.78%，比对照组显著提高36.6%。

3、三叶青块根发育基因表达的测定

取步骤1中栽培40 d的三叶青幼苗的根，利用RNAiso Plus 试剂（TakaraBiotech, Shiga, Japan）提取样品RNA，检测合格后，用NEBNext^® UltraTM RNA LibraryPrep Kit for Illumina^®（NEB, MA, USA）试剂盒逆转录获得cDNA。以actin基因作为内参，引物为actin-F（5’-GCC CTT GAC TAT GAG CAG GA-3’）和actin-R（5’-GAA AAG GAC TTCAGG GCA GC-3’），计算三叶青脂氧化酶LOX和扩展蛋白Thexp基因的表达量，LOX基因扩增引物为LOX-F（5’- TCC TTC AAA GAT TCA AGC AAC A -3’）和LOX-R（5’- AAT GGC TTC AAGAGT TCA TAT G-3’）；Thexp基因扩增引物为Thexp-F（5’-CCC TGG TAG ATG GCG AAC TT-3’）和Thexp-R（5’-AAC CGC CAC TAA TTT CTG CC-3’）。分析试剂采用 SYBR Primix ExTaq kit（DRR420, Takara）定量试剂盒。定量 RT-PCR 分析用罗氏公司的LightCycler ®480 System Real Time PCR 扩增仪，PCR 反应条件为：变性：95℃ 30 s（升温速率 4.4℃/s）1 cycle；PCR（定量分析）：95℃ 5 s （升温速率 4.4 ℃/s），60 ℃ 30 s （升温速率2.2℃/s，Acquisition Mode : Single 40 cycles；融解（融解曲线）：95℃ 5 s（升降温速率4.4 ℃/s），60℃ 1 min（升降温速率 2.2℃/s），95℃（升降温速率 0.11℃/s，AcquisitionMode : Continuous，Acquisitions：5 per ℃ 1 循环；降温：50℃ 30 s（升降温速率 2.2℃/s）1 循环。相对基因表达水平采用 2 ^-ΔΔCT 的方法计算得到。结果表明，菌剂添加40 d后，三叶青根部脂氧化酶LOX和扩展蛋白Thexp基因表达量显著高于对照组，分别为对照组的8.56和2.0倍（图4）。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波市农业科学研究院

<120> 一种三叶青块根内生菌及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213>三叶青根部脂氧化酶LOX基因上游扩增引物LOX-F（5’- TCC TTC AAA GATTCA AGC AAC A -3’）

<400> 1

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>三叶青根部脂氧化酶LOX基因下游扩增引物LOX-R（5’- AAT GGC TTC AAGAGT TCA TAT G-3’）

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>三叶青根部扩展蛋白Thexp基因上游扩增引物Thexp-F（5’-CCC TGG TAGATG GCG AAC TT-3’）

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>三叶青根部扩展蛋白Thexp基因下游扩增引物Thexp-R（5’-AAC CGC CACTAA TTT CTG CC-3’）

<400> 4

<210> 5

<211>20

<212> DNA

<213> actin-F序列（5’-GCC CTT GAC TAT GAG CAG GA-3’）

<400>5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> actin-R序列（5’-GAA AAG GAC TTC AGG GCA GC-3’）

<400> 6

Claims

1.一种三叶青块根内生菌，其特征在于该菌为四川肠杆菌6D1(Enterobactersichuanensis6D1)，于2021年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23610。

2.一种根据权利要求1所述的三叶青块根内生菌在促进三叶青块根发育方面的应用。

3.一种根据权利要求1所述的三叶青块根内生菌在提高药用植物总黄酮含量方面的应用。

4.一种根据权利要求1所述的三叶青块根内生菌在提高三叶青根部扩展蛋白Thexp基因表达量方面的应用，其特征在于所述的三叶青根部扩展蛋白Thexp基因的上下游扩增引物分别为：上游扩增引物Thexp-F：5’-CCCTGGTAGATG GCGAACTT-3’；下游扩增引物Thexp-R：5’-AACCGCCACTAATTTCTGCC-3’。