CN111187732B - 一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物枯萎病防治技术领域，公开了一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11，为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，菌种保藏号为CGMCC No.17804。所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11 16S rRNA基因序列为SEQ ID No.1。从河南省桐柏山自然保护区土壤样品中分离、纯化，并采用对峙培养法筛选获得1株对苦瓜枯萎病具有良好生防效果的生防细菌，通过形态观察、生理生化特性分析及16S rRNA基因序列分析对其进行分类鉴定，并进行离体叶片、盆栽试验和田间试验的生防效果测定，田间防治效果70％以上，为其进一步的开发利用提供理论依据。

Description

一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用

技术领域

本发明属于植物枯萎病防治技术领域，尤其涉及一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用。

背景技术

苦瓜是重要的保健蔬菜之一，在我国广泛种植，具有较高的经济效益。近年来，随着苦瓜种植面积的不断增大，重茬连作现象也十分普遍，苦瓜枯萎病害发生和危害日趋严重，一般病株率10％～20％，严重时高达80％以上，造成大量减产甚至绝收。目前，苦瓜枯萎病在我国各苦瓜种植区均有发生，特别是在连作土壤，由于病原菌大量积累，且缺乏有效的防控措施，给苦瓜生产带来巨大的损失，因此，苦瓜枯萎病已成为制约苦瓜产业发展的主要因素。

苦瓜枯萎病的防治措施主要依赖抗病品种的选育与利用和化学防治。抗病品种选育和利用是农作物枯萎病防治最经济有效的防治措施，但由于抗病品种选育周期长，且苦瓜枯萎病为典型的土传病害，生产上至今尚无实用的抗病品种大面积推广；化学防治是目前生产上最常用的防治手段，但是由于化学防治容易产生环境污染、“3R”和“3致”等生产和食品安全问题，因此其应用在苦瓜枯萎病综合防控上受到一定的限制。生物防治因其环境兼容性良好、防治效果持久，且能跟土壤处理等农业防治措施配合使用，已成为枯萎病防治综合治理的基础和有效途径。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前生产上防治苦瓜枯萎病的化学农药不合理和过量使用造成的农药残留、环境污染等生产和食品安全问题尤为严重。

解决上述技术问题的意义：通过平板对峙、盆栽和小区试验等方法鉴定了一株对苦瓜枯萎病具有稳定高效生防效果的生防菌株CYB11。该菌株在有效防治苦瓜枯萎病的同时，可以促进苦瓜生长、提高苦瓜的抗病能力，是一种具有重要应用潜力的生防菌株，为苦瓜枯萎病的绿色防控提供了新的生防资源和防控途径。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用。

本发明是这样实现的，一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11，为不动杆菌(Acinetobactersp.)，菌种保藏号为CGMCC No.17804。

进一步，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11 16S rRNA基因序列为SEQ IDNO.1。

本发明的另一目的在于提供一种所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法包括以下步骤：

第一步，在直径为9cm的PDA平板中央接入1块直径为5mm的苦瓜枯萎病菌(SD-1)菌饼；

第二步，同时用接种环蘸取细菌在平板边缘2cm处对称划线，在28℃培养箱中倒置培养7d，重复3次。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株防治苦瓜枯萎病的使用方法。

本发明的另一目的在于提供一种所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的及离体叶片检测方法。

所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的检测方法生防菌对离体苦瓜叶片的生防效果测定：取托盘若干，84消毒液处理之后，用湿润的灭菌吸水纸铺满托盘底部。选取健康的苦瓜叶片从叶柄处剪断，70％的酒精消毒处理之后，无菌水冲洗 3遍，摆放于托盘中；取发酵48h后的细菌发酵液在叶柄处用移液枪滴加200μL；取培养5d的苦瓜枯萎病菌(SD-1)用直径为5mm的打孔器打孔若干，放置于苦瓜叶柄处，叶柄处菌块上覆盖吸水纸用于固定菌块，用保鲜膜覆盖托盘，每处理5个重复。

种子催芽处理：选用颗粒饱满的苦瓜种子，在55℃恒温水浴锅中浸泡15min 后，放入清水中浸泡12h，而后移入用滤纸保湿的培养皿中，置于28℃恒温培养箱催芽培养48h，每天定时更换润湿的滤纸以保证种子萌发所需要的水分；苦瓜种子露白后，播种于盆栽小盆中，放置在光照培养箱培养，待幼苗长出4 片真叶时备用。

进一步，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的检测方法病原菌孢子悬浮液的制备：将3块5mm直径的苦瓜枯萎病菌(SD-1)菌饼接入装有150mLPDB的 250mL锥形瓶中，28℃恒温150r/min振荡培养7d，过滤后得到孢子悬浮液，用血球计数板计数，配制成孢子浓度为10⁸个/mL的菌悬液；

生防菌菌悬液的制备：将培养3d的生防菌单菌落接入到装有150mLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，28℃恒温150r/min振荡培养2d，得到细菌菌悬液；

进一步，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株的检测方法以苦瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌和小麦全蚀病菌为靶标菌，将CYB11生防菌株进行抗菌谱测定；

验证生防菌对苦瓜枯萎病的生防效果，取苦瓜幼苗的第2和第3片真叶进行离体接种生防效果测定；

选取生长状况良好且一致的长出4片真叶的苦瓜幼苗分为5组，每组4株，空白对照组，不作处理；生防菌处理组:吸取10mL生防菌菌悬液处理活体苦瓜盆栽，24h后用10mL病原菌(SD-1)孢子悬浮液SD-1作同样处理；结果显示在发病前期、中期和后期，生防菌株CYB11对苦瓜枯萎病有良好的生防效果。

综上所述，本发明的优点及效果为：本发明利用LB培养基对采集自河南省桐柏山自然保护区的15份土壤样品中的细菌进行了分离纯化，以苦瓜枯萎病菌为靶标，通过平板对峙培养法筛选对其有拮抗活性的生防菌株，并以玉米大斑病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌和小麦全蚀病菌等植物病原菌进行抗菌谱测定，通过形态学、生理生化测定和16SrRNA基因序列分析对生防菌株进行了分类鉴定。本发明对菌株防治苦瓜枯萎病生防效果的离体叶片检测为界内首创。

结果表明，生防菌株CYB11对苦瓜枯萎病菌有稳定的拮抗活性；生理生化指标的测定结果表明，CYB11菌株不能分解纤维素，有较好的耐盐性(3％)，不能氧化葡萄糖，可还原硝酸盐，不还原亚硝酸，不能液化明胶，不能分解淀粉，可利用蔗糖、麦芽糖和山梨醇；分类鉴定结果表明，生防菌株CYB11为不动杆菌(Acinetobactersp.)。对该菌株进行离体叶片、盆栽试验和田间试验的生防效果测定，离体叶片生防效果明显，盆栽试验促生防病效果显著，田间防治效果达70％以上，为其进一步的开发利用提供有效的理论依据。

附图说明

图1是本发明实施例提供的防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法流程图。

图2是本发明实施例提供的生防菌CYB11的菌落形态图。

图3是本发明实施例提供的生防菌株CYB11对病原菌抑菌谱的测定结果示意图。

图4是本发明实施例提供的生防菌株CYB11对离体苦瓜叶片的生防效果测定结果示意图。

图5是本发明实施例提供的防菌株CYB11对盆栽苦瓜的促生防病效果测定结果示意图；

图中：(a)接SD-1后20d苦瓜生长情况；(b)接SD-1后22d苦瓜生长情况；(c)接SD-1后25d苦瓜生长情况。

图6是本发明实施例提供的生防菌株CYB11处理后苦瓜株高的测定结果示意图。

图7是本发明实施例提供的生防菌株CYB11基于16SrRNA基因序列构建的Neighbour-Joining系统进化树示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株、筛选方法及其应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的防治苦瓜枯萎病的生防菌株CYB11，于2019年5月 13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳北区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.17804；分类命名为不动杆菌(Acinetobactersp.)；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心于2019年5月13日收到，并登记入册；由2019年5月 13日起保藏三十年；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心于2019年 5月13日检测，检测结果为存活。

如图1所示，本发明实施例提供的防治苦瓜枯萎病的生防菌株的筛选方法包括以下步骤：

S101：在直径为9cm的PDA平板中央接入1块直径为5mm的苦瓜枯萎病菌菌饼；

S102：同时用接种环蘸取细菌在平板边缘2cm处对称划线(约3cm)，在 28℃培养箱中倒置培养7d，重复3次。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1

本发明实施例利用LB培养基对采集自河南省桐柏山自然保护区的15份土壤样品中的细菌进行了分离纯化，以苦瓜枯萎病菌为靶标，通过平板对峙培养法筛选对其有生防活性的菌株，并以玉米大斑病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌和小麦全蚀病菌等病原菌进行抗菌谱测定，通过形态学、生理生化测定和16SrRNA基因序列分析对生防菌株进行了分类鉴定，具体包括以下步骤：

第一步，土壤中细菌的分离：分别取采自河南省桐柏山自然保护区的15份土壤样品于自然条件下风干，取风干后的土壤各10g置于研钵中，研磨成粉末后加入装有90mL灭菌无菌水的250mL锥形瓶中，放置在摇床上150r/min震荡30min，取出静置待土壤颗粒沉淀。取溶液上清1mL加入装有9mL无菌水的试管中，梯度稀释后，选取10^-3和10^-4稀释度的溶液涂布于LB培养皿中，每个皿接种200μL，每个梯度3个重复，将培养皿于28℃倒置培养后，根据菌落颜色、形状挑取不同的细菌划线于LB培养基上纯化，按照常规的方法保存。

第二步，生防菌株的筛选：苦瓜枯萎病菌生防菌的筛选采用平板对峙培养法。在直径为9cm的PDA平板中央接入1块直径为5mm的苦瓜枯萎病菌(SD-1) 菌饼，同时用接种环蘸取细菌在平板边缘2cm处对称划线(约3cm)，在28℃培养箱中倒置培养7d，重复3次。

第三步，生防菌对离体苦瓜叶片的生防效果测定：取托盘若干，84消毒液处理之后，用湿润的灭菌吸水纸铺满托盘底部。选取健康的苦瓜叶片从叶柄处剪断，70％的酒精消毒处理之后，无菌水冲洗3遍，摆放于托盘中。取发酵48h 后的细菌发酵液在叶柄处用移液枪滴加200μL。取培养5d的苦瓜枯萎病菌 (SD-1)用直径为5mm的打孔器打孔若干，放置于苦瓜叶柄处，叶柄处菌块上覆盖吸水纸用于固定菌块，用保鲜膜覆盖托盘，每处理5个重复。

第四步，种子催芽处理:选用颗粒饱满的苦瓜种子，在55℃恒温水浴锅中浸泡15min后，放入清水中浸泡12h，而后移入用滤纸保湿的培养皿中，置于28℃恒温培养箱催芽培养48h，每天定时更换润湿的滤纸以保证种子萌发所需要的水分。苦瓜种子露白后，播种于盆栽小盆中，放置在光照培养箱培养，待幼苗长出4片真叶时备用。

第五步，病原菌孢子悬浮液的制备：将3块5mm直径的苦瓜枯萎病菌(SD-1) 菌饼接入装有150mLPDB的250mL锥形瓶中，28℃恒温150r/min振荡培养7 d，过滤后得到孢子悬浮液，用血球计数板计数，配制成所需浓度。

第六步，生防菌菌悬液的制备：将培养3d的生防菌单菌落接入到装有150 mLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，28℃恒温150r/min振荡培养2d，得到细菌菌悬液。

第七步，用稀释涂布平板法，在生长3～5d后的平板上挑取单菌落。纯化后，共获得128株细菌菌株。通过平板对峙法，经过初筛和复筛得到一株对苦瓜枯萎病菌生防效果稳定的菌株CYB11，并对其进行深入研究，其菌落形态如图2所示。

第八步，以苦瓜枯萎病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌、辣椒疫霉病菌和小麦全蚀病菌为靶标菌，将CYB11生防菌株进行抗菌谱测定。结果表明(图3，CYB11菌株对稻瘟病菌、玉米大斑病菌和苦瓜枯萎病菌具有明显拮抗活性，对其他病原菌无明显抑菌效果。

第九步，为了进一步验证生防菌对苦瓜枯萎病的生防效果。取苦瓜幼苗的第2和第3片真叶进行离体接种生防效果测定。结果显示如图4所示，与只接种苦瓜枯萎病菌(SD-1)相比，用生防菌株CYB11处理的苦瓜叶片接种苦瓜枯萎病菌后发病情况明显降低，乃至不表现症状。说明生防菌株CYB11对苦瓜枯萎病有良好的生防效果。

选取生长状况良好且一致的长出4片真叶的苦瓜幼苗分为5组，每组4株，空白对照组，不作处理；生防菌处理组:吸取10mL生防菌菌悬液处理活体苦瓜盆栽，24h后用10mL病原菌(SD-1)孢子悬浮液作同样处理。结果显示在发病前期、中期和后期，生防菌株CYB11对苦瓜枯萎病有良好的促生防病效果，防病效果见图5，促生效果见图6。

将CYB11菌株进行生理生化指标的测定，结果表明，CYB11菌株有较好的耐盐性(3％)，可利用蔗糖、麦芽糖和山梨醇。

16SrRNA基因序列分析：采用CTAB法提取分离的细菌基因组DNA并对其PCR扩增，扩增引物及程序见表1。25μL反应体系：2×PCRmix12.5μL、引物27F(10μmol/L)1μL、引物1492R(10μmol/L)1μL、DNA模板1μL、无菌水9.5μL。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。将阳性结果的PCR产物交由生物工程公司进行测序。将分离菌株的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，确定与之亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的16SrRNA基因序列，用MEGA7软件构建系统发育树，采用邻接法(Neighbor-Joining)进行聚类分析并构建系统进化树。

测序获得的CYB11 16S rRNA基因序列如下所示SEQ ID No.1：

CAAGTCGAGCGGAGTGATGGTGCTTGCACTATCACTTAGCGGCGGAC GGGTCGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTTCGA AAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTC GGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGT AAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGC CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGG GGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGA AGTTAATACCTTTAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAA CTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATT TACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCC CCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGA GAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAG GAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTG CGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGT AAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTA ACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAA ATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAT GCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATAGTAAGAACTTTCCAGAG ATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC AGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT TTCCTTATTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTG ACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGG CCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAG CGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGC AACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGA GTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGCTTACCC A

将获得16SrRNA基因序列上传至NCBI数据库(登录号为：MK955483)，将该序列与其相似序列采用MEGA7软件按照邻接法构建其系统进化树，结果如图六所示，CYB11菌株与不动杆菌(Acinetobacterkyonggiensis)最相似，将 CYB11鉴定为不动杆菌(Acinetobactersp.)。

实施例2：生防菌株CYB11对苦瓜枯萎病防治效果试验

生防菌株CYB11的防治效果试验于2019年4月至7月在河南农业大学原阳实验基地实施，试验面积约667m²，连续4年连茬。2019年4月25日施用底肥包括鸡粪60Kg，复合肥(N:P:K＝15:15:15)25Kg，钙镁磷肥15Kg，5月2 日定植新翠苦瓜苗。苦瓜育苗、定植及管理按照当地常规栽培管理。试验设处理和对照组，各3个重复，共6个小区。处理时，菌体浓度为10⁸CFU/mL的生防菌株CYB1菌悬液灌入定植苗根部周围，每株用量100mL，覆土后正常浇注定植水；为了保证防治效果，于苦瓜生长30d时，用同样浓度的菌悬液以每株 100mL的用量再灌根一次。对照组用清水代替生防菌株CYB11，其他操作与处理组相同。试验数据的采集采用5点取样法，定点(株)观察植株的生长情况，统计苦瓜枯萎病发病率和防治效果。发病率(％)＝发病株数/调查总株数*100％。防治效果(％)＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率*100％。

表1 生防菌株CYB11对苦瓜枯萎病的防治效果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 文才艺，赵莹，赵玉华，王留超，董文盼，祁魏峥

<120> 一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caagtcgagc ggagtgatgg tgcttgcact atcacttagc ggcggacggg tcgagtaatg 60

cttaggaatc tgcctattag tgggggacaa catttcgaaa ggaatgctaa taccgcatac 120

gtcctacggg agaaagcagg ggatcttcgg accttgcgct aatagatgag cctaagtcgg 180

attagctagt tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga tctgtagcgg gtctgagagg 240

atgatccgcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300

aatattggac aatgggcgca agcctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggcctta 360

tggttgtaaa gcactttaag cgaggaggag gctactgaag ttaatacctt tagatagtgg 420

acgttactcg cagaataagc accggctaac tctgtgccag cagccgcggt aatacagagg 480

gtgcaagcgt taatcggatt tactgggcgt aaagcgcgcg taggcggcta attaagtcaa 540

atgtgaaatc cccgagctta acttgggaat tgcattcgat actggttagc tagagtgtgg 600

gagaggatgg tagaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg 660

atggcgaagg cagccatctg gcctaacact gacgctgagg tgcgaaagca tggggagcaa 720

acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg tctactagcc gttggggcct 780

ttgaggcttt agtggcgcag ctaacgcgat aagtagaccg cctggggagt acggtcgcaa 840

gactaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 900

cgatgcaacg cgaagaacct tacctggcct tgacatagta agaactttcc agagatggat 960

tggtgccttc gggaacttac atacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttttcct tatttgccag cgagtaatgt 1080

cgggaacttt aaggatactg ccagtgacaa actggaggaa ggcggggacg acgtcaagtc 1140

atcatggccc ttacggccag ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca aagggttgct 1200

acctagcgat aggatgctaa tctcaaaaag ccgatcgtag tccggattgg agtctgcaac 1260

tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gaatgccgcg gtgaatacgt 1320

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt ttgttgcacc agaagtaggt 1380

agtctaaccg caaggaggac gcttaccca 1409

Claims (2)

1.一种防治苦瓜枯萎病的生防菌株，其特征在于，所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株，为不动杆菌(Acinetobacter sp.)CYB11，菌种保藏号为CGMCC No.17804。

2.一种利用权利要求1所述防治苦瓜枯萎病的生防菌株制造的菌剂。

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