CN108220211A

CN108220211A - 一株嗜油不动杆菌nmb17及其在植物病害防治中的应用

Info

Publication number: CN108220211A
Application number: CN201810282989.8A
Authority: CN
Inventors: 叶健; 姚香梅; 龚雨晴; 赵启祥
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS; University of Chinese Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS; University of Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2018-04-02
Publication date: 2018-06-29
Anticipated expiration: 2038-04-02
Also published as: CN108220211B

Abstract

本发明公开了一株嗜油不动杆菌NMB17及其在防治植物病害和贮藏霉菌中的应用。本发明提供了一株嗜油不动杆菌NMB17，并制备了微生物NMB17菌剂、发酵液和代谢液。通过实验证明：本发明的嗜油不动杆菌NMB17或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物能够广谱、高效防治植物病害和贮藏霉菌，不仅可以提高植物对植物土传病害和贮藏霉菌的抵抗能力，也解决了农药残留和环境污染等问题，有利于促进环境保护及农业可持续发展，具有较好的应用前景。

Description

一株嗜油不动杆菌NMB17及其在植物病害防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株嗜油不动杆菌NMB17及其在植物病害防治中的应用。

背景技术

植物土传病害多为土壤习居菌，这些土传病害都有寄主范围广、抗逆性强、难以根除等特点，对复合侵染防治尤其困难。生产中往往既缺乏优良的抗病品种，又缺乏有效的化学防治药剂。

植物根腐病、棉花黄萎病等是一种土壤和种子传播的具有广泛寄主的系统病害，同时也是引起农作物发病的典型的土传病害，其主要的致病菌包括镰刀菌(Fusarium)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)等病原真菌，这些病原真菌能产生大量微菌核，在土壤中存活时间长，病菌又可以常年累积，导致发病范围广且几率高，流行性强，防治难度大，给该病害的有效防治带来很多困难，每年对我国作物生产造成巨大的经济损失。另外，农产品在成熟采摘后贮藏中，其本身仍携带多种微生物，这些微生物中的一些病原菌在合适的环境条件下，在运输和贮藏过程中都会再次生长爆发，导致蔬菜、水果以及粮食和烟草等在仓储过程发生腐烂、霉变。腐烂和霉变不仅导致农产品本身的损耗，而且还严重影响了外观品质和质量，降低了其使用价值，严重的甚至将影响人类健康。

国内外研究学者在预防、治理植物土传病害、以及物品的贮藏和运输方面做了大量工作。目前对植物土传病害的防治主要是利用抗病品种、农业措施和使用化学药剂等，但防治效果均不理想，特别是化学农药的使用，不仅使病原菌产生抗药性而且对人类健康也会造成危害。随着绿色农业、有机农业的兴起，对土传病害的生物防治研究中，利用生物防治根腐病、棉花黄萎病和贮藏发霉腐烂等备受人们关注。将细菌作为生防材料主要是利用其强有力的竞争作用，目前应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)、放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)等。这些生防菌往往同时产生多种对特定病原菌具有很高活性的抑菌物质，包括大分子拮抗蛋白、小分子抗生素和细菌素等。因此开展以生物防治为主导的综合防治措施研究，对植物病害防治具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans NMB17。

本发明提供的嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans NMB17的保藏编号为CGMCC No.15435。

本发明提供的嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans NMB17的分类命名为嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans，该菌株已于2018年03月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.15435。

本发明的另一个目的是提供嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物的新用途。

本发明提供了嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物在如下1)-12)中任一种应用：

1)防治植物土传病害；

2)制备防治植物土传病害的产品；

3)抗菌和/或抑菌；

4)制备抗菌和/或抑菌的产品；

5)提高植物对土传病害的抵抗能力；

6)制备提高植物对土传病害的抵抗能力的产品；

7)降低土壤和/或棉花根系中棉花黄萎病病原菌含量；

8)制备降低土壤和/或棉花根系中棉花黄萎病病原菌含量的产品；

9)防治贮藏霉菌；

10)制备防治贮藏霉菌的产品；

11)提高农产品对贮藏霉菌的抵抗能力；

12)制备提高农产品对贮藏霉菌的抵抗能力的产品。

本发明的另一个目的是提供一种产品；所述产品具有如下1)-6)中任一种功能：

1)防治植物土传病害；

2)抗菌和/或抑菌；

3)提高植物对土传病害的抵抗能力；

4)降低土壤和/或棉花根系中棉花黄萎病病原菌含量；

5)防治贮藏霉菌；

6)提高农产品对贮藏霉菌的抵抗能力。

本发明提供的产品的活性成分为嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物。

上述应用或产品中，所述植物土传病害可为黄萎病和/或根腐病。所述黄萎病为大丽轮枝菌侵染引起的黄萎病，如棉花黄萎病，具体可为棉花落叶型黄萎病。所述根腐病为镰刀菌侵染引起的根腐病。

上述应用或产品中，所述菌为真菌；所述真菌具体可为落叶型棉花黄萎病菌和/或木贼镰刀菌和/或尖孢镰刀菌和/或谢瓦氏曲霉和/或疣梗曲霉和/或赤曲霉。

上述应用或产品中，所述贮藏霉菌可为蔬菜、水果、粮食和烟草等上的霉变病菌，具体可为谢瓦氏曲霉和/或疣梗曲霉和/或赤曲霉。

上述应用或产品中，所述落叶型棉花黄萎病菌具体为落叶型棉花黄萎病V991菌株；所述木贼镰刀菌具体为木贼镰刀菌NMF6；所述尖孢镰刀菌具体为尖孢镰刀菌NMF8菌株；所述谢瓦氏曲霉具体为谢瓦氏曲霉FJF-3菌株；所述疣梗曲霉具体为疣梗曲霉FJF-4菌株；所述赤曲霉具体为赤曲霉FJF-6菌株。

本发明还有一个目的是提供一种防治植物土传病害的方法。

本发明提供的防治植物土传病害的方法包括用嗜油不动杆菌Acinetobacterolevorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物处理植物幼苗的步骤。

本发明最后一个目的是提供一种防治贮藏霉菌的方法。

本发明提供的防治贮藏霉菌的方法包括用嗜油不动杆菌Acinetobacterolevorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物处理农产品的步骤。

上述应用或产品或方法中，所述嗜油不动杆菌Acinetobacter olevorans为嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans NMB17CGMCC No.15435。

上述应用或产品或方法中，

所述NMB17菌剂的制备方法如下：将嗜油不动杆菌NMB17接种于LB培养基中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体沉淀，再用灭菌水将所述菌体沉淀进行稀释，即得到NMB17菌剂。

所述NMB17发酵液的制备方法如下：将嗜油不动杆菌NMB17接种于LB培养液中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，收集上清液，即得到NMB17发酵液。

所述NMB17代谢液的制备方法如下：将NMB17发酵液经过0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即得到NMB17代谢液。

本发明提供了一株可防治植物土传病害和贮藏霉菌的嗜油不动杆菌NMB17。通过实验证明：NMB17发酵液对棉花落叶型黄萎病V991的抑菌效果为89.40％，1.5cm和2.5cm距离处的抑菌圈效果分别为45.69％和32.49％，在第7、9和14天的抑菌率分别为58.22％、57.27％和72.67％，而大肠杆菌E.coli对此真菌病害在第7、9和14天的抑菌率分别只有31.25％、31.12％和28.33％。NMB17菌剂处理棉花幼苗后能够诱导棉花植株对黄萎病的抗性，其抑制效果表现为对照组的棉花病情指数为97.5％，而处理组棉花病情指数仅为61.68％，病原真菌在处理组和对照组的土壤中的含量分别为0.23和0.90，而在处理组和对照组的根系中病原真菌DNA的含量分别为0.59和1.65，具有显著性差异。同时对处理组和对照组土壤和根系中细菌和真菌相对量进行检测，NMB17菌剂加入后不影响土壤微生物多样性。NMB17发酵液对木贼镰刀菌NMF6和尖孢镰刀菌NMF8的抑菌率分别为75.29％和31.49％，对星油藤镰刀菌FoPVo1的抑菌率为15.91％。对谢瓦氏曲霉FJF-3、疣梗曲霉FJF-4和赤曲霉FJF-6的抑菌率分别为45.18％，41.05％和12.23％。本发明提供的NMB17菌剂或NMB17发酵液或NMB17代谢液作为一种生物源农药，具有广谱、高效和安全的优点，不仅避免了化学农药大量使用带来的残留和环境污染等问题，而且有利于促进环境保护及农业可持续发展，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为基于16s rDNA序列构建的NMB17系统发育树。

图2为微生物NMB17发酵液对棉花黄萎病菌V991抑菌示意图。A为对照组(Control)和处理组(NMB17)平板接种棉花落叶型黄萎病V991菌斑的生长情况，图片于接种7天后拍摄。B为NMB17发酵液对棉花黄萎病菌V991的抑菌率的柱形图统计。C为距离中心1.5cm和2.5cm的对照组(灭菌水)和处理组(NMB17菌剂)平板接种棉花落叶型黄萎病V991的抑菌圈情况。D为距离中心1.5cm和2.5cm的处理组(NMB17菌剂)对落叶型棉花黄萎病V991的抑制率的柱形图统计。图片中均按照对照组(Control)和处理组(NMB17)标注，每个处理4个生物学重复，实验重复3次。注：*表示在0.05水平上差异显著，**表示在0.01水平上差异显著(同下)。

图3为微生物NMB17发酵液挥发物对棉花黄萎病菌V991抑菌示意图。A为发酵液挥发物对病原菌抑制的模式图。B为NMB17处理组和大肠杆菌E.coli对照组平板接种棉花落叶型黄萎病V991菌斑的生长情况，图片于接种7天后拍摄。C为NMB17处理组和大肠杆菌E.col对照组平板接种棉花落叶型黄萎病V991在第7、9和14天的抑制率的柱形图统计。

图4为微生物NMB17菌剂对棉花黄萎病菌V991接种后发病情况统计。A为病菌V991接种7天和28天后的棉花生长情况。B为病菌V991接种28天后对照组和处理组的病情指数统计。C为体视显微镜下，病菌V991接种28天后对照组和处理组植株茎秆的组织结构。D为病菌V991接种28天后对照组和处理组植株茎秆重培养后真菌的生长情况。

图5为棉花落叶型黄萎病V991病原菌DNA以及细菌和真菌在根部和土壤的含量。A为NMB17处理棉花后对照组和处理组土壤和根系中V991真菌DNA的相对含量统计。B为NMB17处理棉花后对照组和处理组土壤和根系中细菌(16S)和真菌(18S)的相对含量统计。

图6为微生物NMB17发酵液对镰刀菌NMF6和NMF8，以及星油藤镰刀菌FoPVo1的抑菌示意图。A为对照组(Control)和处理组(NMB17)平板接种镰刀菌NMF6，NMF8菌斑的生长情况。B为对照组(Control)和处理组(NMB17)平板接种星油藤镰刀菌FoPVo1菌斑的生长情况。图片于接种7天后拍摄。C为接种镰刀菌NMF6、NMF8和星油藤镰刀菌FoPVo1的抑菌率的柱形图统计。

图7为微生物NMB17发酵液对曲霉菌FJF-3和FJF-4，以及FJF-6的抑菌示意图。A为对照组(Control)和处理组(NMB17)平板接种曲霉菌FJF-3菌斑的生长情况。B为对照组(Control)和处理组(NMB17)平板接种曲霉菌FJF-4菌斑的生长情况。C为对照组(Control)和处理组(NMB17)平板接种曲霉菌FJF-6菌斑的生长情况。图片于接种7天后拍摄。D为接种曲霉菌FJF-3，FJF-4，以及FJF-6的抑菌率的柱形图统计。

保藏说明

菌种名称：嗜油不动杆菌

拉丁名：Acinetobacter oleivorans

菌株编号：NMB17

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年03月08日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15435

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用到的细菌分离培养基如下：

LB培养基(液体)：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，水1000ml，pH7.0。

LB培养基(固体)：氯化钠10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉12g，水1000ml，pH7.0。

PDA培养基(液体)：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。

PDA培养基(固体)：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水1000mL。

高盐察氏琼脂培养基：硝酸钠2.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30.0g，氯化钠60.0g，琼脂20.0g，蒸馏水定容至1000mL。

孟家拉红琼脂培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，水定容至1000mL。

DG-18琼脂培养基：蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸锌0.01g，硫酸镁0.5g，硫酸铜0.005g，硫酸铵0.002g，氯霉素0.05g，盐酸金霉素0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL，pH 5.6±0.2。

MY50G培养基：麦芽提取物10g，酵母提取物2.5g，琼脂10g，葡萄糖250g，蒸馏水定容至500ml。

察氏培养基：硝酸钠3.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30.0g，蒸馏水1000mL。

下述实施例中的落叶型棉花黄萎病V991菌株记载于如下文献：张昕等，2011，土壤中落叶型棉花黄萎病菌的分子检测方法，江苏农业学报，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的星油藤镰刀菌FoPVo1菌株记载于如下文献：Chai X,2017,FirstReport of Root and Basal Stem Rot in Sacha Inchi(Plukenetia volubilis)Causedby Fusarium oxysporum in China,the Plant Disease，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的木贼镰刀菌NMF6菌株为文献“Walder F et al.,CommunityProfiling of Fusarium in Combination with Other Plant-Associated Fungi inDifferentCrop Species Using SMRT Sequencing.2017,Frontiers in Plant Science”中编号为10015的木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)；尖孢镰刀菌NMF8菌株为文献“李丹，2008，甘肃省中西部地区镰孢菌的分类研究，硕士论文”中编号为DD4的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的谢瓦氏曲霉FJF-3菌株为文献“Mouhamadou B et al.,Molecularscreening of xerophilic Aspergillus strains producing mycophenolic acid.2017,Fungal Biology”中编号为E24的谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)；疣梗曲霉FJF-4菌株为文献“A survey of xerophilic Aspergillus from indoor environment,including descriptions of two new section Aspergillus species producingeurotium-like sexual states,2017,MycoKeys”中编号为KAS 6024的疣梗曲霉(Aspergillus protuberus)；赤曲霉FJF-6菌株为文献“Mouhamadou B et al.,Molecularscreening of xerophilic Aspergillus strains producing mycophenolic acid.2017,Fungal Biology”中编号为E23的赤曲霉(Aspergillus ruber)；公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、NMB17菌株的分离与鉴定

一、NMB17菌株的分离

NMB17菌株分离自内蒙古自治区乌兰察布市甜菜连作地块甜菜根腐病发病严重的根际土壤。具体分离方法如下：将采自甜菜连作地块的根际土壤，挑取根系，刮取根际土，称量5g，无菌条件下放进已准备好的灭菌三角瓶中，用灭菌水梯度稀释到10-6倍，设置3个重复。将梯度稀释的土壤样品取200μL分别涂到PDA培养基平板上，在28℃培养箱中培养，每天观察菌落的生长状态，结果显示稀释为10-4、10-5、10-6倍时平板上基本上没有菌落长出，而稀释为10-4倍时，平板上能长出单一的菌落，并挑取在PDA培养基上长出单一的细菌和真菌菌落，将细菌和真菌分别在LB液体培养基和PDA培养基进一步扩大培养，做进一步的菌株鉴定，对获得的细菌菌株命名为NMB17。

二、NMB17菌株的鉴定

1、NMB17菌株的形态鉴定

NMB17菌株在LB培养基上培养24h～48h后可形成白色菌落，菌落状态呈圆形，表面光滑有凸起边缘整齐，较粘稠，易挑起。

2、NMB17菌株的分子鉴定

(1)提取NMB17菌株的DNA，采用通用引物Eubac27F/Eubac1492R进行PCR扩增，得到含有NMB17菌株16S rDNA保守区的PCR产物。引物序列如下：

Eubac27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

Eubac1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

将PCR产物经TA克隆连接到pEASY-T3(购买自北京全式金生物有限公司)，以通用引物M13F/M13R在英潍捷基公司测序。测序结果表明：NMB17菌株的16S rDNA保守区的核苷酸序列如序列1所示。

将测序所得序列与NCBI数据库进行blast比对后，通过MEGA5.1软件对NMB17和其他代表28种不同不动杆菌属菌株进行系统发育分析，系统发育树如图1所示。

(2)参照文献“Gundi et.al.,2009,Validation of partial rpoB genesequence analysis for the identification of clinically important and emergingAcinetobacter species，Microbiology”和“Ecker et.al.,2006,Identification ofAcinetobacter Species and Genotyping of Acinetobacter baumannii by MultilocusPCR and Mass Spectrometry，Journal of Clinical Microbiology，”中记载的不动杆菌菌属的鉴定方法进一步对NMB17菌株进行鉴定。具体步骤如下：提取NMB17菌株的基因组DNA，分别采用引物Ac696F/Ac696R以及efpF/efpR进行PCR扩增，分别得到大小为397bp的含有NMB17菌株的rpoB的PCR产物和大小为385bp的含有NMB17菌株的efp的PCR产物。引物序列如表1所示。

表1、引物序列

将PCR产物经TA克隆连接到pEASY-T3(购买自北京全式金生物有限公司)，以通用引物M13F/M13R在英潍捷基公司测序。测序结果表明：NMB17菌株的rpoB基因和efp基因的核苷酸序列分别如序列2和序列3所示。

将测序所得序列与NCBI数据库进行blast比对，其中根据rpoB基因测序序列在数据库中比对结果显示，NMB17菌株与醋酸钙不动杆菌和嗜油不动杆菌的相似性分别达到99％和98％，而根据efp基因测序序列在数据库中比对结果显示，NMB17菌株与嗜油不动杆菌的相似性达到98％，与醋酸钙不动杆菌比对结果仅有90％。

综合上述鉴定结果，确定NMB17菌株为嗜油不动杆菌，其分类命名为嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans，该菌株已于2018年03月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15435。

实施例2、微生物NMB17菌剂、发酵液和代谢液的制备

1、微生物NMB17菌剂的制备

将实施例1中获得的嗜油不动杆菌NMB17接种于LB培养基中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体沉淀，再用灭菌水将菌体沉淀进行稀释，制成微生物NMB17菌剂，微生物NMB17菌剂成品中NMB17活菌总浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL。

2、微生物NMB17发酵液的制备

将实施例1中获得的嗜油不动杆菌NMB17接种于LB培养液中，在28℃，200rpm条件下振荡培养12-16h，然后4000rpm离心20min，收集上清液，即为微生物NMB17发酵液，微生物NMB17发酵液成品中NMB17活菌总浓度为1×10²-1×10³CFU/mL。

3、微生物NMB17代谢液的制备

将步骤2制备的微生物NMB17发酵液经过0.22μm滤膜过滤(该步骤的目的是除菌)，收集滤液，即为微生物NMB17代谢液。

实施例3、微生物NMB17发酵液和菌剂对棉花黄萎病V991的抑菌率的影响

一、实验方法

1、将NMB17发酵液按照体积比为1:25的比例加入到已经融化并冷却至50℃左右的PDA培养基中，充分混匀后铺制平板，得到含有NMB17发酵液的PDA培养基。同时设置不加任何菌剂的PDA培养基为对照。

不加任何菌剂的PDA培养基铺制平板，以十字交叉法画出平板的中心点，分别在距离中心点1.5cm和2.5cm处用打孔器打孔，然后在打孔处打直径为5cm的圆孔，在圆孔处加10μl的NMB17菌剂，同时以10μl灭菌水为对照，放置在超净台中待菌液和灭菌水干燥后进行下一步实验。

2、抑菌实验

将PDA培养基上培养7天的棉花黄萎病V991病原真菌菌落边缘打取直径为6mm、生长均匀的菌碟，菌丝面向下，接种于含有NMB17发酵液的PDA培养基的中央，以及距离1.5cm和2.5cm处加NMB17菌剂处理的PDA培养基的平板中央，于28℃恒温培养。对照实验按照同样的方法处理。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

接种后逐日观察，用十字交叉方法测量各供试病原真菌在培养基平板上的直径，并按照下列公式计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％，菌饼直径为6mm。

二、抑菌效果统计

结果如图2中所示，在对棉花的主要病害棉花黄萎病V991的抑菌效果中，NMB17发酵液对棉花黄萎病V991的抑菌率为89.40％，1.5cm和2.5cm距离处的NMB17菌剂对棉花黄萎病V991的抑菌圈效果分别为45.69％和32.49％。

实施例4、微生物NMB17菌剂挥发物对棉花黄萎病V991的抑菌率的影响

一、实验方法

1、将冷却至40℃左右的LB固体培养基，在灭菌的超净台中制备LB固体培养基平板，待培养基平板凝固后，取200μl NMB17菌剂均匀的涂布在平板上，放置在超净台中待平板表面干燥后进行下一步实验，分别以涂布200μl E.coli DH5α和不添加任何物质的空白LB培养基平板为对照。同时在灭菌的超净台中制备无菌的PDA平板，待平板凝固干燥后备用。

2、抑菌实验

在无菌的PDA培养基平板上接种直径为6mm左右、生长均匀的V991菌碟，将涂布了NMB17菌剂和E.coli DH5α菌剂以及空白的LB平板倒扣在接种了V991菌碟的PDA平板上，用Parafilm膜将两个平板封接起来，将LB固体培养基的一面在下，而接种V991菌碟的PDA平板在上，放置在28℃培养箱中培养。对照实验按照同样的方法处理，每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

每天观察V991菌斑的生长情况，分别于第7、9和14天用十字交叉法测量菌斑的直径，并按照下列公式计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％，菌饼直径为6mm。抑菌示意图如图3所示。

二、抑菌效果统计

结果如图3中所示。在棉花黄萎病V991的抑菌效果中，NMB17发酵液挥发物对棉花黄萎病V991的抑菌率在第7、9和14天分别为58.21％、57.27％和72.67％，则在E.coli DH5α处理的对照组则为31.25％、31.12％和28.33％。

上述实施例3的结果(图2C)说明NMB17菌剂可能分泌一些具有扩散性能的小分子化合物，这些小分子化合物对植物真菌病害棉花黄萎病的病原菌生长具有抑制作用；而实施例4的结果说明NMB17菌剂的挥发性物质对植物真菌病害棉花黄萎病有很好的抑菌效果。综上所述，NMB17发酵液或菌剂中的一些小分子化合物或挥发性物质对植物真菌病害棉花黄萎病均有抑菌作用。

实施例5、微生物NMB17菌剂对棉花黄萎病V991的致病力的影响

一、实验方法

1、棉花幼苗的种植

将TM-1棉花种子(购买自北京金农丰源种子有限公司)浸泡在水溶液中，放置在37℃培养箱中催芽，经过2～3后，挑选出芽一致的健康棉花种子种植。然后将已发芽的棉花种子分别移栽到均匀添加NMB17菌剂的灭菌的蛭石泥炭土基质(每kg蛭石泥炭土基质添加50mL OD值为1的NMB17菌剂，NMB17菌剂使用终浓度为1×10⁵CFU/mL)和对照(以不添加任何菌剂作为对照，Control)的营养穴中，并置于塑料花盆(规格：上口直径为14厘米，下口直径为9.5厘米，高度为12.5厘米)内培养，表面覆盖一层保鲜膜保湿，待其长出子叶后将保鲜膜去掉，放置在28℃气候光照培养箱中培养，光照：黑暗(12:12)，湿度为60％，待棉花幼苗长出3～4片真叶的时候用于下一步接种病原菌。

2、菌液配置

将棉花黄萎病V991接种到PDA培养基上，28℃培养到3～5天，将新鲜的菌斑用打孔器打出均匀的菌斑，接种到含有100ml察氏培养基的250ml的三角瓶中，28℃，200rpm震荡3～5天，取菌液在显微镜下用细胞计数板的方法数棉花黄萎病的孢子，当孢子浓度达到10⁶CFU/ml时，用4～6层纱布过滤培养液，收集孢子，制成孢子浓度为1.0×10⁶CFU/ml的棉花黄萎病孢子悬浮液，然后接种棉花幼苗。

3、人工接种及病情调查

接种时选取生长到含有3～4片真叶的棉花幼苗，采用灌根法将棉花黄萎病的孢子悬浮液加入到每棵棉花的根部，放置在温度为28℃，光照：黑暗(12h:12h)，湿度为60％的条件下培养。每天观察棉花的生长和发病情况，以便统计病情指数。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

4、植株茎秆的观察和病原菌PDA培养基上重培养

取处理组和对照组的棉花植株相同部位的茎秆，用刀片切成薄的切片，放置加有水滴的载玻片中央，用体式解剖镜观察两组植株的组织切片的结构，ImageView拍照观察维管束的结构变化。

将处理组和对照组的植株茎秆用NaClO₃消毒，然后再用75％的酒精消毒，最后用灭菌水清洗三遍，每次1分钟。用灭菌的解剖剪将植株茎秆剪成大约2cm长的小段放置在PDA培养基上，逐日观察培养基上菌斑的生长情况。

二、抗病效果统计

结果如图4所示，对照组在接种棉花黄萎病菌7天后，在距离地面的第一片叶片发黄，部分植株的叶片开始落叶，而NMB17菌剂处理组棉花植株则没有任何病症，而在28天的时候，对照组的植株全部发病，整个植株的叶片全部掉落(图4A)，病情指数为97.5％；而NMB17菌剂处理组的棉花植株的病情指数为61.68％(图4B)。说明微生物NMB17菌剂对棉花黄萎病V991有显著的抑菌效果，可防治棉花黄萎病。

观察处理28天后的对照组和处理组的植株茎秆组织切片的维管束结构变化，结果显示：处理28天后，对照组的茎秆组织切片的维管束鞘变为褐色，而对照组却没有发现类似的现象(图4C)，充分说明棉花黄萎病是维管束的系统病害。在PDA培养基重培养的结果显示：对照组中的横切茎秆基本上每个都长出了菌斑，而NMB17处理组中只有个别的横切茎秆长出菌斑(图4D)。

实施例6、微生物NMB17菌剂对棉花黄萎病V991的DNA含量和微生物多样性的影响

一、实验方法

1、棉花根系和根系土壤样品的收集

从实施例5中NMB17菌剂处理组和对照组的种植穴中将棉花根系拔出来，将附着在根系上的土壤收集到离心管中备用，同时收集去除土壤的根系，待下一步提取DNA。

2、DNA提取

利用MOBIO土壤DNA提取试剂盒(PowerSoilTM DNA Isolation Kit)提取土壤样品的DNA，提取方法按照说明书；利用天根生物的植物基因组DNA提取试剂盒提取植物根系样品的DNA，提取方法按照说明书。

3、Realtime定量PCR

以提取的DNA为模板，采用表1中的引物进行Realtime定量PCR分析，试剂采用TOYOBO SYBR Green Realtime PCR Master Mix，具体方法按照说明书。其中，对根系和土壤中V991真菌含量的检测采用引物QV991-F/QV991-R，棉花内参基因采用引物TM-actin-F/TM-actin-R。土壤微生物的细菌多样性(16S含量)和真菌多样性(18S含量)的定量检测分别采用引物Eub338/Eub518和ITS1f/5.8s。引物序列如表1所示。

二、相对含量检测结果

定量的分析结果如图5所示。结果表明：无论是根系还是土壤中，NMB17处理组中的V991相对表达量均显著低于对照组。而无论是根系还是土壤中，NMB17处理组中的细菌相对表达量(16S)和真菌相对表达量(18S)与对照组无显著性差异，说明加入NMB17后不影响土壤微生物多样性。

实施例7、微生物NMB17发酵液对木贼镰刀菌NMF6、尖孢镰刀菌NMF8和星油藤镰刀菌FoPVo1的抑菌率的影响

一、实验方法

1、将NMB17发酵液按照体积比为1:25的比例加入到已经融化并冷却至50℃左右的PDA培养基中，充分混匀后铺制平板，得到含有NMB17发酵液的PDA培养基。同时设置不加任何菌剂的PDA培养基为对照，上述所有的过程均在无菌的环境下完成。

2、抑菌实验

将PDA培养基上培养5～7天的木贼镰刀菌NMF6和尖孢镰刀菌NMF8，以及星油藤镰刀菌FoPVo1病原真菌菌落边缘打取直径为6mm、生长均匀的菌碟，菌丝面向下，接种于含有NMB17菌剂的PDA培养基的中央，于28℃恒温培养。对照实验按照同样的方法处理。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。

二、抑菌效果统计

结果如图6中所示。在木贼镰刀菌NMF6和尖孢镰刀菌NMF8的抑菌效果中，NMB17发酵液对木贼镰刀菌NMF6和尖孢镰刀菌NMF8的抑菌率分别为75.29％和31.49％，对星油藤镰刀菌FoPVo1的抑菌率为15.91％。

实施例8、微生物NMB17发酵液对谢瓦氏曲霉FJF-3、疣梗曲霉FJF-4和赤曲霉FJF-6病原真菌抑菌率的影响

一、实验方法

2、抑菌实验

将PDA培养基上培养5～7天的谢瓦氏曲霉FJF-3、疣梗曲霉FJF-4和赤曲霉FJF-6病原真菌菌落边缘打取直径为6mm、生长均匀的菌碟，菌丝面向下，接种于含有NMB17菌剂的PDA培养基的中央，于28℃恒温培养。对照实验按照同样的方法处理。每个处理4个生物学重复，实验重复3次。接种后逐日观察，用十字交叉方法测量各供试病原真菌在培养基平板上的直径，并按照下列公式计算抑菌率：抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％，菌饼直径为6mm。

二、抑菌效果统计

结果如图7所示。在对FJF-3、FJF-4和FJF-6的抑菌效果中，NMB17发酵液对FJF-3、FJF-4和FJF-6的抑菌率分别为45.18％、41.05％和12.23％。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所中国科学院大学

<120>一株嗜油不动杆菌NMB17及其在植物病害防治中的应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1500

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcaggc ttaacacatg caagtcgagc 60

ggagtgatgg tgcttgcact atcacttagc ggcggacggg tgagtaatgc ttaggaatct 120

gcctattagt gggggacaac atttcgaaag gaatgctaat accgcatacg tcctacggga 180

gaaagcaggg gatcttcgga ccttgcgcta atagatgagc ctaagtcgga ttagctagtt 240

ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ctgtagcggg tctgagagga tgatccgcca 300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360

atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggccttat ggttgtaaag 420

cactttaagc gaggaggagg ctactttagt taatacctag agatagtgga cgttactcgc 480

agaataagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt 540

aatcggattt actgggcgta aagcgcgcgt aggcggctaa ttaagtcaaa tgtgaaatcc 600

ccgagcttaa cttgggaatt gcattcgata ctggttagct agagtgtggg agaggatggt 660

agaattccag gtgtagcggt gaaatacgta gagatctgga ggaataccga tggcgaaggc 720

agccatctgg gcctaacact gacgctgagg tgcgaaagca tggggagcaa acaggattag 780

ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg tctactagcc gttggggcct ttgaggcttt 840

agtggcgcag ctaacgcgat aagtagaccg cctggggagt acggtcgcaa gactaaaact 900

caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg 960

cgaagaacct tacctggcct tgacatagta agaactttcc agagatggat tggtgccttc 1020

gggaacttac atacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080

aagtcccgca acgagcgcaa cccttttcct tatttgccag cgagtaatgt cgggaacttt 1140

aaggatactg ccagtgacaa actggaggaa ggcggggacg acgtcaagtc atcatggccc 1200

ttacggccag ggctacacac gtgctacaat ggtcggtaca aagggttgct acctagcgat 1260

aggatgctaa tctcaaaaag ccgatcgtag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat 1320

gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcggatca gaatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380

tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt ttgttgcacc agaagtaggt agtctaaccg 1440

caaggaggac gcttaccacg gtgtggccga tgactggggt gaagtcgtaa caaggtaacc 1500

<210>2

<211>397

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

taccgtaaag atttgaaaga agaatacaag atctttgaag aagcagctcg tgagcgtgta 60

attcgtttgc ttaacggcca agagtctaac ggtggtggtt cgactaaacg tggcgacaaa 120

ctcgttgaag atatgttgtc tggtttagag cttgttgact tacttgaaat ccaacctaca 180

gacgaagcaa ttgctgaacg tttatctcaa attcaagtgt tcttgaaaga gaagagcgca 240

gaaattgatg agaagtttgc agagaagaaa cgtaagcttt cgactggtga tgagttaaca 300

actggtgttc tgaaagttgt taaagtttac ctagcagtta aacgtcgtat tcagcctggt 360

gataaaatgg ctggtcgtca cgggaacaaa ggtgttg 397

<210>3

<211>385

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

gttaaaccag gtaagggtca agcgttcaac cgtgtaaaat tacgtaacct taaaactggt 60

aaagtattag aaaaaacttt caaatcaggt gactctttag aagctgctga tattgttgaa 120

gttgaaatgg aatacctata caacgatggt gaaatgtgga atttcatgga tcctgtatct 180

tttgagcaaa tcgctgcaga caaaactgca atgggcgatg ctgcaaaatg gttaaaagac 240

gattcaaatg aaaaatgtac gattatgttg ttcaacggcg tacctttaac tgtaaaccca 300

ccgaacttcg ttgtattaaa aattgttgaa actgatccgg gtgtacgtgg tgatacatct 360

ggcggtggcg gcaagcctgc aacac 385

Claims

1.一株嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans NMB17，其保藏编号为CGMCCNo.15435。

2.嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物在如下1)-12)中任一种应用：

1)防治植物土传病害；

2)制备防治植物土传病害的产品；

3)抗菌和/或抑菌；

4)制备抗菌和/或抑菌的产品；

5)提高植物对土传病害的抵抗能力；

6)制备提高植物对土传病害的抵抗能力的产品；

7)降低土壤和/或棉花根系中棉花黄萎病病原菌含量；

9)防治贮藏霉菌；

10)制备防治贮藏霉菌的产品；

11)提高农产品对贮藏霉菌的抵抗能力；

12)制备提高农产品对贮藏霉菌的抵抗能力的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述植物土传病害为黄萎病和/或根腐病；

和/或，所述黄萎病为棉花黄萎病；

和/或，所述棉花黄萎病为棉花落叶型黄萎病。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述菌为真菌；

和/或，所述真菌为落叶型棉花黄萎病菌和/或木贼镰刀菌和/或尖孢镰刀菌和/或谢瓦氏曲霉和/或疣梗曲霉和/或赤曲霉；

和/或，所述贮藏霉菌为谢瓦氏曲霉和/或疣梗曲霉和/或赤曲霉。

5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans为嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans NMB17 CGMCC No.15435。

6.一种产品，其活性成分为嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物；

所述产品具有如下1)-6)中任一种功能：

1)防治植物土传病害；

2)抗菌和/或抑菌；

3)提高植物对土传病害的抵抗能力；

4)降低土壤和/或棉花根系中棉花黄萎病病原菌含量；

5)防治贮藏霉菌；

6)提高农产品对贮藏霉菌的抵抗能力。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：

所述植物土传病害为黄萎病和/或根腐病；

和/或，所述黄萎病为棉花黄萎病；

和/或，所述棉花黄萎病为棉花落叶型黄萎病；

和/或，所述菌为真菌；

8.根据权利要求6或7所述的产品，其特征在于：所述嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans为嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans NMB17 CGMCC No.15435。

9.一种防治植物土传病害的方法，包括用嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物处理植物幼苗的步骤；

或，一种防治贮藏霉菌的方法，包括用嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans或其菌剂或其发酵液或其代谢液或其菌悬液或其培养液或其挥发物处理农产品的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述嗜油不动杆菌Acinetobacteroleivorans为嗜油不动杆菌Acinetobacter oleivorans NMB17 CGMCC No.15435。