CN110982725B - 一种拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌及其应用，该菌株为简单芽孢杆菌FJAT‑47158，学名为Bacillus simplex FJAT‑47158，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.15946。本发明的芽孢杆菌不仅可以抑制尖孢镰刀菌、地毯草黄单胞菌等植物病原菌，还可以提高植物种子的活力，促进种子生长，可用于枯萎病的防治，是一种对环境友好、经济有效的防治病害的生防菌。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌菌株。
背景技术
枯萎病是一种系统感染病害，是来蒙、大豆、小麦、番茄、棉花、草莓等植物的常见土传病害，在美国、加拿大、澳大利亚、中国等是一个日益突出的问题。植株由于枯萎病，叶片变小，缺少光泽，枝条矮化，果实瘦小，或叶片变黄萎蔫，严重时植株逐渐枯死。枯萎病的主要病原种群是尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum和腐皮镰刀菌Fusarium solani，防治的方法有化学试剂、真菌剂、生物防治、植物性治疗药物、优化施肥等，而采用生防菌控制枯萎病是综合防治的一条重要措施。
多种真菌、细菌和一些放线菌都可应用于真菌病害的生物防治，拮抗性细菌有短短芽孢杆菌、绿叶假单胞菌、贝莱斯芽孢杆菌等。细菌在植物生物防治中的应用研究已广泛开展，并取得良好的应用效果。但是，这些细菌对植物枯萎病却没有很好的防治效果。
因此，筛选到防效好、适应性广的生防菌是植物枯萎病生物防治工作面临的关键问题。如果在植物生长早期就能使用的生防菌，可以对植物病原菌进行及早预防，减少枯萎病等植物病害的发生，提高农作物产量。
发明内容
为此，需要提供一种拮抗枯萎病的生防菌，解决枯萎病的生物防治问题。
为实现上述目的，发明人提供了如下技术方案：
一种拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌，其特征在于：所述的芽孢杆菌为简单芽孢杆菌FJAT-47158，学名为Bacillus simplex FJAT-47158，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.15946，保藏日期为2018年6月19日，保藏地址为中国北京市中国科学院微生物研究所。
芽孢杆菌FJAT-47158的菌落形态为：圆形，淡黄色，边缘整齐，表面褶皱，不透明，粘稠的中等大小菌落。
芽孢杆菌FJAT-47158对尖孢镰刀菌有较强的拮抗作用，包括番茄寄主尖孢镰刀菌FJAT-30512、香蕉寄主尖孢镰刀菌FJAT-370和西瓜寄主尖孢镰刀菌FJAT-30265，对地毯草黄单胞菌FJAT-10151也有很强的拮抗作用。
进一步的，所述的拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌在拮抗植物病原菌中的应用。
具体的，将所述的芽孢杆菌制成抑菌溶液，采用灌根法浇灌于植物幼苗根系，或者喷洒于植物叶片或果实上。
所述的抑菌溶液的制备方法是将所述的芽孢杆菌菌株接种到固体培养基平板上，挑取一菌环单菌落接种到相应的液体培养基中，25-35℃恒温培养36-60h；对芽孢杆菌发酵液进行离心，弃菌体，取上清，即可得到抑菌溶液。
进一步的，所述的拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌在促进植物种子生长中的应用。
具体的，用所述的芽孢杆菌的菌悬液浸种6-8h，用湿纱布包盖于25-28℃下催芽2-3天，有1/2-2/3种子露白时，即可播种，基质可用育苗土或育苗块。
所述的芽孢杆菌的菌悬液的制备方法是将芽孢杆菌菌株接种到固体培养基平板上，再挑取一菌环单菌落接种到相应的液体培养基中，25-35℃恒温培养36-60h，将培养后的菌液稀释至菌浓为1-4×105cfu·mL-1即可。
进一步的，所述的固体培养基为LB固体培养基，相应的液体培养基为LB液体培养基。
本发明的有益效果是：
(1)从西藏申扎县巴拥附近草原土壤样品筛选到的芽孢杆菌FJAT-47158，对枯萎病主要病原菌镰刀菌具有很强的抑制效果，可专门用于防治枯萎病。
(2)芽孢杆菌FJAT-47158是枯萎病主要病原菌的拮抗菌，是一种对环境友好、经济有效的防治病害的生防菌。它能产生具有较强抗逆性的内生孢子(芽孢)，能耐盐、耐酸、耐高温且易于保存和运输，有利于快速实现商品化生产。
(3)芽孢杆菌FJAT-47158除了有显著的抑菌效果外，还具有明显促进植物生根长茎的作用，可缩短种子萌发时间，在植物种子阶段就进行应用，还可及早预防植物病害的发生。
附图说明
图1为具体实施方式所述的芽孢杆菌FJAT-47158的菌落形态，左图为FJAT-47158菌株在整块平板上的菌落生长状态，右图为左图菌落的局部放大图。
图2为具体实施方式所述的芽孢杆菌FJAT-47158的16S rRNA序列鉴定结果的进化树。
图3为具体实施方式所述的芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子萌发的发芽影响。
图4为具体实施方式所述的芽孢杆菌FJAT-47164对绿豆种子根长和绿豆芽茎长的影响。
图5为具体实施方式所述的绿豆种子生长的盆栽结果。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1拮抗菌株的筛选
1.土样采集与芽孢杆菌分离纯化
将西藏申扎县巴拥附近草原土壤样品制成土壤悬浊液，再经过无菌水适当稀释，涂布LB平板(LB：胰蛋白胨10g·L-1，氯化钠10g·L-1，酵母粉5g·L-1，琼脂粉1.5％，pH 7.0-7.2)；30℃培养48h，挑取单菌落，甘油保存，作为待测菌株。采用稀释涂板法分离纯化得到了60株菌株作为待测菌株。
2.枯萎病生防菌株的筛选
(1)对峙法初筛
供试菌株，于LB平板上活化，30℃恒温培养48h。
尖孢镰刀菌FJAT-30512(陈倩倩,刘波,刘国红,车建美,龚海艳.华重楼根际土芽胞杆菌多样性研究[J].热带农业科学,2015,35(12):103-107+112.)、FJAT-370(陈梅春等.地衣芽孢杆菌FJAT-4脂肽结构鉴定及其对尖孢镰刀菌的抑制作用.微生物学报,2017,57(12).)、FJAT-30265(肖荣凤,刘波,朱育菁,等.尖孢镰刀菌磷脂脂肪酸的遗传多样性分析[J].植物保护学报,2017,44(5):763-770.)，保藏在福建省农业科学院农业生物资源研究所(刘国红等.芽胞杆菌分类与应用研究进展.微生物学通报，2017，44(4):949-958)。
尖孢镰刀菌FJAT-30512、FJAT-370、FJAT-30265于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA：马铃薯200.0g·L-1，蔗糖20.0g·L-1，琼脂15g·L-1)上活化，28℃恒温培养48h。将活化后的尖孢镰刀菌接种于PDA平板上，28℃培养120h至菌丝长满整个平板，然后在菌饼上打下直径9mm的小菌圈，置于PDA平板的正中间，再在距离小菌圈外围22mm的地方划长为40mm线接种供试菌株。28℃恒温培养120h，观察菌株对各尖孢镰刀菌的抑制效果。
从西藏地区分离纯化得到的60株菌株，进行平板对峙法初筛获得了1株对不同寄主尖孢镰刀真菌FJAT-30512、FJAT-370和FJAT-30265均有拮抗作用的菌株FJAT-47158。
(2)抑菌圈法复筛
将供试菌株FJAT-47582接种到LB平板上，再挑取1菌环单菌落接到10mLLB液体培养基(胰蛋白胨10g·L-1，氯化钠10g·L-1，酵母粉5g·L-1，pH 7.0-7.2)中，170r·min-1，30℃恒温培养48h，经血球计数板计数，FJAT-47582菌落密度达2.352×108cfu·mL-1。对FJAT-47582发酵液进行4000rpm，8min离心，取上清，弃菌体。
a、番茄枯萎病生防菌的筛选
将2mL尖孢镰刀菌FJAT-30512的菌悬液(菌落密度2.31×107cfu·mL-1)与100mL50℃的含150μg·mL-1链霉素的PDA半固体培养基(马铃薯200.0g·L-1，蔗糖20.0g·L-1，琼脂9g·L-1)混合后，吸取4mL倒入已制备好的含150μg·mL-1链霉素的PDA固体培养基(每块平板定量为20mL)，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，打孔(直径9mm)，在孔内加入100μL供试菌株上清液，阴性对照为100μL无菌水，阳性对照为100μL潮霉素(质量浓度为0.25mg·mL-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养1-2d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。抑菌效果见表1。
表1FJAT-47158菌株对番茄寄主尖孢镰刀菌FJAT-30512的抑菌作用
单位：mm
注：抑菌圈直径包含打孔器直径。
b、香蕉枯萎病生防菌的筛选
将2mL尖孢镰刀菌FJAT-370的菌悬液(菌落密度2.52×107cfu·mL-1)与100mL 50℃的PDA半固体培养基(含150μg·mL-1链霉素)混合后，吸取4mL倒入已制备好的含150μg·mL-1链霉素的PDA固体培养基(每块平板定量为20mL)，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，打孔(直径9mm)，在孔内加入100μL供试菌株上清液，阴性对照为100μL无菌水，阳性对照为100μL潮霉素(质量浓度为0.25mg·mL-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养1-2d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。抑菌效果见表2。
表2FJAT-47158菌株对香蕉寄主尖孢镰刀菌FJAT-370的抑菌作用
单位：mm
注：抑菌圈直径包含打孔器直径。
c、西瓜枯萎病生防菌的筛选
将2mL尖孢镰刀菌FJAT-30265的菌悬液(菌落密度2.14×107cfu·mL-1)与100mL50℃的PDA半固体培养基(含150μg·mL-1链霉素)混合后，吸取4mL倒入已制备好的含150μg·mL-1链霉素的PDA固体培养基(每块平板定量为20mL)，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，打孔(直径9mm)，在孔内加入100μL供试菌株上清液，阴性对照为100μL无菌水，阳性对照为100μL潮霉素(质量浓度为0.2mg·mL-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养1-2d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。抑菌效果见表3。
表3FJAT-47158菌株对西瓜寄主尖孢镰刀菌FJAT-30265的抑菌作用
单位：mm
注：抑菌圈直径包含打孔器直径。
综上，以番茄尖孢镰刀菌FJAT-30512、香蕉尖孢镰刀菌FJAT-370和西瓜尖孢镰刀菌FJAT-30265作为致病菌，从西藏地区草原土中筛选到了一株对镰刀菌具有较强抑制效果的菌株FJAT-47158。利用菌株FJAT-47158拮抗尖孢镰刀菌的作用，可将菌株FJAT-47158的菌液或发酵上清液采用灌根法浇灌于番茄苗、西瓜苗或香蕉苗等植物幼苗根系，用于枯萎病的防治。
实施例2拮抗菌株的鉴定
1.形态特征
将芽孢杆菌FJAT-47158于LB平板上活化，48h后观察菌株的菌落形态、大小、颜色、透明度、突起和边缘情况。
菌株FJAT-47158的菌落特征如图1所示，圆形，淡黄色，边缘整齐，表面褶皱，不透明，粘稠的中等大小菌落。
2.16S rRNA基因序列分析
采用Tris-饱和酚法提取菌株FJAT-47158的基因组DNA，采用16S rRNA基因通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR反应程序参照郑雪芳等的文献(郑雪芳,刘波,朱育菁,等.番茄青枯病生防芽孢杆菌的筛选与鉴定[J].中国生物防治学报,2016,32(5):657-665.)，PCR产物送至上海博尚测序，应用EZBioCloud完成序列同源性比对，通过MEGA 6.0.6软件分析序列和构建系统发育树。
将菌株FJAT-47158的16S rRNA基因序列与EZBioCloud基因数据库比对，菌株FJAT-47158与Bacillus simplex亲缘关系最近，16S rRNA基因同源性为99.86％，所以菌株FJAT-47158应属于Bacillus simplex简单芽孢杆菌。将同源性较高菌株的16S rRNA基因序列下载进行对比分析，构建系统发育树，采用Neighbour-Joining方法，Bootstrap值为1000次时，形成的发育树如图2所示。构建的系统发育树中，菌株FJAT-47158与Bacillussimplex聚在同一个分支。
实施例3芽孢杆菌对地毯草黄单胞菌的抑制效果
将FJAT-47158菌株接种到LB平板上，再挑取1菌环单菌落接到10mL LB液体培养基中，170r·min-1，30℃恒温培养48h，经血球计数板计数，FJAT-47158菌落密度达2.352×108cfu·mL-1。对FJAT-47158发酵液进行4000rpm，8min离心，取上清，弃菌体。
将1mL地毯草黄单胞菌FJAT-10151(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.10271)的菌悬液(菌落密度4.224×108cfu·mL-1)与200mL50℃的NA半固体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂9g,水1L)混合后，吸取4mL倒入已制备好的NA固体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂18g，水1L)，每块平板定量为20mL，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，打孔(直径6mm)，在孔内加入80μL供试菌株上清液，阴性对照为80μL无菌水，阳性对照为80μL链霉素(质量浓度为0.06g·mL-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养1-2d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。抑菌效果见表4。
表4芽孢杆菌FJAT-47158对地毯黄单胞菌FJAT-10151的抑菌作用
单位：mm
注：抑菌圈直径包含打孔器直径。
芽孢杆菌FJAT-47158对地毯草黄单胞菌FJAT-10151有较强的抑制效果。地毯草黄单胞菌为典型的植物致病菌，会引起红掌的细菌性叶斑病、棉豆的白叶枯病、柑橘溃疡等植物病害。因此，可将芽孢杆菌FJAT-47158制备的抑菌溶液喷洒于植物叶片或果实上，用于植物病原菌的防治。
实施例4芽孢杆菌的促生长作用
将芽孢杆菌FJAT-47158菌株接种到LB平板上，再挑取一菌环单菌落接到10mL LB液体培养基中，170r·min-1，30℃恒温培养48h，经血球计数板计数，FJAT-47158菌落密度达2.352×108cfu·mL-1。
将菌悬液进行梯度稀释，分别稀释1200倍、600倍、300倍、150倍、50倍、原液，以清水作为对照(ck)。挑选长势相对一致的绿豆种子置于底部铺置2-3层滤纸的9cm的透明培养盒中，每培养盒15粒绿豆种子，将其置于27℃恒温人工气候箱，光照16h、黑暗8h。跟踪观察绿豆发芽情况，记录发芽数，直到连续3d无新的发芽粒出现，测量绿豆发芽胚根机胚芽长度，分析芽孢杆菌FJAT-47158对绿豆种子发芽的影响。
实验结果显示，24h时，菌液稀释的组与对照组均已发芽，原液浓度太高，抑制了绿豆种子发芽；48h时，菌液稀释的组与对照组发芽明显即有2/3种子露白，原液抑制效果明显，已停止发芽；72h时，菌液稀释的组与对照组比较，随着稀释倍数的增加，实验组的生长状态也呈现正相关。
芽孢杆菌FJAT-47158对绿豆种子萌发的影响见表5和图3。实验结果显示，绿豆种子发芽指数：除原液外，菌液稀释50-1200倍时与对照组无显著差异；种子活力：菌液稀释300-1200倍有促进作用，其中稀释600-1200倍差异显著，稀释600倍时效果最好，较对照组显著提高16.63％。
表5芽孢杆菌FJAT-47158对绿豆种子萌发的影响
上表中，发芽率％＝(指定天数的发芽种子数/供试种子数)×100％；
发芽指数＝∑(Gt/Dt)，其中Gt为第t天的发芽种子数，Dt为相应发芽天数；
活力指数＝发芽指数×胚根长(cm)；
abcd表示显著性差异(P<0.05)。
96h时，芽孢杆菌FJAT-47158对绿豆种子根长茎长影响见表6和图4、图5。实验结果显示，绿豆芽根长：菌液稀释600倍效果较好，与其他组无显著差异；茎长：菌液稀释50、600、1200倍时，有促进茎生长的作用，但与对照组无显著差异，其中稀释600倍和1200倍时效果较好。
表6芽孢杆菌FJAT-47158对绿豆种子根长茎长影响
上表中，abcd表示显著性差异(P<0.05)。
芽孢杆菌FJAT-47158的菌悬液不仅可以显著提高绿豆种子活力，还可以促进绿豆种子生根长茎。因此，在种子萌发和生长阶段，均可以使用稀释600-1200倍的芽孢杆菌FJAT-47158的菌悬液即菌浓在1-4×105cfu·mL-1浸种6-8小时，用湿纱布包盖于25-28℃下催芽2-3天，以提高种子活力，同时也作为营养液促进种子生根长茎，加速种子发芽生长，待有1/2-2/3种子露白时，即可播种，基质可用育苗土或育苗块。
综上所述，芽孢杆菌FJAT-47158不仅可以抑制尖孢镰刀菌、地毯草黄单胞菌等植物病原菌，还可以提高植物种子的活力，促进种子生长。在番茄、西瓜等植物种子萌发阶段，可用一定浓度的芽孢杆菌FJAT-47158的菌悬液浸泡种子提高种子活力；在种子生长阶段，也可以添加适当的芽孢杆菌FJAT-47158的菌悬液，促进种子生根长茎；在植物生长阶段，还可用芽孢杆菌FJAT-47158发酵的上清液浇灌在植物根系或喷洒在植物的叶片或果实上，以预防枯萎病等植物病害的发生。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (2)
1.一种拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌，其特征在于：所述的芽孢杆菌为简单芽孢杆菌FJAT-47158，学名为Bacillus simplex FJAT-47158，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.15946，保藏日期为2018年6月19日，保藏地址为中国北京市中国科学院微生物研究所。
2.一种如权利要求1所述的拮抗枯萎病和促生长的芽孢杆菌在促进绿豆种子生长中的应用，其特征在于：用所述的芽孢杆菌的菌悬液浸种6-8h，于25-28℃下催芽2-3天，有1/2-2/3种子露白时，即可播种；所述的芽孢杆菌的菌悬液的制备方法是将芽孢杆菌菌株接种到固体培养基平板上，再挑取一菌环单菌落接种到相应的液体培养基中，25-35℃恒温培养36-60h，将培养后的菌液稀释至菌浓为1-4×105cfu·mL-1即可。
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