CN105002121A - 一株简单芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株简单芽孢杆菌及其应用。该菌株为简单芽孢杆菌(Bacillus？simplex)STY005，保藏编号为CGMCC？No.11052。本发明还公开了含有上述菌株的生物防治制剂及其制备方法。实验表明，本发明的简单芽孢杆菌菌株STY005具有直径长、耐低氧、作用谱广、适应性强，在低营养下即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该菌株制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料防治作物叶部病害，包括马铃薯疮痂病、葡萄霜霉病、月季白粉病、黄瓜靶斑病等一种或几种。

Description

一株简单芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植物病害的芽孢杆菌及其用途，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
植物病害是植物在生物或非生物因子的影响下，发生一系列形态、生理和生化上的病理变化，阻碍了正常生长、发育的进程，从而影响人类经济效益的现象。目前对于植物病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种培育周期长，抗性单一，而化学防治，极易造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。因此，利用有益微生物防治植物病害具有广阔的前景。
芽孢杆菌(Bacillus)，在分类上是细菌的一个科，能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。形成芽孢后，它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。由于它们代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍；生命力强，耐受性好；体积大，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，芽孢杆菌的生防机制主要是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治多种植物病害的新的微生物——简单芽孢杆菌菌株STY005。本发明的芽孢杆菌菌株具有直径长、耐低氧、作用谱广、适应性强，在低营养下即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明所提供的菌株为简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)STY005，是从山东省林业科学院苗圃中分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.11052。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
本发明简单芽孢杆菌菌株STY005的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1-7.4；
(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1-7.4；
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制。其中所述固料的组分及重量比为：玉米面75％，豆粕10％，麸皮15％；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。
(4)大量发酵培养基配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供了一种生物防治制剂，包括所述的简单芽孢杆菌菌株STY005。
上述生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备简单芽孢杆菌菌株STY005的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28～30℃下恒温培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28～32℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
优选的，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将简单芽孢杆菌的孢子移植到LB液体培养基中，28～30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28～30℃下恒温振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28～32℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
本发明也提供了上述简单芽孢杆菌菌株STY005或者上述生物防治制剂在防治植物叶部病害中的用途，所述植物叶部病害可以选自马铃薯疮痂病、葡萄霜霉病、月季白粉病、黄瓜靶斑病等的一种或几种。
并且，本发明还提供了一种用于防治植物病害的生物防治方法，包括向具有上述病害的植物施用上述简单芽孢杆菌菌株STY005或者上述生物防治制剂。
实验表明，本发明的简单芽孢杆菌菌株STY005具有直径长、耐低氧、作用谱广、适应性强，在低营养下即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该简单芽孢杆菌菌株STY005制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料防治作物叶部病害，包括马铃薯疮痂病、葡萄霜霉病、月季白粉病、黄瓜靶斑病等一种或几种；还可以防治辣椒根腐病、棉花立枯病、西瓜枯萎病等多种土传植物病害。
具体实施方式
实施例1
1、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)菌株STY005的分离与纯化
本发明的简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)菌株STY005是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
⑴芽孢杆菌的分离：土样的采集，在山东省林业科学院苗圃，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。
⑵马铃薯疮痂病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
A.马铃薯疮痂病分离
培养基(高氏一号)：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO31g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂15～25g，水1000ml；pH 7.1～7.4。
B.病原菌分离
采用高氏一号培养基，来源为内蒙古原产马铃薯荷兰15感病薯块，由山东省蔬菜研究所提供。菌株经感病回接和鉴定，确定为疮痂链霉菌Streptomyces scabies(Thaxter)Waks.et Henvici，菌株代号SN15-1，该菌株在PDA上也可以生长，但生长缓慢，必须采用封口胶锁住水分，保持湿度。
①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在芽孢杆菌、马铃薯疮痂病边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的简单芽孢杆菌菌株STY005。实验证明，该简单芽孢杆菌原粉在防治马铃薯疮痂病显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的简单芽孢杆菌是具有广泛应用前景的简单芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rRNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
GGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATCGATGGGAGCTTGCTCCCTGAGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATACGTTCTTTCCTCGCATGAGAGAAGATGGAAAGACGGTTTACGCTGTCACTTATAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAACGAAGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCAGAGTAACTGCTGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAACCTGCGAAGGTAAGCGAATCCCATAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTCATGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGA
实施例2
1、简单芽孢杆菌菌株STY005发酵过程
LB液体培养基：配方为，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1-7.4。
大量固体发酵培养基配方(质量百分含量)：
固料：玉米面75％，豆粕10％，麸皮15％；
无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水；
固液比为1:1.8(质量比)。
简单芽孢杆菌(B.simplex)STY005大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养：将简单芽孢杆菌菌株STY005从试管斜面中挑取少量细菌，移至LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液；
②固体生产菌种的培养：将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，30℃恒温培养3～5d，中间多次振荡；
③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(32℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，干燥后即可得到芽孢杆菌原粉，菌活260亿/克。
实施例3：马铃薯疮痂病防治试验
本实施例提供了简单芽孢杆菌菌株STY005原粉对马铃薯疮痂病的防治效果的相关试验。
1)供试药剂
简单芽孢杆菌菌株STY005原粉，实施例2制备；
2)供试作物与防治对象
供试作物：马铃薯；品种为：荷兰15；防治对象：马铃薯疮痂病；
3)试验过程
试验地点：山东省肥城市安庄镇。
本试验设简单芽孢杆菌菌株STY005原粉200倍、400倍、600倍和800倍稀释，清水作对照共5个处理。于2014年6月5日采用灌根防治，小区面积50m2，重复4次。试验药剂兑水1000倍，将喷雾器喷嘴拧下，沿马铃薯植株喷灌，每666.7m2喷120kg药液，收获时每个小区三点取样，每点调查5株，检查记录马铃薯块茎危害程度，计算防治效果。
0级 薯块没有任何斑点，或损伤；
1级 薯块表面有1-5个病斑；
3级 薯块表面有6-10个病斑，病斑中央轻微凹陷；
5级 薯块表面有11-20个病斑，病斑中央显著凹陷；
7级 薯块表面有21-30个以上病斑，病斑大而显著凹陷，且大病斑都连在一起；
9级 薯块表面有30个以上病斑，大部分病斑都连在一起；
根据病理学病情指数，计算防治效果。
相对防效(％)＝(1-Pt/CK1)×100；
CK：对照区用药后病情指数；Pt：药剂处理区用药后病情指数。
4)简单芽孢杆菌菌株STY005对马铃薯疮痂病防治效果测定
表1表明，对马铃薯疮痂病防治以本发明实施例2的简单芽孢杆菌STY005原粉稀释200倍液防治效果最好，达到79.86％，稀释400倍液防治效果为76.28％，其它几种倍数不到70％。
表1 简单芽孢杆菌STY005农药对马铃薯疮痂病防治效果
注：(p＜0.05)
表2 使用简单芽孢杆菌STY005后马铃薯产量(千克)
注：(p＜0.05)
从表2可以看出，由简单芽孢杆菌菌株STY005生产的菌剂，不仅对马铃薯疮痂病具有良好防治效果，而且具有增产作用。使用该菌剂200倍和400倍，分别比对照增产20.9％和13.8％，这不仅可以预防疮痂病给马铃薯造成的外观损伤，而且具有很好经济效益。
微生物活体制剂由于不存在残留问题，因此在有机食品中生产中扮演重要较色，但有机产品操作是一项复杂的系统工程，在具备生产有机食品环境下，周期越长，失败的概率越高。马铃薯一般生产周期为4个月左右，期间许多因素就可以导致有机操作失败。除天气因素外，主要制约因素就是有害生物，尤其病害。因此，该菌株的筛选成功，具有重要价值。

Claims (9)

1.简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)菌株STY005，所述菌株的保藏编号为：CGMCCNo.11052。
2.如权利要求1所述的简单芽孢杆菌菌株STY005在防治植物叶部病害中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征是，所述植物叶部病害选自马铃薯疮痂病、葡萄霜霉病、月季白粉病、黄瓜靶斑病中的一种或几种。
4.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的简单芽孢杆菌菌株STY005。
5.权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备简单芽孢杆菌菌株STY005的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28～30℃下恒温培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28～32℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养；
所述固体培养基为：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制；其中所述固料的组分及重量比为：玉米面75％，豆粕10％，麸皮15％；按质量百分比计，所述无机盐溶液的组分及含量为：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水；
所述大量发酵培养基同固体培养基。
6.如权利要求5所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将简单芽孢杆菌的孢子移植到LB液体培养基中，28～30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28～30℃下恒温振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28～32℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
7.权利要求4所述的生物防治制剂在防治植物叶部病害中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征是，所述植物叶部病害选自马铃薯疮痂病、葡萄霜霉病、月季白粉病、黄瓜靶斑病中的一种或几种。
9.一种用于防治植物病害的生物防治方法，其特征是，包括向具有植物叶部病害的植物施用权利要求1所述的简单芽孢杆菌菌株STY005或者权利要求4的生物防治制剂。
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