CN102787075B - 一株绿色木霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种绿色木霉及其应用。本发明提供的绿色木霉的保藏编号为CGMCC No.5044，具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，可以用于防治植物土传病害。由该绿色木霉制备的生防制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生防制剂。

Description

一株绿色木霉及其应用

技术领域

本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一种能够高效防治植物土传病害的绿色木霉及其用途，以及采用该绿色木霉制备的生物防治制剂。 

背景技术

植物土传病害是一类重要的植物病害，包括根腐病、立枯病、猝倒病、枯萎病等等。真菌、细菌、线虫、病毒都是引起土传病害的土传病原物，它们通常侵染植物根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的经济损失。 

对于植物土传病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。化学防治和抗病品种目前只对少数土传病害有效，对大多数病害防效甚微，且使用化学农药还会造成农药残留，造成环境污染；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。生物防治由于克服了化学防治的上述弊病，且研究和实践已证明其对部分土传病害经济有效，因而成为防治土传病害研究的热点，越来越受到人们的重视。 

木霉（Trichoderma spp.）属于半知菌类的丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是一类广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌，从植物根圈、叶片及种子、球茎表面均可以分离到。木霉通过产生抗生素、营养竞争、重寄生、细胞壁降解酶以及诱导植物产生抗性等机制，对于多种植物病原菌具有拮抗作用，可抑制多种植物病害，是目前生防菌株中研究最为广泛的菌株之一。木霉对植物病原菌的生物防治机制是多样而复杂的，常常是多种机制共同作用的结果，不同的菌株生防机制的侧重点不同，其生防作用效果与菌株类型、病原真菌的类型、作物类型和环境条件密切相关。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于高效防治植物土传病害的新的木霉菌株——绿色木霉。本发明的绿色木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。 

本发明的另一个目的是提供一种采用该新的绿色木霉制备的能够高效防治植物土传病害的生物防治制剂。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的： 

本发明提供一种绿色木霉，所述绿色木霉的保藏编号为CGMCC No. 5044。 

本发明所提供的菌株为绿色木霉（Trichoderma viride）LLM-001，是从五莲县蘑菇上分离获得的，已于2011年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No. 5044。其具有以下生物学特性：在PDA琼脂培养基上生长快，30℃黑暗条件下培养3d，菌落直径70mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黄绿色产孢区。反面无色。菌丝聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5 μm。分生孢子椭球形、单个，近无色，聚集时呈淡绿色，壁稍粗糙，3.5-5×3-4 μm。 

该菌株的rRNA基因序列测定结果（ITS-5.8S-ITS2区）如下： 

SEQ ID NO. 1： 

本发明绿色木霉菌（Trichoderma viride）LLM-001（CGMCC No. 5044）的培养方法或繁殖方法包括： 

（1）普通培养保存采用PDA培养基，配方为马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。 

（2）实验室液体培养采用PDB培养基，配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。 

（3）固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1∶1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为60∶40的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包括3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水。 

（4）大量发酵培养基配方：同（3）中固体培养基配方。 

本发明还提供一种用于防治植物土传病害的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的绿色木霉； 

优选地，所述生物防治制剂包括所述的绿色木霉发酵原粉。 

进一步优选地，所述绿色木霉发酵原粉由包括以下步骤的方法进行制备： 

（1）制备所述绿色木霉的种子液； 

（2）将步骤（1）制备的种子液接种到固体培养基中，28℃下恒温培养； 

（3）将步骤（2）培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28℃、相对湿度85%以上的条件下（例如在室温28℃、相对湿度85%以上的发酵室中）进行发酵培养。 

其中，步骤（2）中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1∶1.8；所述固料由质量比为60∶40的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁，4%硫酸铵，剩余为水。 

并且，步骤（3）中的大量发酵培养基同固体培养基。 

并且，本发明还提供了一种用于防治植物土传病害的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有土传病害的植物施用上述绿色木霉或者上述生物防治制剂。 

本发明也提供了上述绿色木霉或者上述生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。 

就上述生物防治制剂、生物防治方法以及用途而言，所述植物土传病害可以选自灰霉病、猝倒病、疫病、根腐病、立枯病、枯萎病、黄萎病、蔓枯病、青枯病、菌核病、白粉病、褐纹病、绵腐病和绵疫病中的一种或多种；优选地，所述植物土传病害为灰霉病和/或猝倒病。 

本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤： 

(1)制备所述绿色木霉的种子液； 

(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28℃下恒温培养； 

(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28℃、相对湿度85％以上的条件下(例如在室温28℃、相对湿度85％以上的发酵室中)进行发酵培养。 

其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1：1.8；所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。 

并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基。 

在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤： 

(1)将所述绿色木霉的孢子移到PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5天得到种子液； 

(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28℃培养3～5天； 

(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，在室温28℃、相对湿度85％以上的条件下(例如在室温28℃、相对湿度85％以上的发酵室中)发酵培养8～9天。 

其中，步骤(1)中的所述PDB液体培养基包含去皮马铃薯0.2g/mL，葡萄糖0.02g/mL，剩余为蒸馏水； 

步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1：1.8；所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水； 

步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。 

实验表明，本发明的绿色木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该绿色木霉制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物病害，包括灰霉病、猝倒病、疫病、根腐病、立枯病、枯萎病、黄萎病、蔓枯病、青枯病、菌核病、白粉病、褐纹病、绵腐病、绵疫病等。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实施例1 

1、绿色木霉菌（Trichoderma viride）LLM-001（CGMCC No.5044）的分离与纯化 

本发明的绿色木霉（Trichoderma viride）LLM-001（CGMCC No.5044）是从五莲县蘑菇上采用平板划线法分离获得的，分离方法为： 

⑴木霉菌株的分离：取受害严重的蘑菇菌包，先用75%的酒精局部处理1min，再在超净工作台上用紫外灯处理20min后，用灭菌刀片切开处理部位，用接种针挑取少量木霉菌孢子，在PDA平板上划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌株，转至PDA试管斜面保存备用。 

⑵黄瓜灰霉病高效拮抗木霉菌株的筛选 

①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在木霉菌和黄瓜灰霉病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察木霉菌对病原菌的抑制作用。 

②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的木霉菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的木霉菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。 

本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治植物土传病害的绿色木霉（Trichoderma viride）LLM-001（CGMCC No.5044）。实验证明，该绿色木霉发酵原粉在防治土传病害的代表性大棚种植试验中，对辣椒猝 倒病和黄瓜灰霉病都显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的绿色木霉是具有广泛应用前景的绿色木霉新菌株，可以用于制备防治植物土传病害的生物防治制剂。 

2、菌株鉴定 

（1）微生物学特性：在PDA琼脂培养基上生长快，30℃黑暗条件下培养3d，菌落直径70mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黄绿色产孢区。反面无色。菌丝聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm。分生孢子椭球形、单个，近无色，聚集时呈淡绿色，壁稍粗糙，3.5-5×3-4μm。 

（2）分子生物学特性 

该菌株的rRNA基因序列测定结果（ITS-5.8S-ITS2区）如下： 

GGGCCCGGGATCTACTGATCGAGGTCACATTTCAGAAGTTTGGGGTGTTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCG 

CTCCCGGTGCGAGTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGGCG 

GCCCGGTGAGGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAG 

GCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATT 

CACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTT 

GATTCATTTTCGAGACGCCCGCTAGGGTCGCCGAGAAAGGCTCAGAGCAAAAATAAAACAGAGCCGCGACG 

GGAGCCGCGACGGAGAGAAAAAAGAGTTTGGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGGGGCTGCG 

ACGCGCCCGGGGCAAGAGAATCCCGCCGAGGCAACAGATTGGTAACGTTCACATTGGGGTTTGGGAGTTGT 

AAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGTT 

其中，PDA培养基配方：马铃薯200g（去皮），葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。 

实施例2 

1、绿色木霉菌发酵过程 

PDB培养基配方：马铃薯200g（去皮），葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。 

大量固体发酵培养基配方（质量百分含量）： 

固料：玉米芯60%，麸皮40% 

无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5%，硫酸镁0.04%，硫酸铵4%，剩余为水。 

固液比为1∶1.8（质量比） 

绿色木霉（Trichoderma viride）LLM-001（CGMCC No.5044）大量固 体发酵过程： 

①菌种种子液培养：将绿色木霉菌（Trichoderma viride）(LLM-001)CGMCC No.5044从试管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3~5d，此为种子液。 

②固体生产菌种的培养：将种子液按10%的比例接种到固体培养基（500mL三角瓶）中，28℃恒温培养3~5d，中间多次振荡。 

③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室（28℃和相对湿度85%以上）中发酵培养8~9d，将发酵室中的发酵物粉碎即可得到绿色木霉发酵原粉。 

实施例3 

本实施例提供了绿色木霉（Trichoderma viride）LLM-001（CGMCCNo.5044）（以下简称为绿色木霉LLM-001）原粉对黄瓜灰霉病防病增产的相关实验。 

1、供试药剂 

绿色木霉LLM-001原粉（实施例2中制备）40％咪霉胺可湿性粉剂（山东寿光双星农药有限公司生产，市售）。 

2、供试作物与防治对象 

供试作物为黄瓜，品种为长春密刺； 

防治对象为灰霉病。 

3、试验地情况 

试验地设在山东省寿光黄瓜大棚种植基地，该基地大棚黄瓜灰霉病近几年发生严重，且防治困难，试验在600平方米（0.9亩）黄瓜大棚内，土质为轻壤土，有机质含量为1.09%，pH值为6.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时黄瓜灰霉病处于发病初期。 

4、试验设计及安排 

本试验设绿色木霉LLM-001原粉10倍，40%咪霉胺可湿性粉剂600倍液及不施药清水作对照共3个处理，重复4次，共12个小区，各小区随机排列，小区面积为20m²。于2011年2月6日、2月13日和20日各喷药一次，将植株叶片上下喷洒均匀、周到，喷药时用塑料布遮挡，亩用药液60kg，喷药器械为工农-16型喷雾器。 

5、试验调查及计算方法 

（1）气象条件 

第1次施药（2011年2月6日）当日晴，风力3级，最高气温为12℃，最低气温为5℃，相对湿度为75%。第2次施药（2011年2月13日），当日晴渐多云，风力4级，最高气温为13℃，最低气温为2℃，相对湿度为70%；第3次施药（2011年2月20日）当日多云，风力3级，最高气温为10℃，最低气温为1℃，相对湿度为80%。因塑料大棚环境条件相对稳定，所以该气候对药效没有影响。 

（2）药效及安全性调查 

药效调查：第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调查。每小区采用4点取样法，每点查2株，调查全部叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。 

安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察黄瓜的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。 

分级方法（以叶片为单位）： 

0级：无病斑 

1级：病斑面积占整个叶面积的5%以下； 

3级：病斑面积占整个叶面积的6%-10%； 

5级：病斑面积占整个叶面积的11%-25%； 

7级：病斑面积占整个叶面积的26%-30%； 

9级：病斑面积占整个叶面积的50%以上； 

（3）调查时间和次数 

施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后10d调查防治结果。 

（4）药效计算方法 

药效按式（1）、（2）计算： 

式中：CK₀——空白对照区施药前病情指数； 

CK₁——空白对照区施药后病情指数； 

PT₀——药剂处理后施药前病情指数； 

PT₁——药剂处理后施药后病情指数； 

（5）对作物的直接影响 

观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。 

6、结果 

（1）供试药剂对黄瓜灰霉病的防治效果 

表1结果显示，施药7d后，绿色木霉LLM-001原粉的防治效果为77%，40％咪霉胺可湿性粉剂对黄瓜灰霉病仅有47.31%。施药28d后，绿色木霉（Trichoderma viride）(LLM-001)CGMCC No.5044原粉防治效果为79.02%，40％咪霉胺可湿性粉剂的防治效果为50.26%。两次检查结果，绿色木霉（Trichoderma viride）(LLM-001)CGMCC No.5044原粉的防治效果都明显高于对照药剂的防治效果。 

表1各个处理后黄瓜灰霉病的病情指数及防治效果 

（2）黄瓜安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，黄瓜生长正常，无药害产生，说明绿色木霉LLM-001原粉在供试浓度对黄瓜安全。 

（3）绿色木霉原粉对黄瓜增产效果 

表2绿色木霉LLM-001原粉对黄瓜增产效果分析表 

注：小区面积33.4m²；处理1为绿色木霉（Trichoderma viride）(LLM-001)CGMCCNo.5044原粉，处理2为对照组。同一行数据后有相同字母表示经Duncan多重比较后差异不显著(P<0.01)。 

由表2结果可知，在黄瓜上喷灌绿色木霉LLM-001原粉，处理区比 对照区每亩增产黄瓜1139.26kg，增产率为29.32%；效果十分明显。在P<0.01水平上具有显著性差异，说明绿色木霉LLM-001原粉的防病增产作用非常明显。 

因此，从病情指数和防治效果来看，绿色木霉（Trichoderma viride）(LLM-001)CGMCC No.5044对黄瓜灰霉病具有较好的防治效果，在一次施药后7d可达70%以上，明显好于对照药剂，差异显著。从黄瓜增产效果看，绿色木霉（Trichoderma viride）(LLM-001)CGMCC No.5044对黄瓜具有明显的促生增产效果，3次施药后增产率为29.32%。 

实施例4 

本实施例提供了绿色木霉绿色木霉LLM-001原粉对辣椒猝倒病防病增产的相关实验。 

1）供试药剂 

绿色木霉LLM-001原粉（实施例2中制备）；70％代森锰锌可湿性粉剂（市售）。 

2）供试作物与防治对象： 

供试作物为辣椒，品种为鲁椒3号； 

防治对象：猝倒病。 

3）试验地情况 

试验地设在山东省寿光辣椒大棚种植基地，该基地大棚辣椒猝倒病近几年发生严重，且防治困难，试验在600平方米（0.9亩）辣椒大棚内，土质为轻壤土，有机质含量为1.09%，pH值为6.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时辣椒猝倒病处于发病初期。 

4）试验设计及安排 

本试验设绿色木霉LLM-001原粉100倍，70%代森锰锌可湿性粉剂500倍液及不施药清水作对照共3个处理，重复4次，共12个小区，各小区随机排列，小区面积为20m²。于2011年2月6日和2月13日日各喷药一次，将植株叶片上下喷洒均匀、周到，喷药时用塑料布遮挡，亩用药液60kg，喷药器械为工农—16型喷雾器。 

5）试验调查及计算方法 

（1）气象条件 

第1次施药（2011年2月6日）当日晴，风力3级，最高气温为12℃， 最低气温为5℃，相对湿度为75%。第2次施药（2011年2月13日），当日晴渐多云，风力4级，最高气温为13℃，最低气温为2℃，相对湿度为70%；因塑料大棚环境条件相对稳定，所以该气候对药效没有影响。 

（2）药效及安全性调查 

药效调查：第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调查。每小区采用5点取样法，每点查20株，调查全部幼苗倒伏情况，调查发病率。 

安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察辣椒的安全性。 

（3）调查时间和次数 

施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后10d调查防治结果。 

（4）药效计算方法 

药效按式（1）、（2）计算： 

（5）对作物的直接影响 

观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。并记录对作物的其他影响。 

6）结果 

（1）供试药剂对辣椒猝倒病的防治效果 

表3结果显示，施药7d后，绿色木霉LLM-001原粉的防治效果为71.88%，70％代森锰锌可湿性粉剂对辣椒猝倒病仅有50%。施药14d后，绿色木霉LLM-001原粉防治效果为80.85%，70％代森锰锌可湿性粉剂的防治效果为55.32%。两次检查结果，绿色木霉LLM-001原粉的防治效果都明显高于对照药剂的防治效果。 

表3各个处理后辣椒猝倒病的发病率及防治效果 

（2）辣椒安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，辣椒生长正常，无药害产生，说明绿色木霉LLM-001原粉在供试浓度对辣椒安全。 

（3）绿色木霉原粉对辣椒增产效果 

表4绿色木霉LLM-001原粉对辣椒增产效果分析表 

注：小区面积33.4m2；处理1为绿色木霉（Trichoderma viride）(LLM-001)CGMCCNo.5044原粉，处理2为对照组。同一行数据后有相同字母表示经Duncan多重比较后差异不显著(P<0.01)。 

由表4结果可知，在辣椒上喷灌绿色木霉LLM-001原粉，处理区比对照区每亩增产辣椒37.92kg，增产率为20.14%；效果十分明显。在P<0.01水平上具有显著性差异，说明绿色木霉（Trichoderma viride）(LLM-001)CGMCC No.5044原粉的防病增产作用非常明显。 

因此，从发病率和防治效果来看，绿色木霉LLM-001对辣椒猝倒病具有较好的防治效果，在1次施药后7d可达70%以上，明显好于对照药剂，差异显著。从辣椒增产效果看，绿色木霉LLM-001对辣椒具有明显的促生增产效果，一次施药后增产率为20.14%。 

Claims (6)

1.一种用于防治植物土传病害的生物防治制剂，其特征在于，所述生物防治制剂包括保藏编号为CGMCC No.5044的绿色木霉(拉丁文学名：Trichoderma viride)的发酵原粉；其中，所述绿色木霉的发酵原粉由包括以下步骤的方法进行制备：

(1)制备所述绿色木霉的种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28℃下恒温培养；

(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28℃、相对湿度85％以上的条件下进行发酵培养；

其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1：1.8；所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水；并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)中的固体培养基。

2.根据权利要求1所述的生物防治制剂，其特征在于，所述绿色木霉的发酵原粉由包括以下步骤的方法进行制备：

(1)将保藏编号为CGMCC No.5044的绿色木霉的孢子移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5天得到种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28℃培养3～5天；

(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，在室温28℃、相对湿度85％以上的条件下发酵培养8～9天；

其中，所述步骤(1)中的PDB液体培养基包含去皮马铃薯0.2g/mL，葡萄糖0.02g/mL，剩余为蒸馏水。

3.一种用于防治植物土传病害的生物防治方法，其特征在于，所述生物防治方法包括向具有植物土传病害的植物施用根据权利要求1或2所述的生物防治制剂，其中，所述植物土传病害为灰霉病和/或猝倒病。

4.根据权利要求1或2所述的生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途，其中，所述植物土传病害为灰霉病和/或猝倒病。

5.一种生物防治制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)制备保藏编号为CGMCC No.5044的绿色木霉的种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28℃下恒温培养；

(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28℃、相对湿度85％以上的条件下进行发酵培养；

其中，所述步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的比例为质量比1：1.8，所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包括3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水；

步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)中的固体培养基。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将保藏编号为CGMCC No.5044的绿色木霉的孢子移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5天得到种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28℃培养3～5天；

(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，在室温28℃、相对湿度85％以上的条件下发酵培养8～9天；

其中，所述步骤(1)中的PDB液体培养基包含去皮马铃薯0.2g/mL，葡萄糖0.02g/mL，剩余为蒸馏水。