CN103131642B - 一株绿色木霉及培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株绿色木霉及其培养方法与应用，绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7035，保藏时间为2012年12月24日。本发明筛选的绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002作为微生物有机肥的功能菌，生长势强，适应性极强，在多种土壤环境下均可快速生长，可以快速占领空间位点和营养资源，并且可以分解土壤有机质，溶解可溶性物质，促进植物对矿物质的吸收，促进植物生长。
Description
技术领域
本发明涉及一株绿色木霉及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌。绿色木霉（Trichoderma viride）在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。绿色木霉能产生多种具有生物活性的酶系，如：纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等，在植物病理生物防治中具有重要的作用。绿色木霉是产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物有降解作用，绿色木霉又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用，具有保护和治疗双重功效，可有效防治土传性病害。
中国专利文献CN102839131A（申请号201210323738.2）公开了一株绿色木霉菌及其应用。该绿色木霉（Trichoderma viride）H06在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.6229，它对由尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种（FOC4）引起的香蕉枯萎病的防治效果可达88%，其培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
中国专利文献CN102168019A（申请号201010589866.2）公开了一种绿色木霉菌株及其代谢物的应用,属于微生物和农业领域。该绿色木霉菌株能有效拮抗黄曲霉生长,其名称为绿色木霉GZ101,于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M2010291。该绿色木霉菌株在PDA液体培养基中的发酵上清液喷洒于花生种植土壤中,能有效地降低花生收获前黄曲霉毒素污染,降低率达97%,因此可应用该绿色木霉菌株的代谢物制备成降低花生收获前黄曲霉毒素污染的制剂。
中国专利文献CN101638328A（申请号200810224245.7）公开了秸秆有机肥料及其制备方法。该降解秸秆制备肥料的方法是用降解秸秆的菌剂发酵秸秆得到肥料；所述降解秸秆的菌剂的活性成份包括绿色木霉(Trichoderma viride)、黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)和饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)。所述降解秸秆的菌剂中,所述绿色木霉(Trichoderma viride)、所述黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)和所述饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)的集落形成单位数目比为(0.8-1.2)∶(0.8-1.2)∶(0.8-1.2)。本发明的降解秸秆的肥料用作基肥,可显著改善蔬菜的品质。
因此研究绿色木霉新菌种对于开发新的微生物肥料具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株绿色木霉及培养方法与应用。
本发明技术方案如下：
一株绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7035，保藏时间为2012年12月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002的菌落生长迅速，呈致密丛束状，其表面的颜色呈绿色。菌丝有隔分枝，无厚垣孢子。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称分枝，形成二级分枝，分枝角度近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。分生孢子卵圆形，绿色，簇生于小梗顶端。
上述绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002的培养方法，步骤如下：
①用的绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002接种于平板PDA培养基，在温度25℃～30℃条件下，培养72h；
②挑取菌落边缘菌丝转接于麸皮汁培养基中，培养温度25℃～30℃，200rpm，培养时间24～36h，制得绿色木霉培养液；
③以1～5%（w/w）的接种量将步骤②制得的绿色木霉JUWEI培养液接种于麸皮汁发酵培养基中，发酵条件为：温度28～30℃，罐压：0.05Mpa，通风0.8～1vvm，搅拌速度180～200rpm，培养时间为2～3天，即得。
根据本发明优选的，所述步骤①中的平板PDA培养基，每升组分如下：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；
根据本发明优选的，所述步骤②中的麸皮汁培养基组分如下，均为重量百分比：麸皮10%，蔗糖3-5%，自然pH值；
根据本发明优选的，所述步骤②中的麸皮汁发酵培养基组分如下，均为重量百分比：麸皮6%，蔗糖3%，自然pH值。
上述绿色木霉JUWEI002在制备微生物肥料中的应用。
有益效果
1、本发明筛选的绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002作为微生物有机肥的功能菌，生长势强，适应性极强，在多种土壤环境下均可快速生长，可以快速占领空间位点和营养资源。该菌能产生多种具有生物活性的酶系，如纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等，可以分解土壤有机质，溶解可溶性物质，可以促进植物对矿物质的吸收，促进植物生长；
2、本发明选用绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002可有效防治土传性病害；
3、本发明选用绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002丰富的菌丝可以附着和交绕土壤微粒，提高土壤稳定性和通透性，打破土壤板结。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7035，保藏时间为2012年12月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实施例1
绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7035，保藏时间为2012年12月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI由秸秆中分离出的绿色木霉原始菌株，经过紫外线诱变处理（1×106个/ml的菌悬液放于直径9cm的培养皿内，紫外灯预热20min，将培养皿至于磁力搅拌器上并使培养皿在10W紫外灯垂直距离25cm左右，照射90S），筛选出具有较高菌丝生长速率、纤维素酶活性和抑菌活性的菌株。
绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI的菌落生长迅速，呈致密丛束状，其表面的颜色呈绿色。菌丝有隔分枝，无厚垣孢子。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，侧枝上对称分枝，形成二级分枝，分枝角度近于直角，在分枝末端形成瓶状小梗。分生孢子卵圆形，绿色，簇生于小梗顶端。
将筛选出的该菌株连续转接10代，其优良性状遗传稳定。
原始菌株和突变菌株摇瓶培养5天后菌丝干重和发酵液的滤纸酶（FPA）、纤维素酶（CMC）内切型-β-葡聚糖酶（C1酶）、外切型-β-葡聚糖酶（CBH酶）活性，结果如表1所示。由表1可知，突变株（绿色木霉JUWEI002）在生长过程中比原始菌株具有更强的促进土壤有机质分解，提高土壤控肥能力和土壤酶活性的效果。
盆栽实验中绿色木霉JUWEI002对黄瓜黄萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）的防治效果如表1所示。
表1绿色木霉诱变结果
实施例2
上述绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002的培养方法，步骤如下：
①用绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002接种于平板PDA培养基，在温度25℃～30℃条件下，培养72h；
②挑取菌落边缘菌丝转接于麸皮汁培养基中，培养温度25℃～30℃，200rpm，培养时间24～36h，制得绿色木霉培养液；
③以1～5wt%的接种量将步骤②制得的绿色木霉培养液接种于麸皮汁发酵培养基中，发酵条件为：温度28～30℃，罐压：0.1Mpa，通风0.8～1vvm，搅拌速度180～200rpm，培养时间为2～3天，即得。
所述步骤①中的平板PDA培养基，每升组分如下：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；
所述步骤②中的麸皮汁培养基组分如下，均为重量百分比：麸皮10%，蔗糖5%，自然pH值；
所述步骤②中的麸皮汁发酵培养基组分如下，均为重量百分比：麸皮6%，蔗糖3%，自然pH值。
经检测，发酵液中菌体浓度为9×108个/ml。
Claims (4)
1.一株绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002，其特征在于该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.7035，保藏时间为2012年12月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002的培养方法，其特征在于，步骤如下：
① 用绿色木霉（Trichoderma viride）JUWEI002接种于平板PDA培养基，在温度25℃～30℃条件下，培养72h；
② 挑取菌落边缘菌丝转接于麸皮汁培养基中，培养温度25℃～30℃，200rpm，培养时间24～36h，制得绿色木霉培养液；
③以1～5%（w/w）的接种量将步骤②制得的绿色木霉培养液接种于麸皮汁发酵培养基中，发酵条件为：温度28～30℃，罐压：0.05Mpa，通风0.8～1vvm，搅拌速度180～200rpm，培养时间为2～3天，即得；
所述步骤②中的麸皮汁培养基组分如下，均为重量百分比：麸皮10%，蔗糖3-5%，自然pH值；
或者，麸皮6%，蔗糖3%，自然pH值。
3. 如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤①中的平板PDA培养基，每升组分如下：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。
4. 权利要求1所述绿色木霉JUWEI002在制备微生物肥料中的应用。
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