CN102925366B - 一株绿色木霉及其在黄瓜上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株绿色木霉及其在黄瓜上的应用。该绿色木霉（Trichoderma viride）菌株为WLTR16，保藏编号为CGMCC No.6671。该菌株及包括该菌株的生物防治制剂能够高效防治黄瓜病害。实验表明，本发明的绿色木霉菌株WLTR16具有生长速度快、产孢量大、作用谱广，在黄瓜叶片、根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该绿色木霉WLTR16制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治黄瓜病害，还能有效提高黄瓜产量。
Description
技术领域
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一种能够高效防治黄瓜灰霉病、立枯病、菌核病的绿色木霉及其用途，以及采用该绿色木霉制备的生物防治制剂。
背景技术
黄瓜作为我国最主要的蔬菜品种之一，目前栽培面积已经超过100万公顷，居世界首位。但随着黄瓜栽培面积的扩大及栽培方式的多样化，其菜田生态环境已发生较大变化，使各种病害发生日趋严重，病原菌的抗药性也不断升级，这已成为制约黄瓜产量提高的主要因素。据报道，我国黄瓜病害达50余种，其中常年发生且造成较大经济损失的主要病害有灰霉病、立枯病、霜霉病、菌核病、细菌性角斑病、白粉病、黑星病、枯萎病、炭疽病、黄瓜疫病及根结线虫病等10种，严重制约着黄瓜生产。
针对上述黄瓜主要病害，目前防治手段主要靠化学农药结合优化栽培管理。化学农药虽然可以防治黄瓜主要病害，但是长期使用容易造成农药残留超标与环境污染，进而影响农民经济效益与群众身体健康。同时上述化学农药普遍具有较高抗药性。生物农药具有毒性较小、环境友好及不易产生抗药性等优点，通过研制防治黄瓜主要病害的生物农药，实现生产过程无公害化，可以在保证较好防治效果同时解决农药残留超标及抗药性等问题，符合未来绿色农业发展的趋势。
木霉（Trichodrma spp.）属于半知菌类的丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是一类广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌，从植物根圈、叶片及种子、球茎表面均可以分离到。木霉通过产生抗生素、营养竞争、重寄生、细胞壁降解酶以及诱导植物产生抗性等机制，对于多种植物病原菌具有拮抗作用，可抑制多种植物病害，是目前生防菌株中研究最为广泛的菌株之一。木霉对植物病原菌的生物防治机制是多样而复杂的，常常是多种机制共同作用的结果，不同的菌株生防机制的侧重点不同，其生防作用效果与菌株类型、病原真菌的类型、作物类型和环境条件密切相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治黄瓜灰霉病、立枯病、菌核病的新的木霉菌株——绿色木霉WLTR16。本发明的绿色木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广及在黄瓜叶片、根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明的另一个目的是提供一种采用绿色木霉WLTR16制备的能够高效防治黄瓜病害的生物防治制剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种绿色木霉（Trichoderma viride）菌株WLTR16，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.6671。
本发明所提供的绿色木霉菌株WLTR16，是从五莲县蘑菇上分离获得的，已于2012年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No.6671。其具有以下生物学特性：在PDA琼脂培养基上生长快，30℃黑暗条件下培养3d，菌落直径80mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黄绿色产孢区。反面无色。菌丝聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm。分生孢子椭球形、单个，近无色，聚集时呈淡绿色，壁稍粗糙，3.5-5×3-4μm。该菌株的rRNA基因序列测定结果（ITS-5.8S-ITS2区）如SEQ-1所述。
本发明绿色木霉菌（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）的培养方法或繁殖方法包括：
（1）普通培养保存采用PDA培养基，配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL；
（2）实验室液体培养采用PDB培养基，配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
（3）固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；所述无机盐溶液按质量百分比计，包括3.5%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，0.5%硫酸钙，4%硫酸铵，氯霉素0.05%，剩余为水。
（4）大量发酵培养配方：同（3）中固体培养基配方
本发明还提供一种用于防治黄瓜主要病害的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的绿色木霉WLTR16。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
（1）制备所述绿色木霉WLTR16的种子液；
（2）将步骤（1）制备的种子液接种到固体培养基中恒温培养；
（3）将步骤（2）培养的培养物用无菌水稀释，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基中进行发酵培养。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将绿色木霉的孢子移植到PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
（2）将步骤（1）制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28℃下振荡培养3～5d；
（3）将步骤（2）培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至发酵培养基，室温28℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8～9d。
本发明还提供了一种用于防治黄瓜灰霉病、菌核病、立枯病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向发病的黄瓜叶片或者根部施用上述绿色木霉WLTR16或者上述生物防治制剂。
本发明也提供了上述绿色木霉菌WLTR16或者上述生物防治制剂在防治黄瓜病害中的用途。
实验表明，本发明的绿色木霉菌株WLTR16具有生长速度快、产孢量大、作用谱广，在黄瓜叶片、根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该绿色木霉WLTR16制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治黄瓜病害，还能有效提高黄瓜产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该生物防治制剂可以作为防治黄瓜病害的生物农药或生物肥料，防治多种黄瓜灰霉病、菌核病、立枯病等。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、绿色木霉菌（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）的分离与纯化
本发明的绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）是从五莲县蘑菇上采用平板划线法分离获得的，分离方法为：
⑴木霉菌株的分离：取受害严重的蘑菇菌包，先用75%的酒精局部处理1min，再在超净工作台上用紫外灯处理20min后，用灭菌刀片切开处理部位，用接种针挑取少量木霉菌孢子，在PDA平板上划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌株，转至PDA试管斜面保存备用。
⑵黄瓜灰霉病、立枯病高效拮抗木霉菌株的筛选
①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在木霉菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜立枯病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察木霉菌对病原菌的抑制作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的木霉菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的木霉菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
其中，PDA培养基配方：马铃薯200g（去皮），葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治黄瓜灰霉病、立枯病、菌核病的绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）。实验证明，该绿色木霉原粉在防治黄瓜病害的代表性大棚种植试验中，对黄瓜灰霉病和立枯病都显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的绿色木霉是具有广泛应用前景的绿色木霉新菌株，可以用于制备防治黄瓜病害的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
（1）微生物学特性：在PDA琼脂培养基上生长快，30℃黑暗条件下培养3d，菌落直径80mm。菌落初期白色稀疏，后期形成黄绿色产孢区。反面无色。菌丝聚隔，分枝。分生孢子梗形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5-10×2.5-3.5μm。分生孢子椭球形、单个，近无色，聚集时呈淡绿色，壁稍粗糙，3.5-5×3-4μm。
（2）分子生物学特性
该菌株的rRNA基因序列测定结果（ITS-5.8S-ITS2区）如下（SEQ-1）：GGGCCCGGGATCTACTGATCGAGGTCACATTTCAGAAGTTTGGGGTGTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTGTGCAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGGCGGCCCGGTGAGGGGCCGATCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTCGAGACGCCCGCTAGGGTCGCCGAGAAAGGCTCAGAGCAAAAATAAAACAGAGCCGCGACGGGAGCCGCGACGGAGAGAAAAAAGAGTTGGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGGGGCTGCGACGCGCCCGGGGCAAGAGAATCCCGCCGAGGCAACAGATTGGTAACGTTCAATTGGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGTT
实施例2
1、绿色木霉菌发酵过程
PDB培养基配方：马铃薯200g（去皮），葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
大量固体发酵培养基配方（质量百分含量）：
固料：玉米芯60%，麸皮40%
无机盐溶液：3.5%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，0.5%硫酸钙，4%硫酸铵，氯霉素0.05%，剩余为水。
固液比为1:1.8（质量比）
绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养：将绿色木霉菌（T.viride）WLTR16（CGMCCNo.6671）从试管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。
②固体生产菌种的培养：将种子液按10%的比例接种到固体培养基（500mL三角瓶）中，28℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。
③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室（28℃和相对湿度85%以上）中发酵培养8～9d，即可得到木霉菌原粉。
实施例3
本实施例提供了绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉对黄瓜灰霉病防病增产的相关实验。
1、供试药剂
绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉（实施例2中制备）；40％咪霉胺可湿性粉剂（山东寿光双星农药有限公司生产，市售）。
2、供试作物与防治对象
供试作物为黄瓜，品种为长春密刺；
防治对象为灰霉病。
3、试验地情况
试验地设在山东省寿光黄瓜大棚种植基地，该基地大棚黄瓜灰霉病近几年发生严重，且防治困难，试验在1.2亩黄瓜大棚内，土质为轻壤土，有机质含量为1.08%，pH值为6.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时黄瓜灰霉病处于发病初期。
4、试验设计及安排
本试验设绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉200倍、400倍、40%咪霉胺可湿性粉剂600倍液及不施药清水作对照共4个处理，重复4次，共16个小区，各小区随机排列，小区面积为20m2。于2012年3月9日、3月16日和23日各喷药一次，将植株叶片上下喷洒均匀，喷药时用塑料布遮挡，亩用药液60kg，喷药器械为工农—16型喷雾器。
5、试验调查及计算方法
（1）气象条件
第1次施药（2012年3月9日）当日晴，风力3级，最高气温为15℃，最低气温为7℃，相对湿度为70%；第2次施药（2012年3月16日），晴，风力2级，最高气温为17℃，最低气温为7℃，相对湿度为70%；第3次施药（2012年3月23日）当日晴转多云，风力2级，最高气温为17℃，最低气温为8℃，相对湿度为75%。因塑料大棚环境条件相对稳定，所以该气候对药效没有影响。
（2）药效及安全性调查
药效调查：第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调查。每小区采用4点取样法，每点查2株，调查全部叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察黄瓜的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
分级方法（以叶片为单位）：
0级：无病斑
1级：病斑面积占整个叶面积的5%以下；
3级：病斑面积占整个叶面积的6%-10%；
5级：病斑面积占整个叶面积的11%-25%；
7级：病斑面积占整个叶面积的26%-30%；
9级：病斑面积占整个叶面积的50%以上；
（3）调查时间和次数
施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后14d调查防治结果。
（4）药效计算方法
药效按式（1）、（2）计算：
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0——药剂处理后施药前病情指数；
PT1——药剂处理后施药后病情指数；
（5）对作物的直接影响
观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。
6、结果
（1）供试药剂对黄瓜灰霉病的防治效果
表1结果显示，施药7d后，绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉200倍的防治效果为81.84%，400倍的防治效果为77.12%，40％咪霉胺可湿性粉剂对黄瓜灰霉病仅有51.21%。施药28d后，绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉200倍防治效果为83.16%，400倍的防治效果为79.10%，40％咪霉胺可湿性粉剂的防治效果为44.46%。两次检查结果，绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉200倍、400倍的防治效果都明显高于对照药剂的防治效果。
表1 各个处理后黄瓜灰霉病的病情指数及防治效果
（2）黄瓜安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，黄瓜生长正常，无药害产生，说明绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCCNo.6671）原粉在供试浓度对黄瓜安全。
（3）绿色木霉原粉对黄瓜增产效果
表2 绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉对黄瓜增产效果分析表
注：小区面积33.4m2；处理1为绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉200倍，处理2为绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉400倍，处理3为对照组。表中数据后不同的字母表示经Duncan多重比较后差异显著（P<0.01）。
由表2结果可知，在黄瓜上喷灌绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCCNo.6671）原粉200倍液，400倍液处理区比对照区每亩增产黄瓜分别为1080.91kg、849.70kg，增产率分别为27.55%、21.66%；效果十分明显。说明绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉的防病增产作用非常明显。
因此，从病情指数和防治效果来看，绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCCNo.6671）对黄瓜灰霉病具有较好的防治效果，在一次施药后7d可达75%以上，明显好于对照药剂，差异显著。从黄瓜增产效果看，绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）对黄瓜具有明显的促生增产效果，3次施药后增产率为21.66%。
实施例4
本实施例提供了绿色木霉（T.viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉对黄瓜立枯病防病的相关实验。
1）供试药剂
绿色木霉（Trichoderma viride）WLTR16（CGMCC No.6671）原粉（实施例2中制备）；70％代森锰锌可湿性粉剂（市售）。
2）供试作物与防治对象：
供试作物为黄瓜，品种为密刺；
防治对象：立枯病。
3）试验地情况
试验地设在山东省寿光黄瓜大棚种植基地，该基地大棚黄瓜立枯病近几年发生严重，且防治困难，试验在600平方米（0.9亩）黄瓜大棚内，土质为轻壤土，有机质含量为1.09%，pH值为6.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时黄瓜立枯病处于发病初期。
4）试验设计及安排
本试验设绿色木霉WLTR16原粉200倍、400倍、70%代森锰锌可湿性粉剂500倍液及不施药清水作对照共4个处理，重复4次，共16个小区，各小区随机排列，小区面积为20m2。于2011年2月6日和2月13日各喷药一次，将植株叶片上下喷洒均匀、周到，喷药时用塑料布遮挡，亩用药液60kg，喷药器械为工农—16型喷雾器。
5）试验调查及计算方法
（1）气象条件
第1次施药（2012年2月6日）当日晴，风力3级，最高气温为15℃，最低气温为7℃，相对湿度为70%。第2次施药（2012年2月13日），晴，风力2级，最高气温为17℃，最低气温为7℃，相对湿度为70%。因塑料大棚环境条件相对稳定，所以该气候对药效没有影响。
（2）药效及安全性调查
药效调查：第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调查。每小区采用5点取样法，每点查20株，调查全部幼苗倒伏情况，调查发病率。
分级方法：
0级：无病症
1级：胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常；
3级：胚轴或子叶出现明显坏死斑，或一片子叶黄化，影响生长；
5级：两片子叶黄化，或一片子叶枯死；
7级：两片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长；
9级：整株萎蔫、倒伏或枯死；
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察黄瓜的安全性。
（3）调查时间和次数
施药前调查病情基数，下次施药前及末次施药后14d调查防治结果。
（4）药效计算方法
药效按式（1）、（2）计算：
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0——药剂处理后施药前病情指数；
PT1——药剂处理后施药后病情指数；
（5）对作物的直接影响
观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。并记录对作物的其他影响。
6）结果
（1）供试药剂对黄瓜立枯病的防治效果
表3结果显示，施药7d后，绿色木霉WLTR16原粉200倍、400倍的防治效果分别为72.38%、69.75%，70％代森锰锌可湿性粉剂对黄瓜立枯病仅有52.14%。施药14d后，绿色木霉WLTR16原粉50倍、100倍防治效果分别为75.34%、71.44%，70％代森锰锌可湿性粉剂的防治效果为45.67%。两次检查结果，绿色木霉WLTR16原粉的防治效果都明显高于对照药剂的防治效果。
表3 各个处理后黄瓜立枯病的发病率及防治效果
（2）黄瓜安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，黄瓜生长正常，无药害产生，说明绿色木霉WLTR16原粉在供试浓度对黄瓜安全。
Claims (1)
1.一种制备生物防治制剂的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将绿色木霉（Trichoderma viride）菌株WLTR16的孢子移植到PDB液体培养基中，28 ℃摇床振荡培养3~5 d得到种子液；所述绿色木霉菌株WLTR16的保藏编号为CGMCC No. 6671；
（2）将步骤（1）制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28℃下振荡培养3~5 d；
（3）将步骤（2）培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28℃、相对湿度85%以上的发酵室中发酵培养8~9 d；
所述PDB培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；所述固体培养基为：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制；其中所述固料由质量比为60：40的玉米芯和麸皮组成；所述无机盐溶液按质量百分比计，包括3.5%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，0.5%硫酸钙，4%硫酸铵，0.05%氯霉素，剩余为水；所述大量发酵培养基同固体培养基。
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