CN108587922B

CN108587922B - 一株侧耳木霉及其在防治冬枣炭疽病中的应用

Info

Publication number: CN108587922B
Application number: CN201810343839.3A
Authority: CN
Inventors: 刘慇; 张淑静; 牛赡光; 刘盛芳; 刘幸红; 秦绪兵
Original assignee: Shandong Academy of Forestry
Current assignee: Shandong Academy of Forestry
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: CN108587922A

Abstract

本发明公开了一株侧耳木霉及其在防治冬枣炭疽病中的应用。本发明的菌株为侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola)菌株SDLTr16，是从东营市小清河河泥中分离获得的，已于2012年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6694。试验表明：本发明的侧耳木霉菌生物防治制剂对冬枣炭疽病均有较好的效果，防治效果76.83‑92.40％。

Description

一株侧耳木霉及其在防治冬枣炭疽病中的应用

技术领域

本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株侧耳木霉及其防治冬枣炭疽病中的应用，以及采用该侧耳木霉菌制备的生物防治制剂。

背景技术

冬枣为中国特有的晚熟枣品种，营养丰富，含有Vc、环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷等，对人类多种疾病具有良好的医疗保健作用。冬枣是黄三角流域主要经济果木，也是当地的主导产业之一，发展势头迅猛，仅沾化县种植面积就达50万亩，产量3亿kg。近几年来冬枣病害发生日趋严重。冬枣炭疽病(winter jujube anthracnose)是由炭疽菌属真菌引起的一类重要病害，各冬枣产区均有发生，已成为制约冬枣产业快速健康发展的主要障碍之一。冬枣炭疽病主要危害冬枣果实，可导致果实腐烂和提早落果，使品质下降，产量降低。冬枣炭疽病的防治，目前的防治方法就是盲目使用化学杀菌剂。长期使用化学杀菌剂，带来的一系列严重问题：农药残留、环境污染、抗药性产生、伤及非靶标生物以至于破坏生态平衡等。同时在植物病害的控制中，随着病菌抗药性的不断形成与提高，以及人们越来越担心食物链中化学残留物对健康的影响，要求降低果蔬产品用药量的呼声越来越高，越来越多的化学杀菌剂使用受到了限制，有些已被明令禁止使用。

木霉(Trichoderma spp.)，属于半知菌类的丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科，是一类广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上的真菌，从植物根圈、叶片及种子、球茎表面均可以分离到。木霉是自然界普遍存在并有丰富资源的拮抗微生物。木霉菌生长繁殖速度快，能够迅速占领营养空间，可分泌产生抗生素抑制其他病原菌生长，还可以通过营养竞争、重寄生、细胞壁降解酶以及诱导植物产生抗性等作用机制，达到抑制病害的目的，是生防菌株中研究最为广泛的菌株之一。目前已经发现的木霉菌30多个种中的许多具有生防潜力，如绿色木霉、哈茨木霉、康宁木霉、刺孢木霉和侧耳木霉等，对18个属29种植物病原菌表现出拮抗活性。木霉对植物病原菌的生物防治机制是多样而复杂的，常常是多种机制共同作用的结果，不同的菌株生防机制的侧重点不同，其生防作用效果与菌株类型、病原真菌的类型、作物类型和环境条件密切相关。

本发明发明人曾分离到一种高效解磷的耐盐侧耳木霉菌。但是，侧耳木霉用于防治冬枣炭疽病还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于防治冬枣炭疽病的新木霉菌株——侧耳木霉菌株菌株SDLTr16。本发明的侧耳木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物(尤其是冬枣)根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola)菌株SDLTr16，是从东营市小清河河泥中分离获得的，已于2012年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.6694。其具有以下生物学特性：在PDA培养基上，28℃黑暗条件下培养5天，菌落直径扩展75mm，初期白色稀疏，后变为灰绿色，絮状。反面无色。菌丝具隔，分枝。分生孢子梗便形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，6-9×3-5μm。分生孢子椭球形、单个、近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑或稍粗糙，4～5×3～4μm。

本发明侧耳木霉菌株SDLTr16的培养方法或繁殖方法包括：

(1)普通培养保存采用PDA培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL；

(2)实验室液体培养采用PDB培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；

(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液按质量比1:0.7配制，其中固料的组分及重量比为：玉米芯50％，玉米粉10％，熟化豆粕粉5％，麸皮25％，稻壳10％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。

(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。

本发明还提供一种包括所述的侧耳木霉菌株SDLTr16的生物防治制剂。

本发明还提供了上述生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备侧耳木霉菌株SDLTr16的种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3～5天；

(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。

其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液按质量比1:0.7配制，其中固料的组分及重量比为：玉米芯50％，玉米粉10％，熟化豆粕粉5％，麸皮25％，稻壳10％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基。

在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将侧耳木霉菌株SDLTr16的孢子移植到PDB液体培养基中，28-30℃摇床振荡培养3～5天得到种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振荡培养3～5天；

(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，室温28℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9天。

本发明还提供了上述侧耳木霉菌株SDLTr16或者上述生物防治制剂在防治冬枣炭疽病中的应用。

本发明还提供了一种用于防治冬枣炭疽病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有冬枣炭疽病的冬枣施用上述侧耳木霉菌株SDLTr16或者上述生物防治制剂。

实验表明，本发明的侧耳木霉菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物(尤其是冬枣)根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该侧耳木霉菌株制备的生物防治制剂，可以防治冬枣炭疽病，是一种极具应用前景的生物防治制剂。试验表明：2亿活孢子/侧耳木霉菌可湿性粉剂400-600倍液对冬枣炭疽病均有较好的效果，防治效果76.83-92.40％。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、侧耳木霉菌株SDLTr16的分离与纯化

本发明的侧耳木霉菌株SDLTr16是从东营市小清河河泥中采用稀释平板法和平板划线法分离获得，分离方法为：

(1)分离：河泥样品取自东营市小清河。称取1g河泥于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10^-2、10^-3、10^-4稀释液涂布于孟加拉红培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养3天后挑取孟加拉红培养基上的不同形态的微生物菌落于孟加拉红培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化木霉菌株，分别编号保存。

(2)冬枣炭疽病高效拮抗木霉菌株的筛选

①初筛：采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在木霉菌、冬枣炭疽病菌边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察木霉菌对病原菌的抑制作用。

②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的木霉菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的木霉菌株，进行盆栽防治试验和田间试验，并对筛选得到的木霉菌株SDLTr16进行鉴定。

本发明人通过大量筛选工作得到一株能够防治冬枣炭疽病的侧耳木霉菌(T.pleuroticola)SDLTr16。实验证明，该侧耳木霉在冬枣炭疽病病上显示出非常高效的防治效果。因而，本发明的侧耳木霉是具有广泛应用前景的侧耳木霉新菌株，可以用于制备防治冬枣炭疽病病的生物防治制剂。

2、菌株鉴定

(1)微生物学特性：在PDA培养基上，28℃黑暗条件下培养5天，菌落直径扩展75mm，初期白色稀疏，后变为灰绿色，絮状。反面无色。菌丝具隔，分枝。分生孢子梗便形成松柏式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，6-9×3-5μm。分生孢子椭球形、单个、近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑或稍粗糙，4～5×3～4μm。

(2)分子生物学特性

该菌株的rRNA基因序列测定结果(ITS-5.8S-ITS2区)如下(SEQ-1)：

TCGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACCAAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCAAAACTCTTATTGTATACCCCCTCGCGGGCTTTTTTATAATCTGAGCCTTCTCGGCGCCCCTCGTGGGCGTTTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCTCCCTCTGCGGGGGCCGTCTCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACAGCCGTTAAACACCCAACTTTCTGAAATGTGACCTCGATCAGGTAGAATCCCGC。

其中，PDA培养基配方：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL。孟加拉红培养基配方：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，1％孟加拉红溶液3.3mL，丙酸钠3.5g，链霉素0.03g，水1000mL，pH自然。

实施例2

1、侧耳木霉菌株SDLTr16发酵过程

PDB培养基配方：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

固体发酵培养基配方(质量百分含量)：固料：玉米芯50％，玉米粉10％，熟化豆粕粉5％，麸皮25％，稻壳10％；无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。固液比为1:0.7(质量比)。

大量发酵培养基配方同固体培养基。

侧耳木霉菌株SDLTr16的大量固体发酵过程：

①菌种种子液培养：将侧耳木霉菌株SDLTr16从试管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5天，此为种子液，菌活为0.15-0.30cfu/ml；

②固体生产菌种的培养：将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28℃恒温培养3～5天，中间多次振荡；

③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9天，发酵液干燥后即可得到侧耳木霉菌原粉，活菌数为40-50亿/克。

④可湿性粉剂

配方(重量比)：侧耳木霉菌原粉(活菌数为40亿/克)5％，葡萄糖40％，淀粉15％，湿润剂1004 6％，分散剂NNO 2％，CMC(羧甲基纤维素钠)1％，白炭黑余量。

实施例3

本实施例提供了侧耳木霉菌株SDLTr16可湿性粉剂对冬枣炭疽病防治效果的相关实验。

1)试验地点

试验在山东省滨州市沾化区下河乡冬枣园内进行，该园地处黄河故道属滨海盐碱地，肥力一般。供试品种沾化冬枣2号，树龄5年生，栽培密度为3×3m，管理水平一般，往年枣树黑斑病发生较重。病果率达60％左右，严重地块达80％以上。

2)供试药剂

2亿活孢子/克侧耳木霉菌SDLTr16可湿性粉剂(实施例2制备)，70％代森锰锌WP(中国·河北双吉化工有限公司产品，市售)。

防治对象：冬枣炭疽病(winter jujube anthracnose)。

3)实验处理

试验分为2亿活孢子/克侧耳木霉菌可湿性粉剂WP400倍、600倍、800倍，以70％代森锰锌WP 600倍为标准对照，喷清水为空白对照，共5个处理，4次重复，20个小区，每小区4株树，随机排列。

4)施药日期和方法

枣树萌芽初期(4月13日)喷施一次，始花期喷施一次，花期结束后至采收前20天，每隔15-20天喷施1次(共5次)。喷药机械为背负式喷雾器，折合亩喷药液300kg，喷撒时内膛、外围、正面、反面均匀。

5)效果调查

方法：采收前，调查各处理树枣果发病情况，每种处理树分东西南北中5个方位，每个方位调查20个枣吊，每个枣吊按健、病果数统计，计算病果率及防治效果。

计算公式如下：

6)结果与分析

试验结果如表1所示，从表1可以看出，侧耳木霉菌SDLTr16可湿性粉剂不同浓度对冬枣炭疽病均有较好的防治效果，其中以600倍、400倍的效果最好，病果率仅为4.90-7.38％，防效达87.93-92.40％，相比对照药剂70％代森锰锌WP600倍(病果率18.40％，防效70.27％)，差异显著。

表1 2亿活孢子/克侧耳木霉菌可湿性粉剂防治冬枣炭疽病的效果调查原始数据(2016)

6)评价

2亿活孢子/克侧耳木霉菌可湿性粉剂是的一种较好生物杀菌剂药剂，其400-600倍处理对冬枣炭疽病均有较好的效果，防治效果76.83-92.40％，从经济有效角度考虑，建议生产上推广应用浓度以400-600倍为宜。

根据实验结果观测，2亿活孢子/克侧耳木霉菌可湿性粉剂防治冬枣炭疽病在使用浓度400-800倍没有药害，在此范围内使用安全。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省林业科学研究院

<120> 一株侧耳木霉及其在防治冬枣炭疽病中的应用

<130> 0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 613

<212> DNA

<213> 侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola）菌株SDLTr16的rRNA基因序列（ITS-5.8S-ITS2区）

<400> 1

tcggaagtaa aaagtcgtaa caaggtctcc gttggtgaac cagcggaggg atcattaccg 60

agtttacaac tcccaaaccc aatgtgaacg ttaccaaact gttgcctcgg cgggatctct 120

gccccgggtg cgtcgcagcc ccggaccaag gcgcccgccg gaggaccaac caaaactctt 180

attgtatacc ccctcgcggg cttttttata atctgagcct tctcggcgcc cctcgtgggc 240

gtttcgaaaa tgaatcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga 300

acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 360

aacgcacatt gcgcccgcca gtattctggc gggcatgcct gtccgagcgt catttcaacc 420

ctcgaacccc tccggggggt cggcgttggg gatcggccct ccctctgcgg gggccgtctc 480

cgaaatacag tggcggtctc gccgcagcct ctcctgcgca gtagtttgca cactcgcacc 540

gggagcgcgg cgcgtccaca gccgttaaac acccaacttt ctgaaatgtg acctcgatca 600

ggtagaatcc cgc 613

Claims

1.侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola)菌株SDLTr16，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.6694。

2.权利要求1所述的侧耳木霉菌株SDLTr16在防治冬枣炭疽病中的应用。

3.一种包括权利要求1所述的侧耳木霉菌株SDLTr16的生物防治制剂。

4.权利要求3所述的生物防治制剂在防治冬枣炭疽病中的应用。

5.一种用于防治冬枣炭疽病的生物防治方法，其特征是，包括向具有冬枣炭疽病的冬枣施用权利要求1所述的侧耳木霉菌株SDLTr16或者权利要求3所述的生物防治制剂。