CN108441443B - 一株防治植物线虫的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株防治植物线虫的菌株及其应用。本发明所提供的菌株Y149属于马赛菌属 (Massilia sp.)，已于2017年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M 2017745。本发明还提供了含有该菌株Y149的微生物菌剂及其制备方法，并将上述菌株Y149或微生物菌剂应用于制备防治植物线虫的产品中。本发明的菌株Y149或微生物菌剂对植物线虫具有很好的防治效果，且成本低，对环境友好。

Description

一株防治植物线虫的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株防治植物线虫的菌株及其应用。

背景技术

线虫(nematode)属于线形动物门的线虫纲(Class Nematoda)，根据生活周期和生活环境，可分为自由生活线虫、动物寄生性线虫和植物寄生性线虫。其中，由于植物寄生性线虫寄主范围广、致病性强，自身繁殖速度快并极易传播，现已成为威胁农业生产的世界性土传病原物。目前，植物寄生性线虫是制约我国农业可持续发展的主要因素。

当前在农业生产中，防治植物寄生性线虫的方法主要依靠传统的化学防治，但化学药剂通常具有剧毒，长期使用可能使植物寄生性线虫产生抗药性。同时，传统化学杀线剂的使用会产生农药残留，对生态环境以及人体健康产生负面影响。因此，寻找高效、安全、无污染的绿色生物防治方法已成为当下的迫切需求。

生物防治措施既对人畜安全，对环境友好，又能够有效防控植物线虫病害的发生与蔓延。筛选有益微生物菌株，利用微生物及其代谢产物进行根结线虫生物防治是一种高效、环境友好型的防治措施。植物寄生线虫的天敌包括真菌、细菌、放线菌、病毒、捕食性线虫、昆虫和原生动物等。真菌和细菌是自然界土壤中占绝对优势的微生物，是植物线虫生物防控的重要微生物。目前报道的具有杀线虫潜力的生防菌主要包括多种真菌和不同种类的生防细菌，但是关于利用马赛菌属菌株防治植物线虫病害的研究尚未被报道过。

发明内容

基于此，有必要针对上述化学防治方法对生态环境和人体健康产生负面影响的技术问题，提供一种对生态环境和人体健康友好的马赛菌属菌株以及在防治植物线虫中的应用。

本发明解决上述技术问题的方案如下：

本发明提供的一株防治线虫菌株，经鉴定为马赛菌属(Massilia sp.)，命名为Y149，已于2017年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M 2017745。

本发明还提供了一种含有马赛菌属菌株Y149的微生物菌剂。

本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

斜面种子培养：将马赛菌属菌株Y149的菌体划线至斜面培养基上获得斜面种子；

液体种子培养：从斜面挑取经活化的单菌落接种于种子培养基中培养获得种子培养液；

发酵培养：按2％-5％的接种量将种子培养液接入发酵培养基，振荡培养获得发酵培养物；

发酵液的制备：收集发酵培养的发酵液，制备成微生物液体或固体菌剂。

在其中一个实施例中，所述斜面种子培养的条件为30℃，培养时间为36h；所述液体种子培养的条件为200r/min，30℃，培养时间为36h；所述发酵培养的条件为30℃，转速为200r/min，发酵时间为72h；所述种子培养基和发酵培养液均为牛肉膏蛋白胨培养基。

在其中一个实施例中，所述发酵培养中，按5％的接种量将种子培养液接入发酵培养基中。

本发明还提供了所述马赛菌属菌株或所述微生物菌剂在制备防治植物线虫的产品中的应用。

在其中一个实施例中，所述产品的活性成分包括所述马赛菌属菌株Y149及其发酵培养物(包括发酵上清液和菌体)的至少一种。

本发明还提供了所述马赛菌属菌株Y149或所述的微生物菌剂在制备生物肥料中的应用。

本发明还提供一种生物肥料，该生物肥料含有所述马赛菌属菌株Y149及马赛菌属菌株的发酵培养物的至少一种。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供了一株新的马赛菌属(Massilia sp.)菌株Y149，该菌株具有良好的防治植物线虫活性，为植物线虫生物防治的研发奠定了基础。

2.本发明提供了含有马赛菌属(Massilia sp.)菌株Y149的微生物菌剂及其制备方法；该微生物菌剂可应用于制备防治植物线虫的产品中，对生态环境及人体健康友好。制备和使用过程均十分简单、方便，在生产过程中没有使用有机溶剂，从而降低了对环境的污染程度。

附图说明

图1为本发明一实施例的马赛菌属菌株Y149的菌落形态图。

图2为本发明一实施例的马赛菌属菌株Y149的系统发育树。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一株马赛菌属(Massilia sp.)菌株，命名为Y149，已于2017年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2017745。

为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。

实施例1：马赛菌属菌株Y149的分离与鉴定

(1)分离纯化

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，1000mL去离子水，pH7.4，121℃灭菌30min。

本发明人从湖南省长沙市采集植物根际土壤样品，自然风干后，称取10g样品溶于90ml无菌水中，制成土壤悬浮液。然后用无菌水10倍梯度稀释，吸取10^-3和10^-4的土壤悬浮液100μl，均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上。将上述平板放入培养箱中30℃培养36h-48h后，根据菌落形态、颜色和大小挑取不同菌落，并分别在新的牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行纯化，直至获得纯菌落并编号保存。

(2)形态和生理化鉴定

在纯菌落菌株进行革兰氏染色后，将菌株划线分离、培养，采用光学显微镜进行革兰氏染色观察，生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》。

形态特征：菌落在培养基上表面粗糙不透明，微黄色，菌体呈短杆状，革兰氏反应呈阴性。

生理生化特性：生理生化鉴定结果如表1所示。

表1菌株主要生理生化特征

指标	结果	指标	结果
				接触酶	+	V-P实验	+
氧化酶	+	明胶液化实验	+
				淀粉水解	+	尿素水解	-
酪素水解	+	甲基红实验	-
				硝酸盐还原	+

注：+表示阳性，-表示阴性。

(3)16S rDNA序列鉴定和系统发育树比对

通过试剂盒提取菌株DNA，采用上海生工生物工程有限公司合成的扩增通用引物(8F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R 5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16S rDNA的PCR扩增。扩增产物纯化后连接到pMD18-T(Takara)克隆载体中，筛选阳性克隆载体至上海生工生物工程有限公司测序。

扩增反应体系为：10×Buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTPs 1μL，引物各0.5μL，马赛菌属菌体DNA 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，加去离子水至25μL。

PCR反应条件：94℃4min，94℃45s，55℃40s，72℃60s；30个循环；最后于72℃修复延伸10min，4℃条件下终止反应。

PCR产物采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的片段回收，回收产物测序工作由上海生工生物工程有限公司完成。测序结果通过在线分析，与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行比对，选取序列相似性较高的典型菌株的基因序列作为参比对象，应用Mega 6.0的邻接法Neighbor-Joining(NJ)方法构建系统发育树(稳定性检测重复取样1000次)，如图2所示，并进行系统进化分析。

根据16S rDNA序列分析结果，综合考虑菌株的菌落形态特征、生理生化特征，鉴定此菌株为马赛菌属(Massilia sp.)菌株，编号Y149。

实施例2：微生物菌剂的制备

牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠10g，1000mL去离子水，pH7.4，121℃灭菌30min。

(1)斜面种子培养：将马赛菌属菌株(Massilia sp.)Y149的菌体无菌划线至牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面上，30℃下培养36h获得斜面种子；

(2)液体种子培养：从斜面上挑取经活化的单菌落接种于NB培养基中培养，200r/min，30℃，培养时间为24h，获得种子培养液；

(3)发酵培养：按5％的接种量将种子培养液接入NB培养基，30℃，转速为200r/min，发酵时间为72h，获得OD600＝4的发酵液，活菌数为3.5×10⁸cfu/ml；

(4)菌剂的制备：收集发酵培养的发酵液，制备成微生物液体或固体菌剂。

实施例3：马赛菌属菌株Y149致死植物线虫的活性检测

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g～20g，水1000mL。

(1)发酵上清液的制备：马赛菌属菌株Y149按实施例2的方法进行发酵培养72h，得到OD600＝4的发酵体系悬液，以10000r/min离心10min，收集上清液备用。

(2)线虫悬浮液的制备：本实施例采用的马铃薯腐烂茎线虫，由湖南农业大学植物线虫实验室保存。培养前将半裸镰刀菌接种到PDA平板，在25℃培养7～10d，待菌丝长满整个平板后，在无菌条件下接入马铃薯腐烂茎线虫悬液100μL，25℃培养7d-10d，待半裸镰刀菌丝消失，线虫长满平板。用Berman漏斗法分离线虫，制成线虫悬浮液备用。

本实施例采用的拟禾本科根结线虫为二龄幼虫，通过拟禾本科根结线虫侵染的水稻病根分离获得。洗净根表土后切取带有大量根结的病根，用解剖镊子从病根上挑取新鲜、饱满、成熟的卵块。然后将卵块放入装有无菌水的灭菌平板中，28℃静置孵化，收集孵化的根结线虫二龄幼虫备用。

本实施例采用的旱稻孢囊线虫二龄幼虫，将采集到的病土采用蔗糖液离心法分离孢囊，并用水稻土浸液在28℃静置孵化。收集孵化的旱稻孢囊线虫二龄幼虫悬浮液备用。

1.菌株Y149发酵上清液对马铃薯腐烂茎线虫的毒杀作用

以马铃薯腐烂茎线虫为初筛靶标线虫，采用触杀法测定。在6孔板的每孔中加入0.9mL待测菌株Y149发酵上清液和0.lmL马铃薯腐烂茎线虫悬浮液(约100条线虫)，放入28℃恒温箱中孵化。同时，设置无菌培养液为空白阴性CK对照，试验重复三次。分别在24h和48h后在倒置显微镜下观察，根据以下公式计算其校正死亡率。

死亡率(％)＝死亡的线虫数/观察的线虫总数×100

校正死亡率(％)＝(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)×100

表2菌株Y149发酵上清液对马铃薯腐烂茎线虫的杀虫活性

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检测，P≤0.05)

通过对表2实验结果的分析可得，添加了发酵上清液的处理组在处理24h和48h后，马铃薯腐烂茎线虫的平均校正死亡率达到了90.62％和93.94％。结果表明菌株Y149的发酵上清液对马铃薯腐烂茎线虫具有显著致死效果。

2.菌株Y149的发酵上清液对多种植物线虫的毒杀作用

(1)不同浓度马赛菌属菌株的发酵上清液在不同时间点对马铃薯腐烂茎线虫致死率

将发酵液的上清液原液配制为50％和20％稀释液，同时取原液及上述两个浓度的稀释液各0.9mL加入6孔板中，同时每孔加入0.1mL马铃薯腐烂茎线虫悬浮液(约100条线虫)，放入28℃恒温箱中培养，实验重复3次，设置相应稀释倍数无菌培养基为空白CK对照。分别于2h、6h、12h、24h、36h、48h在倒置显微镜下观察，计算出校正死亡率，实验结果如表3所示。

表3不同浓度的发酵上清液在不同时间点对马铃薯腐烂茎线虫校正致死率

从表3的实验结果可得，不同浓度的发酵液上清液均对马铃薯腐烂茎线虫具有良好的致死率，发酵上清液从6h开始显示出了良好的杀虫活性。并且进一步发现马铃薯腐烂茎线虫死亡数目与发酵上清液的浓度和处理时间呈正相关。

(2)菌株Y149发酵上清液对拟禾本科根结线虫二龄幼虫的致死率

以拟禾本科根结线虫二龄幼虫为靶标线虫，将马赛菌属菌株发酵液的上清液原液配制为20％稀释液，检测该稀释液对室内的拟禾本科根结线虫的生防效果。设置20％稀释无菌培养基为空白CK对照，处理时间分别为24h和48h，实验结果如表4。

表4发酵上清液的20％稀释液对拟禾本科根结线虫J2的致死活性测定

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检测，P≤0.05)

由表4可得，菌株Y149发酵上清液的20％稀释液对拟禾本科根结线虫具有显著杀虫活性。

(3)菌株Y149发酵上清液对旱稻孢囊线虫二龄幼虫的致死率

以旱稻孢囊线虫二龄幼虫为靶标线虫，将菌株Y149发酵液的上清液原液配制为20％稀释液，检测该稀释液对旱稻孢囊线虫二龄幼虫的室内生防效果。设置20％稀释无菌培养基为空白CK对照，处理时间分别为24h和48h，实验结果如表5。

表5发酵液的上清液的20％稀释液对旱稻孢囊线虫J2的致死活性测定

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检测，P≤0.05)

由表5可得，菌株Y149发酵上清液的20％稀释液对旱稻孢囊线虫具有显著杀虫活性。

综上结果说明马赛菌属(Massilia sp.)菌株Y149主要是通过产生活性发酵培养产物防治线虫，对多种植物线虫都具有显著的毒杀效果，具有比较好的防治广谱性。

实施例4：马赛菌属菌株Y149的发酵液对拟禾本科根结线虫防治的盆栽实验

将菌株Y149生物发酵液配置成10％，20％和50％的稀释液样品，其中，发酵液的OD600为4.0。将带有拟禾本科水稻根结线虫的病土搅拌均匀，加入200g病土于高15cm直径10cm的苗盆，每盆加入45ml不同浓度菌株发酵液与病土搅拌均匀。将催芽露白的水稻种子种入苗盆，每盆种5粒，3盆重复，设清水作为CK对照，放入温室培养。培养条件为18h光照，6h黑暗，28℃恒温培养，每天每盆浇等量的水以保持土壤湿润，20天后调查水稻根部根结形成情况。将植株带根挖出(尽可能保持根系完整)，用自来水洗干净，进行根结调查，计算防治效果。根结分级标准：0级，无根结；1级，根结小且数量极少；2级，根结小且数量稍多，易观察；3级，根结小，数量较多，根系功能未受影响；4级根结数量较多，有较大根结；5级，25％-49％的根系上有根结，根系功能未受影响；6级，50％-74％的根系上有根结，根系正常功能受到影响；7级，75％以上根系有根结，失去根系功能；8级，无健康根系，植株仍存活；9级，整个根系出现腐烂，植株趋于死亡；10级，植株死亡。

按下面的计算公式计算根结指数和防治效果：

根结指数＝∑(各级病株数×相应级数值)/(调查总株数×10)×100

防治效果(％)＝(1-对照组根结指数)/处理组根结指数×100

通过上述的温室盆栽实验，清洗水稻根部进行观察。处理组和对照组均有根结形成，但是相对CK对照，菌株处理组根系根结明显变小，数量也大幅度减少。与对照CK相比，菌株Y149的发酵液可以大幅度降低水稻的根结指数，有效的防控水稻根结线虫，如表6所示。菌株Y149的50％稀释发酵液处理组平均根结指数为24.11，相对对照的平均根结指数63.57，防治效果达到62.04％，菌株10％的稀释发酵液防治效果也可达到51.65％。盆栽结果显示该菌株对拟禾本科根结线虫侵染具有良好的防控效果。

表6菌株Y149发酵液对拟禾本科根结线虫的盆栽防治效果

注：表中字母不同表示差异显著(SPSS 17.0t检测，P≤0.05)

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一株防治植物线虫的菌株及其应用

<141> 2018-03-22

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> Massilia sp.

<400> 1

gcggtagctc ttgttcgact tcaccccagt cacgaatcct accgtggtaa gcgccctcct 60

tgcggttaag ctacctactt ctggtaaaac ccgctcccat ggtgtgacgg gcggtgtgta 120

caagacccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccaact 180

tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg gactacgata cactttctgg gattagctcc 240

ccctcgcggg ttggcggccc tctgtatgta ccattgtatg acgtgtgaag ccctacccat 300

aagggccatg aggacttgac gtcatcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctca 360

ttagagtgcc ctttcgtagc aactaatgac aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 420

aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtgttcagg ctccctttcg 480

ggcaccctcc ratctctcgg argktyctga catgtcaagg gtaggtaagg tttttcgcgt 540

tgcatcgaat taatccacat catccaccgc ttgtgcgggt ccccgtcaat tcctttgagt 600

tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg tctacttcac gcgttagctg cgttaccaag 660

tcaattaaga cccgacaact agtagacatc gtttagggcg tggactacca gggtatctaa 720

tcctgtttgc tccccacgct ttcgtgcatg agcgtcagtc ttgacccagg gggctgcctt 780

cgccatcggt gttcctccac atctctacgc atttcactgc tacacgtgga attctacccc 840

ccctctgcca gactccagcc ttgcagtctc caacgcaatt cccaggttga gcccggggat 900

ttcacgtcag acttacaaaa ccgcctgcgc acgctttacg cccagtaatt tccgattaac 960

gcttgcaccc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccggtgc ttattcttca 1020

ggtaccgtca ttagccgaag gtattatcct cagccgtttc ttccctgaca aaagagcttt 1080

acaacccgaa ggccttcttc actcacgcgg cattgctgga tcaggcttgc gcccattgtc 1140

caaaattccc cactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc 1200

tggtcgtcct ctcagaccag ctactgatcg tcgccttggt gagcctttac ctcaccaact 1260

agctaatcag acatcggccg ctccaaaagc atgaggcccg aaggtccccc actttcttcc 1320

gtagaacgta tgcggtatta gcgtaacttt cgctacgtta tcccccactt ctgggtacgt 1380

tccgatgtat tactcacccg ttcgccactc gccgccaggt tgccccgcgc tgccgttcga 1440

cttgcatggt aaagctgccg cattgct 1467

Claims (9)

1.一种防治植物线虫的菌株，经鉴定为马赛菌属(Massilia sp.)菌株，编号Y149，于2017年12月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2017745。

2.一种含有权利要求1所述的马赛菌属菌株的微生物菌剂。

3.一种如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

斜面种子培养：将马赛菌属菌株的菌体划线至斜面培养基上获得斜面种子；

液体种子培养：从斜面挑取经活化的单菌落接种于种子培养基中培养，获得种子培养液；

发酵培养：按2％-5％的接种量将种子培养液接入发酵培养基，振荡培养获得发酵培养物；

发酵液的制备：收集发酵培养的发酵液，制备成微生物液体或固体菌剂。

4.根据权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述斜面种子培养的条件为30℃，培养时间为36h；所述液体种子培养的条件为200r/min，30℃，培养时间为36h；所述发酵培养的条件为30℃，转速为200r/min，发酵时间为72h；所述斜面培养基、种子培养基和发酵培养基均为牛肉膏蛋白胨培养基。

5.根据权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养中，按5％的接种量将种子培养液接入发酵培养基。

6.如权利要求1所述的马赛菌属菌株或权利要求2所述的微生物菌剂在制备防治植物线虫的产品中的应用。

7.一种防治植物线虫的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包括权利要求1所述的马赛菌属菌株或其发酵培养物。

8.权利要求1所述的马赛菌属菌株或权利要求2所述的微生物菌剂在制备生物肥料中的应用。

9.一种生物肥料，其特征在于，所述生物肥料包括权利要求1所述的马赛菌属菌株或其发酵培养物。

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