CN105112324B - 一种产二甲基二硫醚(dmds)的恶臭马赛菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种恶臭马赛菌及其应用。本发明的恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM‑7是一个微生物新物种，已于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No:11070。其能产二甲基二硫醚(DMDS)，在防治土传病害和研发新型土壤熏蒸剂上具有重要的应用价值。

Description

一种产二甲基二硫醚(DMDS)的恶臭马赛菌及其应用

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能产二甲基二硫醚(Dimethyldisulfide,DMDS)的细菌新物种—恶臭马赛菌及其应用。

背景技术：

土壤熏蒸剂能够有效防治土传病害，在农业生产中的被广泛应用。其中，溴甲烷在过去的几十年是最常用的熏蒸剂，但由于其破坏大气臭氧层，严重危害到地球环境和人类健康，在《蒙特利尔议定书》中被列为限控物质，2015年以后将在世界范围内被禁止使用。二甲基二硫醚(DMDS)对害虫具有触杀和胃毒作用，对作物具有一定渗透性，但无内吸传导作用，杀虫广谱，作用迅速，是联合国溴甲烷技术选择委员会提出的一种新型的土壤熏蒸剂替代品。研究表明二甲基二硫醚(DMDS)具有杀灭土壤线虫、土壤病原真菌、杂草及地下害虫的效果，对土壤中的线虫及有害真菌均具有较强的防治效果，作为新型的土壤熏蒸剂得到了广泛的认可。目前，关于产二甲基二硫醚的微生物及其在土壤病虫害防治应用中的研究尚未见报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能够产二甲基二硫醚(DMDS)的微生物新物种—恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7。该菌株于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No:11070。

本发明的恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7能产生二甲基二硫醚，而二甲基二硫醚是一种极为重要的防治土传病害的新型土壤熏蒸剂的主要成分。

因此，本发明的第二个目的是提供恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7在制备二甲基二硫醚中的应用。

本发明的第三个目的是提供恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7在制备土壤熏蒸剂中的应用。

本发明的恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7，其是一种微生物新种，能产二甲基二硫醚(DMDS)，在防治土传病害和研发新型土壤熏蒸剂上具有重要的应用价值。

本发明的恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7已于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No:11070。

附图说明：

图1为本发明的恶臭马赛菌6NM-7的透射电子显微镜照片；

图2为本发明的恶臭马赛菌6NM-7基于其16S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树；

图3为本发明的恶臭马赛菌6NM-7产二甲基二硫醚(DMDS)的GC-MS分析，图3A为恶臭气体的GC分析，图3B为4.6min的组份经过质谱分析为二甲基二硫醚(DMDS)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明做进一步的说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、恶臭马赛菌6NM-7的分离。

本发明的恶臭马赛菌6NM-7是从江西大余县钨矿区采集的矿砂样品中分离培养得到的。具体分离方法为：取10g矿砂样品于装有90mL无菌水的三角瓶中，180rpm摇床振荡过夜，取上清液1mL按10倍梯度逐级稀释，分别将0.1mL不同梯度的稀释液涂布于R2A培养基上。30℃倒置培养7天。挑取不同形态的菌落过程中获得菌株6NM-7(恶臭马赛菌(Massiliaputida)6NM-7)。

所述的R2A培养基配方为：酵母提取物0.5g,蛋白胨0.5g,酸水解干酪素0.5g,葡萄糖0.5g,可溶性淀粉0.5g,K₂HPO₄0.3g,MgSO₄·7H₂O 0.05g,丙酮酸钠0.3g,琼脂粉20g,双蒸水1000mL，pH 7.0～7.4。将上述组份混合均匀后，灭菌备用。

二、恶臭马赛菌6NM-7的鉴定

1.表型特征：将菌株6NM-7采用三区划线接种于R2A培养基上，置于30℃培养箱培养3天，取出观察菌落特征。细胞形态观察(图1)、革兰氏染色、淀粉水解、运动性实验、接触酶等测定参见《常见细菌鉴定手册》。氧化酶、β-半乳糖苷酶、尿酶、精氨酸双水解酶、葡萄糖发酵、吲哚、硝酸盐还原、水解七叶灵和明胶等采用API 20NE试剂条。恶臭马赛菌6NM-7对不同碳氮源的利用情况则分别采用了API 20NE和Biolog GNⅢ，操作按照说明书进行。

形态特征：菌株6NM-7在R2A平板上30℃培养72h后菌落呈灰白色，圆形，边缘规则，表面粗糙，不透明(图1)，菌落散发出强烈的农药气味。细胞呈杆状，单端有鞭毛，运动，无芽孢，好氧生长。

生理生化特征：菌株6NM-7为革兰氏染色为阴性，氧化酶、β-半乳糖苷酶、尿酶、精氨酸双水解酶、葡萄糖发酵、吲哚、硝酸盐还原、水解七叶灵均为阴性，接触酶、淀粉水解和明胶水解均为阳性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、N-乙酰-葡萄糖胺、麦芽糖、葡萄糖酸盐、海藻糖、蔗糖和D-半乳糖，但不能利用已二酸、苹果酸、苯乙酸、柠檬酸、癸酸、甘露醇、乳糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水杨苷、3-甲酰葡萄糖、D-岩藻糖和肌苷。

将本发明的菌株6NM-7与其同源性最高的马赛菌属已发表模式菌株进行了生理生化特征的比较，结果如表1所示。

表1 菌株6NM-7与同源性最高的模式菌株微生物学特性比较

注1：“1”表示Massilia putida 6NM-7；“2”表示M.norwichensis LMG 28164^T；“3”表示M.kyonggiensis KACC17471^T；“4”表示M.niastensis KACC 12599^T；“5”表示M.tieshanensis KACC 14940^T；“6”表示M.haematophila CCUG 38318^T；“7”表示M.namucuoensis CGMCC 1.11014^T；“8”表示M.aerilata KACC 12505^T.

注2：“+”表示阳性；“-”表示阴性；“w”表示弱阳性；“ND”表示未测定。

2.遗传发育分析：采用细菌通用引物27F和1492R进行菌株6NM-7的16S rRNA基因的PCR扩增，将获得的PCR产物经过切胶回收后克隆测序，获得其序列信息(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将序列信息与NCBI数据库进行Blast比对，得到与其相似度最高的已发表模式种信息。采用生物学软件MEGA5构建菌株6NM-7的NJ系统发育树，如图2所示。

16S rRNA基因扩增和序列比对发现与Massilia putida 6NM-7(菌株6NM-7)最大相似度模式菌株为Massilia norwichensis LMG 28164^T(98.7％),Massiliakyonggiensis KACC 17471^T(98.4％),Massilia niastensis KACC 12599^T(97.8％),Massilia tieshanensis KACC 14940^T(97.3％),Massilia haematophila CCUG 38318^T(97.2％),Massilia namucuonensis CGMCC 1.11014^T(97.1％)和Massilia aerilataKACC 12505^T(97.1％)。遗传发育分析发现该菌株属于马赛菌属(Massilia)，在进化树上与除Massilia haematophila CCUG 38318^T和Massilia tieshanensis KACC 14940^T的其他最大相似度模式菌株聚成一簇。DNA-DNA杂交结果显示Massilia putida 6NM-7与Massilianorwichensis LMG 28164^T,Massilia kyonggiensis KACC 17471^T,Massilia niastensisKACC 12599^T,Massilia tieshanensis KACC 14940^T,Massilia haematophila CCUG38318^T,Massilia namucuonensis CGMCC 1.11014^T和Massilia aerilata KACC 12505^T杂交率分别为：59.7±4.8％、48.1±3.0％、42.3±2.0％、19.8±3.7％、45.0±1.2％、20.3±1.8％和24.3±1.2％，DNA-DNA杂交结果均小于70％，即小于国际公认的新种临界值(Wayneet al.,1987)，这表明Massilia putida 6NM-7(菌株6NM-7)可能为马赛菌属的一个新物种。

3.化学分类特征：DNA的G+C含量测定方法Mesbah et al.(1989)。DNA-DNA杂交采用Lambda 35紫外可见分光光度计测定，方法参照De Ley et al.(1970)。脂肪酸提取和测定采用MIDI公司的标准方法(Sasser,1990)。

将本发明的Massilia putida 6NM-7与其同源性最高的马赛菌属已发表模式种进行了脂肪酸组成成分的比较，结果如表2所示。

表2 Massilia putida 6NM-7与同源性最高的模式菌株脂肪酸组成比较(％)

脂肪酸	1	2	3	4	5	6	7	8
									C10:0	<1	<1	<1	<1	<1	<1	<1	<1
C10:0 3-OH	5.8	6.1	9.3	5.3	6.5	4.1	3.9	4.8
									C12:0	1.8	4.1	4.6	4.9	6.3	4.6	4.8	3.3

C12:0 2-OH

ND

ND

ND

2.0

3.6

1.3

<1

<1

C14:1 ω5c

ND

ND

ND

ND

ND

<1

ND

<1

C14:0

4.3

4.5

6.2

<1

ND

<1

<1

1.9

C15:0

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

C14:0 2-OH

2.6

1.5

3.0

ND

ND

ND

ND

2.0

iso-C16:0

ND

ND

<1

<1

ND

ND

ND

ND

Summed feature 3

21.8

34.5

15.9

47.8

45.5

41.6

51.5

38.6

C16:0

33.2

32.8

31.7

25.7

21.0

32.8

32.5

32.2

C17:1 ω8c

ND

ND

ND

ND

ND

ND

<1

ND

C17:0 cyclo

20.8

11.0

18.5

2.5

2.2

5.7

<1

6.1

C17:0

ND

ND

ND

ND

ND

ND

<1

<1

C18:1 ω7c

7.4

5.4

9.3

9.9

14.4

8.6

3.9

9.9

C18:0

<1

ND

ND

ND

ND

<1

ND

<1

iso-C19:0

<1

ND

ND

ND

ND

<1

ND

<1

C19:0 cycloω8c

<1

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

注1：“1”表示Massilia putida 6NM-7；“2”表示M.norwichensis LMG 28164^T；“3”表示M.kyonggiensis KACC17471^T；“4”表示M.niastensis KACC 12599^T；“5”表示M.tieshanensis KACC 14940^T；“6”表示M.haematophila CCUG 38318^T；“7”表示M.namucuoensis CGMCC 1.11014^T；“8”表示M.aerilata KACC 12505^T.

注2：“Summed feature 3”表示C_16:1 ω7c和/或C_16:1 ω6c；“ND”表示未检测到该组分；“<1”表示该组份含量小于脂肪酸总体含量的1％；

综合表型特征、遗传发育分析、化学分类特征，本发明的菌株6NM-7是马赛菌属的一个新物种，将其命名为恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7，已于2015年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No:11070。

三、恶臭马赛菌6NM-7产二甲基二硫醚(DMDS)的测定：

挑取本发明的恶臭马赛菌6NM-7的单菌落，接种至200mL的液体R2A培养基中，180rpm摇床30℃振荡培养3天。采用一次性注射器吸取三角瓶中的恶臭气体，通过气相色谱质谱仪(GC-MS)进行分析。测试结果发现农药气味的恶臭气体主要成分为二甲基二硫醚(DMDS)，如图3所示。图3A为恶臭气体的GC分析，在4.6min和6.8min分别产生了两个峰。图3B为4.6min的组份经过质谱分析为二甲基二硫醚(DMDS)。6.8min为柱流失成分。

由于二甲基二硫醚是一种极为重要的新型土壤熏蒸剂，本发明提供的产二甲基二硫醚(DMDS)的恶臭马赛菌6NM-7在防治土传病害和研发新型土壤熏蒸剂上具有重要的应用价值。

Claims (3)

1.恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7，保藏编号为CGMCC No:11070。

2.权利要求1所述的恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7在制备二甲基二硫醚中的应用。

3.权利要求1所述的恶臭马赛菌(Massilia putida)6NM-7在制备土壤熏蒸剂中的应用。