CN107384816A - 一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株及其分离鉴定方法和应用 - Google Patents
一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株及其分离鉴定方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株，保藏号为CGMCC NO.13055。从烟田土样中获得，该菌株用于降解烟碱。本发明还公开了其分离鉴定方法。本发明的有益效果是：该菌株具有较高生物活性，培养简单，遗传性质稳定，烟碱降解率较高，可用于降解烟草或烟草废弃物中的烟碱，达到降低烟叶烟碱的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株及其分离鉴定方法和应用。
背景技术
烟碱俗称尼古丁(Nicotine)，是普通烟草中的生物碱，也是烟草的重要成分，其作用主要在于它所产生的生理强度，即通常所说的劲头，该强度与烟碱含量成正比。烟碱会使人上瘾或产生依赖性，影响人们的健康。有报道指出，烟碱不仅会增加心脏速度和升高血压，也会导致血管内皮功能障碍。2000年，全球大约有490万例与吸烟相关的猝死病例发生。吸烟引发了至少30％的癌症死亡和87％的肺癌死亡。因此，烟草中烟碱含量过高会严重危害烟民的健康，可通过降低烟碱含量来减少吸烟引发的疾病。
虽然目前已有一些降低烟草中烟碱含量的方法，如浸提法和农业措施，但这些技术在降低烟碱的同时，也会对香烟的品质产生影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种降低烟叶烟碱含量、提高烟叶可用性、用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株及其分离鉴定方法和应用。
发明人在研究发现，一些微生物可以降解烟碱，如嗜烟碱节杆菌、假单胞杆菌属、无色杆菌、石膏样小孢子菌、球形节杆菌等。这些微生物可以通过不同的代谢途径来降解烟碱，也可以分解烟叶中的烟碱但不会影响香烟的主要品质。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
本发明提供了一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株，菌株代号为ND9，该菌株于2016年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.13055。菌株是从中国农业科学院烟草研究所试验农场的烟田土样中获得。
本发明还提供了所述的用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的分离方法，包括以下步骤：
S1、样品采集：土样采自中国农业科学院烟草研究所试验农场的烟田，将采集的土样在室温下自然风干，然后用研钵将风干的土样研碎，备用。
S2、配制培养基：
富集培养基：13.3g K2HPO4·3H2O，4g KH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.5mL微量元素溶液，定容至1L，pH7.0。121℃高压蒸汽灭菌20min后，烟碱用0.22μm滤膜过滤菌后根据需要加入，4℃保存。
分离培养基：富集培养基中添加质量百分比为1.5％琼脂。
筛选培养基：改变分离培养基中烟碱浓度。
LB固体培养基：25gLB肉汤，18g琼脂粉，定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
微量元素溶液：0.05g CaCl2·2H2O、0.05g CuCl2·2H2O、0.008g MnSO4·H2O、0.004g FeSO4·7H2O、0.1g ZnSO4和0.1g Na2MoO4·2H2O，用0.1mol/L HCL溶解定容至1L。
S3、降解菌的分离、纯化：将2g烟田土样加入到100mL(烟碱含量为0.5g/L)富集培养基的三角瓶中，28℃、150rpm富集培养4天，然后取10mL培养物转接至另一100mL(烟碱含量为0.5g/L)富集培养基中培养4天，达到富集的目的，再接入筛选培养基(烟碱含量为1.0g/L)，重复3次。通过平板稀释法将培养物涂布于LB固体培养基上，28℃下培养48h。经富集分离，筛选到能够耐受烟碱的细菌，代号为ND9。将分离得到的菌株先接种到固体筛选培养基(烟碱含量为1.0g/L)上，后接种到液体筛选培养基(烟碱含量为1.0g/L)上进行纯化，4℃保存。
所述的一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的分离方法包括恶臭假单胞菌菌株的鉴定步骤。
所述的一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的鉴定方法，包括以下步骤：
将纯化好的菌株接种到LB固体培养基上，28℃培养24h，纯化好的菌株进行生理生化测定，革兰氏染色，运动性，氧化酶反应，VP试验，淀粉水解，明胶液化，吲哚，葡萄糖的利用；并以F27(5’‐AGAGTTTGATCATGGCTCAG‐3’)和R1492(5’‐TACGGTTACCTTGTTACGACTT‐3’)为引物，PCR扩增ND9菌株16SrDNA基因，扩增产物进1％琼脂糖凝胶电泳；同时，将ND9菌株的16SrDNA序列在NCBI网站中进行BLAST序列比对，选出与该序列相关性较高的红球菌属15个菌株的16sDNA用于系统发育学分析。采用Clustal W软件进行多序列比对分析，用Mega 4.0程序构建系统发育进化树。
所述的恶臭假单胞菌菌株的应用，用于降解烟碱。
本发明具有以下优点：
本发明提供的恶臭假单胞菌菌株具有较高生物活性，培养简单，遗传性质稳定，适用于固态的烟叶烟碱的降解，达到降低烟叶烟碱的目的。
附图说明
图1为ND9系统发育树图；
图2为pH对ND9菌株的比生长速率及降解烟碱的影响图(烟碱浓度：1.0g/L，28℃，150rpm)；
图3为培养温度对ND9菌株的比生长速率及降解烟碱的影响图(烟碱浓度：1.0g/L，pH7.0，150rpm)；
图4为烟碱浓度对ND9菌株的比生长速率及降解烟碱的影响图(28℃，pH7.0，150rpm)。
具体实施方式
下面结合附图及实验对本发明做进一步的描述：
一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株，菌株代号为ND9，该菌株于2016年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.13055。菌株是从中国农业科学院烟草研究所试验农场的烟田土样中获得。
所述的用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的分离方法，包括以下步骤：
S1、样品采集：土样采自中国农业科学院烟草研究所试验农场的烟田，将采集的土样在室温下自然风干，然后用研钵将风干的土样研碎，备用。
S2、配制培养基：
富集培养基：13.3g K2HPO4·3H2O，4g KH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.5mL微量元素溶液，定容至1L，pH7.0；121℃高压蒸汽灭菌20min后，烟碱用0.22μm滤膜过滤菌后根据需要加入，4℃保存；
分离培养基：富集培养基中添加质量百分比为1.5％琼脂；
筛选培养基：改变分离培养基中烟碱浓度；
LB固体培养基：25gLB肉汤，18g琼脂粉，定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min；
微量元素溶液：0.05g CaCl2·2H2O、0.05g CuCl2·2H2O、0.008g MnSO4·H2O、0.004g FeSO4·7H2O、0.1g ZnSO4和0.1g Na2MoO4·2H2O，用0.1mol/L HCL溶解定容至1L。
S3、降解菌的分离、纯化：将2g烟田土样加入到100mL烟碱含量为0.5g/L的富集培养基的三角瓶中，28℃、150rpm富集培养4天，然后取10mL培养物转接至另一100mL烟碱含量为0.5g/L的富集培养基中培养4天，达到富集的目的，再接入烟碱含量为1.0g/L的筛选培养基，重复3次，通过平板稀释法将培养物涂布于LB固体培养基上，28℃下培养48h，经富集分离，筛选到能够耐受烟碱的细菌，代号为ND9，将分离得到的菌株先接种到烟碱含量为1.0g/L的固体筛选培养基上，后接种到烟碱含量为1.0g/L的液体筛选培养基上进行纯化，4℃保存。
所述的恶臭假单胞菌菌株的分离方法还包括鉴定步骤。
所述的用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的鉴定方法，包括以下步骤：将纯化好的菌株接种到LB固体培养基上，28℃培养24h，纯化好的菌株进行生理生化测定，革兰氏染色，运动性，氧化酶反应，VP试验，淀粉水解，明胶液化，吲哚，葡萄糖的利用；并以F27(5’‐AGAGTTTGATCATGGCTCAG‐3’)和R1492(5’‐TACGGTTACCTTGTTACGACTT‐3’)为引物，PCR扩增ND9菌株16SrDNA基因，扩增产物进1％琼脂糖凝胶电泳；同时，将ND9菌株的16SrDNA序列在NCBI网站中进行BLAST序列比对，选出与该序列相关性较高的红球菌属15个菌株的16sDNA用于系统发育学分析，采用Clustal W软件进行多序列比对分析，用Mega 4.0程序构建系统发育进化树。
具体的，利用合适的Biolog GN来检测降解烟碱的性能。结果表明，经过24h培养后，分离得到的菌株反应强烈，其中与95个碳源中的45个碳源反应强烈，但与其他18个碳源反应微弱。根据Biolog GN的鉴定结果，ND9菌株的反应情况与恶臭假单胞杆菌相似，相似性达94％且相似指数为0.511。
按照常规方法进行形态结构观察及生理生化实验。革兰氏阴性鉴定结果表明，菌株ND9的生理生化特征与恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌的相似性达85％，与铜绿假单胞菌的相似性为15％。明胶液化试验显示菌株ND9可能不是荧光假单胞菌。因此，ND9菌株为假单胞菌属一种，与恶臭假单胞菌关系相近。
ND9菌株总DNA的提取、PCR扩增主要参照BEST Bacterial Genomic DNAExtraction Kit Ver.2.0(TaKaRa)试剂盒说明书和TaKaRa公司的16s rDNA BacterialIdentification PCR Kit试剂盒说明书进行。将ND9菌株的16SrDNA序列在NCBI网站中进行BLAST序列比对，选出与该序列相关性较高的红球菌属15个菌株的16sDNA用于系统发育学分析。采用Clustal W软件进行多序列比对分析，用Mega 4.0程序构建系统发育进化树。结果显示，ND9菌株属于假单胞菌属，与恶臭假单胞菌(Accession Number AB180734)序列100％相似，如图1所示。结合该菌的形态特征和生理生化性状，最终将ND9菌株命名为恶臭假单胞菌ND9。这与前人的研究结果相一致，降解烟碱的微生物多数属于假单胞菌属。
所述的恶臭假单胞菌菌株的应用，用于降解烟碱。
实例：烟碱降解测定
将30μL ND9菌株细胞悬浮液(OD600为0.25‐0.40)接种到3mL基础培养基中培养。定时取样，测定菌体生长量和烟碱的降解，每实验重复3次。
培养温度：烟碱浓度为1.0g/L，温度分别为20，25，28，30和37℃，pH7.0、150rpm培养。
培养基初始pH：初始pH分别为5，7，9和10，烟碱浓度为1.0g/L，28℃、150rpm下培养。
烟碱起始浓度：烟碱浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/L，于pH7.0、28℃、150rpm下培养。
用OD600值及烟碱浓度(g/L)来比较ND9菌株在不同PH、温度、烟碱浓度等培养条件下降解烟碱的速率。在烟碱浓度1.0g/L、PH 1.0‐10.0不等的条件下，ND9菌株的最适生长环境为28℃、150rpm、PH7.0，如图2所示。图3显示了温度对ND9菌株生长速率及降解烟碱的影响。可看出，在28℃‐32℃，ND9菌株生长良好，当温度为28℃时ND9菌株生长速率最高，超过32℃后生长速率明显下降，40℃、pH 7.0、150rpm时除外。当烟碱浓度超过3.0g/L时，ND9菌株生长缓慢，烟碱浓度为5.0g/L时几乎停止生长，其中最合适的烟碱浓度为1.0g/L，如图4所示。因此，细胞生长及降解烟碱的最适条件为PH7.0、烟碱浓度1.0g/L、28℃下震荡培养，经48h培养后，1.0g/L烟碱可完全降解。
Claims (4)
1.一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株，保藏号为CGMCC NO.13055。
2.如权利要求1所述的一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、样品采集：土样采自烟田，将采集的土样在室温下自然风干，然后用研钵将风干的土样研碎，备用；9
S2、配制培养基：
富集培养基：13.3g K2HPO4·3H2O，4g KH2PO4，0.2g MgSO4·7H2O，0.5mL微量元素溶液，定容至1L，pH7.0；121℃高压蒸汽灭菌20min后，烟碱用0.22μm滤膜过滤菌后根据需要加入，4℃保存；
分离培养基：富集培养基中添加质量百分比为1.5％琼脂；
筛选培养基：改变分离培养基中烟碱浓度；
LB固体培养基：25gLB肉汤，18g琼脂粉，定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min；
微量元素溶液：0.05g CaCl2·2H2O、0.05g CuCl2·2H2O、0.008g MnSO4·H2O、0.004gFeSO4·7H2O、0.1g ZnSO4和0.1g Na2MoO4·2H2O，用0.1mol/L HCL溶解定容至1L。
S3、降解菌的分离、纯化：将2g烟田土样加入到100mL烟碱含量为0.5g/L的富集培养基的三角瓶中，28℃、150rpm富集培养4天，然后取10mL培养物转接至另一100mL烟碱含量为0.5g/L的富集培养基中培养4天，达到富集的目的，再接入烟碱含量为1.0g/L的筛选培养基，重复3次，通过平板稀释法将培养物涂布于LB固体培养基上，28℃下培养48h，经富集分离，筛选到能够耐受烟碱的细菌，代号为ND9，将分离得到的菌株先接种到烟碱含量为1.0g/L的固体筛选培养基上，后接种到烟碱含量为1.0g/L的液体筛选培养基上进行纯化，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：将纯化好的菌株接种到LB固体培养基上，28℃培养24h，纯化好的菌株进行生理生化测定，革兰氏染色，运动性，氧化酶反应，VP试验，淀粉水解，明胶液化，吲哚，葡萄糖的利用；并以F27(5’‐AGAGTTTGATCATGGCTCAG‐3’)和R1492(5’‐TACGGTTACCTTGTTACGACTT‐3’)为引物，PCR扩增ND9菌株16S rDNA基因，扩增产物进1％琼脂糖凝胶电泳；同时，将ND9菌株的16S rDNA序列在NCBI网站中进行BLAST序列比对，选出与该序列相关性较高的红球菌属15个菌株的16sDNA用于系统发育学分析，采用Clustal W软件进行多序列比对分析，用Mega 4.0程序构建系统发育进化树。
4.如权利要求1所述的一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的应用，其特征在于：用于降解烟碱。
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