CN108929917A - 用于控制拟南芥叶片衰老的引物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于控制拟南芥叶片衰老的引物、试剂盒及其应用，属于植物基因工程技术领域，能够解决在延缓许多作物衰老突变体中，作物农艺性状较差，很难被利用的问题。该技术方案包括根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老。本发明应用小麦TaNACS基因可以控制拟南芥叶片衰老过程，同时该基因的过表达不影响拟南芥其它农艺性状。

Description

用于控制拟南芥叶片衰老的引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种用于控制拟南芥叶片衰老的引物、试剂盒及其应用。

背景技术

衰老是植物发育的最后一个阶段，其不仅受温度、病害、胁迫等外因影响，同时还被基因调控，受体内激素水平的影响。叶片衰老与作物产量及品质息息相关，作物早衰或晚衰不利于完成其正常的生命周期，造成作物减产或者品质降低，严重影响农艺性状。因此，叶片衰老调控因子的发现及其应用是实现作物高产高品质的有效途径之一。

拟南芥作为植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一，对其衰老调控因子的研究有利于推进植物衰老研究的进程，进而将其应用于农业生产耕作，提高农产物产量。然而，现有的许多作物中延缓衰老突变体研究中，多数农艺性状较差，很难被利用。因此，获得特异调控拟南芥叶片衰老但不影响其它农艺性状的基因是解决延缓衰老的关键策略之一。

发明内容

针对现有技术存在的不足之处，本发明提出一种用于控制拟南芥叶片衰老的的引物、试剂盒及其应用，其能够特异调控拟南芥叶片衰老，同时不影响其它农艺性。

为解决所述技术问题，本发明采用的技术方案为：

根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，具体包括：

本发明还提出试剂盒，包含如上述技术方案所述的用于控制拟南芥叶片衰老的引物。

本发明还提出利用上述技术方案所述的引物控制拟南芥叶片衰老的方法，具体的，通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老。

作为优选，所述通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老，具体包括：

将以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到的TaNACS基因产物通过重组连接到过表达载体上，形成TaNACS重组载体；

利用TaNACS重组载体为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物通过gateway方法连接到诱导表达载体中，获得TaNACS诱导表达载体，并将TaNACS诱导表达载体整合到拟南芥基因组，筛选获得阳性转基因材料；

利用TaNACS诱导表达载体为模板，通过LR反应形成35S驱动的TaNACS基因组成型过表达载体，并将其整合到拟南芥基因组，筛选获得组成型过表达材料。

作为优选，所述通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老，还包括以下步骤：

以转基因拟南芥cDNA为模板，以SEQ ID NO.5为上游引物、SEQ ID NO.6为下游引物，通过PCR及1.2％琼脂糖显色技术，对诱导型转基因材料或组成型过表达材料进行表达鉴定。

作为优选，所述以以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到TaNACS基因产物的扩增程序为：

95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，33个循环；72℃10min。

作为优选，所述利用TaNACS重组载体为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ IDNO.4为下游引物进行PCR扩增得到TaNACS诱导表达载体的扩增程序为:

95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于小麦TaNACS基因可以控制拟南芥叶片衰老过程，同时该基因的过表达不影响拟南芥其它农艺性状。

附图说明

图1为本发明实施例2中TaNACS基因在转基因拟南芥中表达鉴定，其中，A为组成型过表达材料的鉴定，B为诱导型过表达材料的鉴定；

图2为本发明实施例3中诱导表达TaNACS基因的拟南芥的表型分析示意图，其中，A为诱导表达材料表型分析，B为喷洒雌二醇后叶绿素含量测定，C为喷洒雌二醇后光合效率测定；

图3为本发明实施例3中过量表达TaNACS基因的拟南芥的表型分析示意图，其中，A为35S驱动的组成型TaNACS过表达材料表型分析，B为组成型过表达材料中叶绿素含量测定，C为组成型过表达材料中光和效率测定。

具体实施方式

下面将对本发明具体实施例中的技术方案进行详细、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明总的技术方案的部分具体实施方式，而非全部的实施方式。基于本发明的总的构思，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都落于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种用于控制拟南芥叶片衰老的引物，包括：

根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，具体包括：

该实施例中，根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，其中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2用于构建TaNACS重组载体；SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4用于获得TaNACS基因诱导表达载体；SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6用于拟南芥中TaNACS基因过表达和诱导表达转基因材料鉴定引物。

本发明实施例还提供了试剂盒，包含如上述实施例所述的用于控制拟南芥叶片衰老的引物。

本发明实施例还提出利用上述实施例所述的引物控制拟南芥叶片衰老的方法，具体的，通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老。

在该实施例中，TaNACS基因是如SEQ ID NO.7所示的一段小麦基因片段。

在一优选实施例中，所述通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老，具体包括：

S1：将以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到的TaNACS基因产物通过重组连接到过表达载体上，形成TaNACS重组载体。

在该步骤中，利用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2对小麦cDNA进行PCR扩增得到TaNACS基因产物，优势在于：该引物中含有可以直接与最终过表达载体pCambia3301重组的接头序列，不需要经过中间载体步骤，直接利用重组酶infusion连接到过表达载体pCAMBIA3301中，高效省时；引物序列中GC含量都小于70％。

S2：利用TaNACS重组载体为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物通过gateway方法连接到诱导表达载体中，获得TaNACS诱导表达载体，并将TaNACS诱导表达载体整合到拟南芥基因组，筛选获得阳性转基因材料。

在该步骤中，利用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4对TaNACS重组载体进行扩增，优势在于其扩增产物可以直接通过gateway重组方法进行连接，得到TaNACS诱导表达载体，在该过程中，成功连接到诱导表达载体中的扩增产物基因片段可以置换大肠杆菌感受态致死基因，因此连接成功的TaNACS诱导表达载体不会对大肠杆菌造成影响，极大提高了阳性效率，同时又使得连接过程方便快捷。

S3：利用TaNACS诱导表达载体为模板，通过LR反应形成35S驱动的TaNACS基因组成型过表达载体，并将其整合到拟南芥基因组，筛选获得组成型过表达材料。

在该步骤中，组成型过量表达能够持续稳定的过量表达TaNACS基因，表型容易观察，但组成型过量表达不容易控制，不具有时间的可控性；因此，我们同时利用了组成型过表达和诱导型过表达策略；诱导型过表达可以人为控制基因表达时间，对表型具有可操控性，两者兼用更能全面反映TaNACS基因控制拟南芥叶片衰老的功能。

在一优选实施例中，所述通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老，还包括以下步骤：

以转基因拟南芥cDNA为模板，以SEQ ID NO.5为上游引物、SEQ ID NO.6为下游引物，通过PCR及1.2％琼脂糖凝胶显色技术，对诱导型转基因材料或组成型过表达材料进行表达鉴定。

在一优选实施例中，所述以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ IDNO.2为下游引物特异扩增得到TaNACS基因产物的扩增程序为：

95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，33个循环；72℃10min。

在一优选实施例中，所述利用TaNACS重组载体为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增得到TaNACS诱导表达载体的扩增程序为:

95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于控制拟南芥叶片衰老的的引物、试剂盒及其应用，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

TaNACS基因克隆及过表达载体构建

以中国春小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物进行PCR扩增，模板浓度为50ng/ml，扩增程序为：

95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，33个循环；72℃10min。

将PCR扩增产物通过infusion重组酶连接到pCambia3301过表达载体(ubi驱动的过量表达)上，最终形成重组载体pCambia3301-TaNACS。

连接方法为：

(1)利用EcoRI和BamHI双酶切pCambia3301载体，片段回收后待用；

(2)建立连接体系：1.5μL酶切后的pCambia3301载体；2.5μL PCR片段；1μLinfusion酶：

(3)建立反应条件：50℃15min，冰上放置5分钟；转化大肠杆菌DH5a；进行阳性鉴定并测序鉴定。

将测序正确的重组载体转入到农杆菌中，为下一步拟南芥转化做准备。

实施例2

1、获得TaNACS基因诱导表达载体

以pCambia3301-TaNACS载体为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增，扩增程序:

95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

将扩增片段按照试剂盒说明纯化回收后，通过BP酶连接到中间载体pDonor207上，测序后，选择阳性克隆提取质粒，命名为TaNACS-in-pDonor207，将该载体与最终载体pER8通过LR酶重组，形成诱导表达载体，命名为TaNACS-pER8；将诱导表达载体转化入大肠杆菌DH5a，进行阳性鉴定并测序；

2、获得35S驱动的TaNACS基因组成型过表达载体

利用上述获得的aNACS-in-pDonor207载体，通过LR反应将TaNACS重组到35S驱动的过量表达载体pEarlyGate101上，形成可在双子叶植物拟南芥中过量表达的TaNACS-pEarlyGate101载体。

3、获得转基因拟南芥

诱导表达载体创制：将获得的TaNACS-pER8诱导表达载体转化进入农杆菌GV3101中，通过阳性鉴定，获得阳性农杆菌，利用农杆菌侵染花的方法，将含有TaNACS-pER8诱导表达载体的T-DNA整合进入拟南芥基因组，通过basta抗性筛选获得阳性转基因材料。

组成型过表达材料获得：方法与诱导表达载体创制一致

4、转基因拟南芥鉴定

以转基因拟南芥cDNA为模板，以SEQ ID NO.5为上游引物、SEQ ID NO.6为下游引物，通过PCR及1.2％琼脂糖凝胶显色技术，对转基因拟南芥进行表达鉴定；其中组成型过量表达材料选取的是生长2周的转基因材料第5片莲座叶；而诱导型材料选取中，首先对生长2周的诱导过表达及对照材料进行5μM雌二醇(EST)喷洒处理；6小时后，选取第5片莲座叶进行鉴定，鉴定结果见图1，在35S启动子驱动的组成型TaNACS基因过表达材料中能够检测到较高水平的TaNACS基因在诱导表达材料中，喷洒雌二醇后，TaNACS基因能够在转基因拟南芥中检测到，说明我们在拟南芥中的过表达体系是工作的。

性能测试

诱导过表达表型分析：

生长2周的拟南芥5μM的雌二醇喷洒整株；植株继续生长并观察表型；结果表明，对转基因材料和对照分别喷洒雌二醇后3天后，转基因材料明显有衰老表型，表明TaNACS基因在拟南芥中也可以促进叶片衰老进程；同样的，选取转基因及对照的第6片莲座叶进行叶绿素和光和效率测定，结果见图2。

结果表明，诱导表达材料在进行雌二醇诱导后，叶绿素含量明显降低，同时光和效率也降低，这些结果都表明了TaNACS基因在双子叶植物中同样具有促进衰老的作用。

组成型过表达表型分析：

对生长4周的TaNACS-pEarlyGate101转基因材料进行表型分析，结果表明，与对照相比，TaNACS基因过表达明显可以促进叶片衰老；选取第6片莲座叶进行叶绿素和光合效率测定，结果见图3。

结果表明，过量表达TaNACS基因过表达后，转基因材料与对照相比，叶绿素含量明显降低，光校效率也降低；这些结构同样表明TaNACS基因在双子叶植物拟南芥中能够促进叶片衰老。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 用于控制拟南芥叶片衰老的引物、试剂盒及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcagcccgg ggatccatga tcatgtccga cccgg 35

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctttgtag tcgttaacga aacggagcaa cgtcccct 38

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacaaaaaag caggcttcat gatcatgtcc gacccgg 37

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtacaagaaa gctgggtcga aacggagcaa cgtcccct 38

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtggggacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttc 33

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtggggacca ctttgtacaa gaaagctggg tc 32

<210> 7

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgatcatgt ccgacccggc catgctgccg ccgggcttcc ggttccaccc gacggacgag 60

gagctcatcc tacactacct ccgcaaccgc gccgccgaat cgccctgccc cgtctccatc 120

atcgccgacg tagatatcta caagttcgac ccatgggccc tgccatccaa ggctagctac 180

ggggacaggg agtggtactt cttcacgccg agggaccgta agtaccccaa cggtgtccgg 240

ccgaaccgcg ccgcgggttc cggctactgg aaggccaccg gcaccgacaa gcccatccgc 300

tgcagcgcca ccggcgagag cgtcggcgtc aagaaggccc tcgtcttcta caagggccgc 360

ccgcccaagg gcatcaaaac caactggatc atgcacgagt accgcctcgc tgccgccgac 420

gcacacgccg ccaacaccta ccgccccatg aagttccgca acgcctccat gaggctggat 480

gactgggtgc tgtgccggat ctacaagaag accagccaag tgtcgccgat ggcggtgccg 540

ccgctgtccg accacgagct tgacgagcct tctggcgctg acgcctaccc cgtgtcgagc 600

gccggcatga tcatgcaagg cggcgccagc ggctacccgc tgcaggccgc ggccgtcggc 660

acacagagga tgcccaagat cccgtccata tcagagttgc tcaacgagta ctcgctggcg 720

cagctcttcg aggacagcgg acacgcgctg atggcgcggc acgatcagca cgccgccctc 780

ctcggtcacc ccatcatgag ccaattccat gtgaacagca tgccgcagct tgggcagatg 840

gattcgtcag cctcaacgtc ggtggcaggc gagggtgccg ccgggaagcg caagaggccg 900

tcggaggacg gtgaccgtaa cgggtcgacg agccagccag cggcggcggt gacgggcaag 960

aagcccaaca gttcttgctt gggtgcaaca acgttccaaa caggcaacaa caccttgcag 1020

gggacgttgc tccgtttcta a 1041

Claims (7)

1.用于控制拟南芥叶片衰老的引物，其特征在于，根据小麦基因TaNACS设计特异性上下游引物，具体包括：

2.试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的用于控制拟南芥叶片衰老的引物。

3.利用权利要求1所述的引物控制拟南芥叶片衰老的方法，其特征在于，通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老，具体包括：

将以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到的TaNACS基因产物通过重组连接到过表达载体上，形成TaNACS重组载体；

利用TaNACS重组载体为模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物通过gateway方法连接到诱导表达载体中，获得TaNACS诱导表达载体，并将TaNACS诱导表达载体整合到拟南芥基因组，筛选获得阳性转基因材料；

利用TaNACS诱导表达载体为模板，通过LR反应形成35S驱动的TaNACS基因组成型过表达载体，并将其整合到拟南芥基因组，筛选获得组成型过表达材料。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通过转基因技术将TaNACS基因整合到拟南芥基因组中，利用过量表达TaNACS基因促进拟南芥叶片的衰老，还包括以下步骤：

以转基因拟南芥cDNA为模板，以SEQ ID NO.5为上游引物、SEQ ID NO.6为下游引物，通过PCR及1.2％的琼脂糖凝胶显色技术，对诱导型转基因材料或组成型过表达材料进行表达鉴定。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述以小麦cDNA为模板，以SEQ ID NO.1为上游引物、SEQ ID NO.2为下游引物特异扩增得到TaNACS基因产物的扩增程序为：

95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，33个循环；72℃10min。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述利用TaNACS重组载体为模板，以SEQID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物进行PCR扩增得到TaNACS诱导表达载体的扩增程序为:

95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。