CN111206041A

CN111206041A - OsBAK1P基因在控制水稻抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN111206041A
Application number: CN202010239802.3A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 叶莹
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-10-24
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2020-05-29
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN111206041B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsBAK1P基因在控制水稻抗旱性中的应用。通过候选基因筛选方法，克隆得到一个控制水稻抗旱性相关的基因OsBAK1P，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ NO：2所示。通过苗期、成株期及孕穗期对转基因水稻材料旱胁迫表型鉴定，结果表明，敲除或突变OsBAK1P基因造成转基因水稻抗旱性增强。本发明证实了OsBAK1P基因的生物学功能及其应用的途径和方法。

Description

OsBAK1P基因在控制水稻抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsBAK1P基因在控制水稻抗旱性中的应用。

背景技术

植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、冷害和高温会导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。水稻已经进化出多种机制在各种环境压力下调节自身生长。许多植物激素在这些机制中起作用，例如，干旱、寒冷、盐度、高温等非生物胁迫下，ABA(abscisic acid,脱落酸)水平会迅速增加诱导植物的保护调节机制(Wang H,Tang J,LiuJ,Hu J,Liu J,Chen Y,Cai Z,Wang X.Abscisic acid signaling inhibitsbrassinosteroid signaling through dampening the dephosphorylation of BIN2 byABI1 and ABI2.Molecular Plant,2018,11,315–325)。ABA是一种重要的倍半萜类植物激素，因能促使叶子脱落而得名，不仅可以促进果实的脱落，也可作为植物生长发育许多过程的通用调节器，能够促进种子休眠，抑制种子萌发和根系生长，促进植物从营养向生殖阶段的转变生长以及叶片衰老，此外还能介导植物对非生物逆境胁迫的生理反应，例如气孔关闭等(Cutler SR,Rodriguez PL,Finkelstein RR,Abrams SR.Abscisic acid:emergenceof a core signaling network.Annual Review of Plant Biology,2010,61(1):651-679；Shu K,Liu XD,Xie Q,He ZH.Two faces of one seed:hormonal regulation ofdormancy and germination.Molecular Plant,2016,9(1):34-45)。研究表明干旱可诱导ABA水平上调高达40倍，从而触发气孔关闭，并调控一系列ABA依赖的干旱应答基因(Verslues PE,Agarwal M,Katiyar-Agarwal S,Zhu J,Zhu JK.Methods and concepts inquantifying resistance to drought,salt and freezing,abiotic stresses thataffect plant water status.Plant Journal,2006,45(4):523-539)。依赖于ABA的信号转导途径已经被研究得较为透彻，主要是水稻通过感知环境或生长信号诱导ABA的合成，ABA受体识别ABA信号继而通过释放SnRKs蛋白激酶将信号传递到转录因子上，进而调控下游基因的表达。通过基因工程的手段改变ABA信号途径相关基因的表达来调节ABA的水平，可以有效提高水稻的抗旱性，具有广阔的应用前景。

为了抵抗或适应这些不利的因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白和渗透调节物质以适应不利的生长环境(Xiong等，Cell signalingduring cold,drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl),S165–S183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到了调控因子的精细调节。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强植物体对逆境的耐受能力，达到抵抗不良环境条件胁迫的效果。大多数类型的转录因子都参与了植物的非生物逆境应答反应，包括AP2/EREBP、bZip、HD-ZIP、MYB、MYC、NAC和Zincfinger类转录因子(Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K.Transcriptional regulatorynetworks in cellular responses and tolerance to dehydration and coldstresses.Annu Rev Plant Biol,2006,57:781-803)。

除此以外一些功能蛋白类例如磷酸酶、受体激酶等等也会在水稻干旱响应中起到重要作用，本基因编码蛋白被预测为BAK1(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-associatedreceptor kinase 1)前体蛋白，近年来相继发现BAK1参与多个信号转导途径，它是BRI1的共受体，被磷酸化激活激酶活性后启动信号向下游传递，它也能与FLS2形成复合物参与调控植物的先天免疫反应等，本发明基因被预测为该基因的前体。该发明在抗旱方面是否具有功能尚无报道，因此对该基因进行编辑并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的涉及一个预测为SERKs家族基因BAK1前体OsBAK1P基因在控制水稻抗旱性改良中的应用。在综合RNA-Seq、芯片数据、候选基因关联分析等条件后申请人挑选了一个注释为BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-associated receptor kinase1precursors的基因，并且该基因附近存在另外三个相同注释的基因，推测为同一基因的多个拷贝，因为其属于BAK1前体，申请人将该基因命名为OsBAK1P。本发明敲除OsBAK1P基因的部分DNA片段，转化得到的转基因水稻植株在干旱恢复后呈现恢复快的表型，因此可以认为该基因负调控干旱。其中，OsBAK1P基因编码区的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列长度为753bp；共编码250个蛋白质序列(见SEQ ID NO:2所示)。

本发明包括目的片段的分离、克隆和转化，以及通过农杆菌侵染的方式对水稻基因组进行编辑，再将转化得到的植株材料进行表型鉴定，最后发现一个突变后能够增加干旱耐受能力的水稻OsBAK1P基因，并期望它在水稻抗旱性遗传改良中的取得良好应用。本发明采用候选基因筛选(包括RNA-Seq、芯片数据、候选基因关联分析等)的方法，克隆到控制水稻抗旱基因OsBAK1P，并通过CRISPR敲除技术对该基因进行突变后发现OsBAK1P突变体呈现抗干旱表型，通过苗期、成熟期的盆栽及大田干旱实验证实了该基因的旱相关功能及应用途径。

携带有本发明OsBAK1P基因靶点的CRISPR以及超表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。可使用包括本发明OsSEC3A1基因的表达载体转化宿主(包括水稻在内的多种植物)，培育抗旱植物品种。下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1：OsBAK1P基因在水稻以及拟南芥中部分同源基因的蛋白序列比对结果。附图标记说明：在图1中有6个与本发明同源的水稻基因，它们与本基因注释(BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE 1-associated receptor kinase 1)相同；4个拟南芥中的同源基因(AtSERKs)均被克隆。图最下方的标注的31540基因为本发明克隆的基因。

图2：OsBAK1P超表达转化T0代材料(6E)中的OsBAK1P基因转录水平的检测。附图标记说明：实时定量PCR(Real-time PCR)检测10个独立的T0代超表达植株，水稻actin1基因(LOC_Os03g61970)作为内参基因，纵坐标数值表示6E中OsBAK1P的表达量相对于野生型对照(zh2：中花11，即ZH11)中OsBAK1P的表达量的倍数。测试结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。

图3：水稻OsBAK1P突变体苗期干旱胁迫表型。附图标记说明：图3中的A图的左图为胁迫前及复水后OsBAK1P的CRISPR材料6C-8家系与其背景对照ZH11，左右各种9株，左为对照，右为突变体，存活率(存活株数与总株数之比)为22％：44％；图3中的B图为胁迫前及胁迫过程中OsBAK1P的T-DNA插入突变体BA31-H家系与其分离出来的野生型对照BA31-W，左右各种12株，胁迫前对照在左，胁迫过程中对照在右(为了使差异体现更明显)。图3中的C图为7C-13为其同源基因LOC_Os11g31550的CRISPR突变体家系，左右各种9株，存活率之比为11％：44％；图3中的D图为8C-30为另一同源基因LOC_Os11g31560的CRISPR家系，左右各种12株，存活率之比为16.7％：75％。

图4：水稻OsBAK1P突变体孕穗期盆栽干旱胁迫表型。附图标记说明：图4中的A图为断水胁迫五天后，突变体呈现比对照先卷叶的表型(BA31W-1/2/5为T-DNA插入突变体分离出来的阴性对照的三个重复，BA31H-1/4/5为T-DNA纯合插入突变体的三个重复)。图4中的B图为复水20天后，突变体恢复比对照更快。

图5：孕穗期盆栽干旱胁迫各时期绿叶面积比。附图标记说明：根据表型平台所拍摄胁迫各时期照片绿叶面积比(每棵植株绿叶面积与整棵植株的投影面积之比，反应了水稻植株的生长状态)，进行分析。由图5曲线从上至下，最上面的一条曲线线条代表纯合突变体，最下面的一条曲线代表分离的对照，横坐标为胁迫及复水各时期(BS：胁迫前，MD：中度胁迫(土壤水分含量15％以下维持5天)，SD：重度胁迫，Recovery1：恢复1期(复水7天后)，Recovery2：恢复2期(复水20天后))，测试结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。

图6：水稻OsBAK1P突变体成株期大田干旱胁迫表型(部分)。附图标记说明：对照和突变体种在相邻的两个小区(小区为4株*5株种植)。图6中的A图为胁迫过程中照片，左边BA31-2W为对照，右边BA31-2H为突变体，突变体相较对照先发生卷叶。图6中的B图为复水后，对照呈现大片发白，而突变体持绿面积更多(右)。BA31-2W为T-DNA插入突变体分离出来的阴性对照，BA31-2H为T-DNA纯合插入突变体。

图7：本发明分离克隆的OsBAK1P基因的核苷酸直观序列(即编码区CDS)。

具体实施方式

对序列表的说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的OsBAK1P基因的核苷酸序列(也是编码区序列，即CDS)。

序列表SEQ ID NO:2是OsBAK1P基因编码的蛋白质序列。

实施例1：OsBAK1P T-DNA突变体的分离

从水稻突变体库Rice T-DNA Insertion Seqence Database(RISD)(本发明的起始材料即突变体RMD_05Z11BA31，检索地址：http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE，由韩国植物功能基因组实验室(Plant Functional Genomics Laboratory)管理)中挑取OsBAK1P基因位点相应的T-DNA插入突变体RMD_05Z11BA31。产生这个突变体株系的载体的构建和遗传转化方法可参照相关文献(Jeong等.Generation of a flanking sequence-tag database for activation-tagging lines in japonica rice.Plant J.2006,45:123-32.)，限于篇幅本说明书不再展开描述。用上述网站突变体库中所登录的OsBAK1P T-DNA突变体提供的检测引物(BA31-F：5’-TCCTTTCATGCAGAACATGC-3’和BA31-R：5’-ATCAAAACATGGGGGAAATG-3’)对该突变体进行PCR扩增步骤①，同时将BA31-R与载体引物NTLB5(公用引物)对该突变体进行PCR扩增②。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸5min。若步骤①能扩增出条带，步骤②不能，则表明该突变体为阴性；反之则为纯合突变体；若步骤①②均能扩出则说明为杂合突变体。

实施例2：OsBAK1P的CRISPR载体的构建及其遗传转化

为了分析OsBAK1P基因的功能，申请人将其用CRISPR法敲除。从转基因植株的表型研究该基因的功能。

CRISPR载体构建方法来源于文章Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editingcapability with the endogenous tRNA processing system，具体步骤如下：

(1)引物设计：首先在水稻基因数据库网站(http://www.ricedata.cn/gene/)输入OsBAK1P基因LOC号：LOC_Os11g31540，下载该基因氨基酸序列；在NCBI的保守结构域的预测网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)输入氨基酸序列，预测含有PLN00113超家族结构域，结构域的位置为16-234位氨基酸，以此为参考设计引物；在CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)选择物种Oryza sativa输入LOC号，寻找合适的靶点：位于基因起始密码子ATG附近或位于结构域部位，脱靶率低；在靶点后接上gRNA scaffold序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC),在RNAfold Web Server网站(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)输入此序列进行结构预测，期望得到合适的茎环结构，使得载体发挥功能时能够更好地与靶点互补配对并有合适的空间结构进行切割；以靶点为参考设计引物：靶点1引物PS1-F(5’-TAGGTCTCCCTGCAACACTGAgttttagagctagaa-3’)和PS1-R(5’-CGGGTCTCAGCAGCTCACAAGtgcaccagccggg-3’)靶点2引物PS2-F(5’-TAGGTCTCCGTGGCATACACGgttttagagctagaa-3’)和PS2-R(5’-CGGGTCTCACCAATTTGCTCTtgcaccagccggg-3’)。

(2)一轮PCR:引物配对方式为：L5AD5-F～PS1-R,PS1-F～PS2-R，PS2-F～L3AD3-R,,以gRNA为模板进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸5min。

(3)GG反应：将扩增获得的PCR产物纯化后进行GG反应(产物共7ul(25-50ng)；2*T7连接酶Buffer(NEB)10ul；BSA2ul；BsaI(10U/ul,NEB)0.5ul；T7 DNA连接酶0.5ul)，反应条件为：37℃5min，20℃10min，40个循环；20℃1h。

(4)GG PCR:反应产物加入180ul双蒸水稀释后进行利用S5AD5-F和S3AD3-R对目的片段进行扩增，纯化PCR产物。

(5)酶切酶连：将片段和pRGEB32载体分别用FOKI和BSAI进行酶切，37℃反应1.5h。酶切完毕，用氯仿：异戊醇(24:1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsBAK1P基因的酶切片段和酶切的pRGEB32载体做连接反应，其后转化大肠杆菌Trans5α(该大肠杆菌DH10β菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为OsBAK1P-pRGEB32。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述CRISPR载体OsBAK1P-pRGEB32转入到水稻品种“中花11”(或称ZH11，来自中国农业科学院作物科学研究所，为常用实验材料)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、检测，移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativaL.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA，Plant J，6:271-282，1994)基础上改良进行。

本实施例的具体遗传转化步骤如下：

(1)电转化：将最终的CRISPR目标载体OsBAK1P-pRGEB32，用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。

(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒10分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的CRISPR载体OsBAK1P-pRGEB32)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28℃摇床上培养2-3小时。

(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20℃。

(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。

(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，日光灯光照下培养，温度26℃。

(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(10)练苗移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

培养基组分及其配方：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方：

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml。

8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。

9)AS贮存液的配制：秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)愈伤组织诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

实施例3：OsBAK1P基因超量表达载体的构建与材料检测

为了能更好的分析OsBAK1P基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。

超量表达载体构建具体步骤如下：首先在水稻基因数据库网站(http://www.ricedata.cn/gene/)输入OsBAK1P基因LOC号：LOC_Os11g31540，下载该基因序列,以此为参考设计引物。以水稻品种ZH11的叶片反转录得到的cDNA为模板，用引物11g31540OE-F(5’-TACGAACGATAGCCGGTACCATGGGGGCTCATTCTTCAGC-3’，序列特异引物外加载体部分序列引物)和11g31540OE-R(5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCTCAGCCTGAGGTCTTCAGAT-3’，序列特异引物外加载体部分序列引物)，扩增出包含OsBAK1P基因完整编码区的cDNA片段，扩增产物就是本发明SEQ ID NO：所示的序列(1-753bp)。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃70sec，32个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物和用KpnI和BamHI酶切携带ubiquitin启动子的遗传转化载体pU1301(pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体)进行回收纯化：用氯仿：异戊醇(体积比24:1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsBAK1P基因回收片段和酶切的pU1301载体做一步法连接反应，其后转化大肠杆菌DH10β(该大肠杆菌DH10β菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为OsBAK1P-pU1301(载体上的OsBAK1P基因序列就是图6所示的核苷酸序列，序列长度为753bp)。

检测方法如下：对通过与实例2描述相同的遗传转化后得到的T0代材料进行检测。将本发明编码区序列输入网址：http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi，选择检测表达量检测引物：6EqF(5’-TTGTCCTTGTCGGCAACTTG-3’)和6EqR(5’-ACCCAGTTGATCCGACAGTG-3’)，通过TRIZOL和氯仿对RNA进行萃取后用异丙醇沉淀，通过反转录试剂盒对其进行反转录，然后用实时定量PCR(Real-time PCR)检测T0代超表达植株的OsBAK1P表达量，水稻actin1基因(LOC_Os03g61970)作为内参基因，检测结果如图2所示，由此可以看出在苗期叶片中该基因基本不表达，超表达过后可以提高千倍左右。

实施例4：OsBAK1P突变体苗期干旱胁迫表型的鉴定

将已鉴定好基因型的OsBAK1P的T-DNA纯合突变体、分离出来的阴性对照以及CRISPR突变体和野生型(简称WT：中花11)按照常规方法皿上发芽后种植到小蓝桶中。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长至4叶期的植株进行6-10天断水干旱胁迫(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5-7天，拍照并调查植株的存活率。与对照相比，不管是T-DNA插入还是CRISPR突变体均呈现突变体干旱耐受表型(图3中的A图和图3中的B图)。另外，与本基因同源的另两个基因(LOC_Os11g31550和LOC_Os11g31550，对应突变体编号为7C-13和8C-30)也被鉴定为突变体干旱耐受表型(图3中的C图和图3中的D图)。

实例5：OsBAK1P突变体孕穗期盆栽干旱胁迫表型的鉴定

为了鉴定突变体孕穗期的表型，将T-DNA插入突变体及其对照材料播种后种植于大蓝桶中。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设6次重复。选取较为一致的突变体对照各三桶做干旱胁迫实验。干旱胁迫是对健康生长的孕穗期期植株进行断水7-10天轻度胁迫(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)，再进行3天重度胁迫(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)后复水生长，在过程中对观察到的表型进行拍照以及表型平台检测。结果显示与对照相比，突变体植株在干旱胁迫过程中显示卷叶较对照快的表型(图4A)，而在恢复几天后呈现出比对照恢复好的表型(图4B)。对表型平台得到的叶片绿叶面积比(GPAR：每棵植株绿叶面积与整棵植株的投影面积之比，反应了水稻植株的生长状态)数据进行分析，如图5所示，在胁迫过程中突变体相对对照来说绿叶面积下降得更快，但在恢复1期(复水7天)以及恢复2期(复水20天)后相较对照绿叶面积比更大且差异明显，整体水平(Re_BS2)呈现抗旱性更强的表型。

实施例6：OsBAK1P突变体成株期大田干旱胁迫表型的鉴定

为了鉴定突变体成株期的表型，将T-DNA插入突变体及其对照种植于上面有可移动遮雨棚的沙土田中，南方水稻土与粗沙按体积比为1:2混合而成，每个家系种植4行*5株/行，试验设3次生物学重复做严重干旱胁迫实验。严重干旱胁迫是对健康生长的成株期植株进行断水15-20天(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)，再恢复灌水生长。在胁迫过程中，突变体相较于对照先发生卷叶。复水后，对照材料叶片呈现大片发白，而突变体叶片持绿面积更多。因此与对照相比，突变体呈现复水后抗旱表型(图6)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> OsBAK1P基因在控制水稻抗旱性中的应用

<141> 2018-10-23

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(753)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(753)

<400> 1

atg ggg gct cat tct tca gca gca gca gca gct ctg ttc act ggc ttt 48

Met Gly Ala His Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Leu Phe Thr Gly Phe

1 5 10 15

ctt gcc ttg gct aca ctt gtg agc tgc aac act gaa ggt gac att ctg 96

Leu Ala Leu Ala Thr Leu Val Ser Cys Asn Thr Glu Gly Asp Ile Leu

20 25 30

tac gcg caa agg ctg gca tgg aag gac ccc ttc aat gtg ctg cag agt 144

Tyr Ala Gln Arg Leu Ala Trp Lys Asp Pro Phe Asn Val Leu Gln Ser

35 40 45

tgg gat cca acc ctt gta aat ccc tgc acc tgg ttc cat gtc acc tgc 192

Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys

50 55 60

aac aat aac aac tcc gtc gtc cgc gtg gat ttg ggg tta gca ggt cta 240

Asn Asn Asn Asn Ser Val Val Arg Val Asp Leu Gly Leu Ala Gly Leu

65 70 75 80

tca ggt cct ctg att cca cag ctg gga gga ctg agt tac ctt cag tac 288

Ser Gly Pro Leu Ile Pro Gln Leu Gly Gly Leu Ser Tyr Leu Gln Tyr

85 90 95

ctt gaa ctg tat ggg aat gag ctg aat gga tca ata cca gca gca ctg 336

Leu Glu Leu Tyr Gly Asn Glu Leu Asn Gly Ser Ile Pro Ala Ala Leu

100 105 110

ggc aac ctg agc agt ctt gtc agc ctt gat ctc cag ggc aac ctg ctc 384

Gly Asn Leu Ser Ser Leu Val Ser Leu Asp Leu Gln Gly Asn Leu Leu

115 120 125

act ggc gcg ata ccg gat tcg cta ggc gcc att agc acc ctg cga aat 432

Thr Gly Ala Ile Pro Asp Ser Leu Gly Ala Ile Ser Thr Leu Arg Asn

130 135 140

ctg agg ttg tat ggg aac aac ctg act ggc acc ata cca caa tct ttg 480

Leu Arg Leu Tyr Gly Asn Asn Leu Thr Gly Thr Ile Pro Gln Ser Leu

145 150 155 160

ggc agc ctg acg agc ctt gtc aaa ttg gag ctt cag aag aat tca ttg 528

Gly Ser Leu Thr Ser Leu Val Lys Leu Glu Leu Gln Lys Asn Ser Leu

165 170 175

agt ggc acc atc cct gct tct ctc ggc aac atc aag aca ttg gag ttg 576

Ser Gly Thr Ile Pro Ala Ser Leu Gly Asn Ile Lys Thr Leu Glu Leu

180 185 190

ttg cga ctg aac aaa aat tca ctt acc ggc aca gtg cca atg gaa gtc 624

Leu Arg Leu Asn Lys Asn Ser Leu Thr Gly Thr Val Pro Met Glu Val

195 200 205

ctc tcc ctt gtc ctt gtc ggc aac ttg act gag cta aat gtt gct gga 672

Leu Ser Leu Val Leu Val Gly Asn Leu Thr Glu Leu Asn Val Ala Gly

210 215 220

aac aat ttg gac ggc act gtc gga tca act ggg tgg aga gtg act acc 720

Asn Asn Leu Asp Gly Thr Val Gly Ser Thr Gly Trp Arg Val Thr Thr

225 230 235 240

atc att cag gac aat ctg aag acc tca ggc tga 753

Ile Ile Gln Asp Asn Leu Lys Thr Ser Gly

245 250

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Gly Ala His Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Leu Phe Thr Gly Phe

1 5 10 15

Leu Ala Leu Ala Thr Leu Val Ser Cys Asn Thr Glu Gly Asp Ile Leu

20 25 30

Tyr Ala Gln Arg Leu Ala Trp Lys Asp Pro Phe Asn Val Leu Gln Ser

35 40 45

Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys

50 55 60

Asn Asn Asn Asn Ser Val Val Arg Val Asp Leu Gly Leu Ala Gly Leu

65 70 75 80

Ser Gly Pro Leu Ile Pro Gln Leu Gly Gly Leu Ser Tyr Leu Gln Tyr

85 90 95

Leu Glu Leu Tyr Gly Asn Glu Leu Asn Gly Ser Ile Pro Ala Ala Leu

100 105 110

Gly Asn Leu Ser Ser Leu Val Ser Leu Asp Leu Gln Gly Asn Leu Leu

115 120 125

Thr Gly Ala Ile Pro Asp Ser Leu Gly Ala Ile Ser Thr Leu Arg Asn

130 135 140

Leu Arg Leu Tyr Gly Asn Asn Leu Thr Gly Thr Ile Pro Gln Ser Leu

145 150 155 160

Gly Ser Leu Thr Ser Leu Val Lys Leu Glu Leu Gln Lys Asn Ser Leu

165 170 175

Ser Gly Thr Ile Pro Ala Ser Leu Gly Asn Ile Lys Thr Leu Glu Leu

180 185 190

Leu Arg Leu Asn Lys Asn Ser Leu Thr Gly Thr Val Pro Met Glu Val

195 200 205

Leu Ser Leu Val Leu Val Gly Asn Leu Thr Glu Leu Asn Val Ala Gly

210 215 220

Asn Asn Leu Asp Gly Thr Val Gly Ser Thr Gly Trp Arg Val Thr Thr

225 230 235 240

Ile Ile Gln Asp Asn Leu Lys Thr Ser Gly

245 250

Claims

1.一种分离的OsBAK1P基因在增强水稻抗旱中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ NO：1所示。

2.一种分离的OsBAK1P基因在增强水稻抗旱中的应用，其特征在于，该基因编码的蛋白质序列如SEQ NO：2所示。