CN114381467B - OsCRKS2基因在控制水稻抗旱性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsCRKS2基因在控制水稻抗旱性中的应用。本发明通过分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高水稻对干旱耐受能力的OsCRKS2基因。所述OsCRKS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID:2所示。本发明克隆到控制水稻干旱应答基因OsCRKS2，并对候选基因进行CRISPR突变体表型鉴定，通过苗期及成株期干旱胁迫表型鉴定表明，缺失该基因片段时，水稻耐干旱胁迫能力降低，证实了该基因的功能及应用途径。

Description

OsCRKS2基因在控制水稻抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsCRKS2基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的基因的CDS序列为SEQ ID NO.1所示。

背景技术

植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、冷害和高温会导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应这些不利的因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白和渗透调节物质以适应不利的生长环境(Xiong等，Cell signaling during cold,drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl),S165–S183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到了调控因子的精细调节。

蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的蛋白质可逆磷酸化是信号转导过程中发生的重要事件之一。在磷酸化作用中，蛋白激酶在底物上加上一个磷酸基团；而蛋白激酶酶通过去除底物的磷酸基团行使相反的功能。在一个酶上添加或去除一个磷酸基团一般会导致酶的激活或失活，正是通过这样的方式，蛋白激酶和蛋白磷酸酶在酶的活性调控中发挥着重要的作用，进而调控着酶参与的生物学过程。类受体蛋白激酶(RLKs)定位于细胞质膜上，是一种含有氨基末端胞外结构域和羧基末端胞内激酶结构域的跨膜蛋白，通过其胞外结构域结合信号分子，激活胞内激酶结构域，从而完成信号的转导。植物RLKs与动物Pelle蛋白激酶家族同源，正如动物细胞具有受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶一样，植物RLKs也可分为受体蛋白激酶和非受体蛋白激酶，共同命名为“RLKs家族”。其中，RLKs代表具有细胞外结构域的类受体蛋白激酶，而RLCKs只含有细胞质激酶结构域，不具有胞外结构域。已被证实为细胞受体的RLKs被认为是受体激酶(RKs)。不同的RLKs能够通过其胞外结构域识别并接受不同的配体，所以胞外域的氨基酸序列差异较大，如富含亮氨酸重复序列(LRR)、含有功能未知结构域26(DUF26)、富含脯氨酸序列(Proline-rich)等，根据这一特征，可将RLKs分为不同的亚类。其中，富含半胱氨酸类受体激酶(CRKs)的胞外结构域含有一个或多个DUF26，由于DUF26内含有富含半胱氨酸的重复序列，所以CRKs属于富含半胱氨酸的类受体激酶。

拟南芥含有46个CRKs，目前，关于拟南芥CRKs的研究多集中于生长发育和植物免疫领域。已有研究表明，拟南芥crk突变体普遍存在异常的生长发育表型，包括生长缺陷，早期衰老，花期提前，发芽延迟，子叶细胞密度降低以及根长变长。拟南芥crk2突变体与野生型相比植株矮小，出现明显的生长缺陷；在长日照条件下(16h光照/8h黑暗)，34个crk突变体(crk2，crk3，crk4，crk5，crk28，crk29，crk40等)出现早期衰老的表型，4个crk突变体(crk7，crk16，crk19，crk38)花期提前；通过观察其胚乳破裂情况，发现32个crk突变体(crk2，crk11，crk21，crk25，crk28，crk41，crk45等)出现发芽延迟的现象；11个crk突变体(crk3，crk13，crk25，crk40等)的子叶细胞密度降低；此外，crk28，crk29和crk42突变体还存在根长变长的表型。除了参与植物生长发育调控，拟南芥CRKs也与植物抗病性相关。例如，拟南芥CRK4，CRK5，CRK6，CRK13，CRK20，CRK2，CRK45和CRK36能够参与丁香假单胞杆菌DC3000的免疫；拟南芥CRK36也能够与BIK1互作，调控气孔免疫；拟南芥CRK28能够结合FLS2/BAK1复合体并增强植物免疫应答。除拟南芥外，小麦，大麦和水稻中也存在与抗病相关的CRKs。小麦TaCRK1对丝核菌属的病原菌禾谷丝核菌有抵抗作用，大麦HvCRK1参与白粉病的抗性调控，水稻OsCRK10和OsCRK6参与BTH诱导的免疫反应。

本发明涉及的OsCRKS2基因属于水稻CRKs家族，目前尚没有与非生物逆境应答相关的水稻CRKs被报道。

发明内容

本发明的目的涉及一个CRKs家族成员OsCRKS2基因在控制水稻抗旱性改良中的应用。因为其属于CRKs蛋白家族，申请人将该基因命名为OsCRKS2。本发明分离和应用一种包含OsCRKS2基因的DNA片段，该片段功能缺失会导致水稻在干旱条件下抗旱性减弱。其中，所述的含有OsCRKS2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列长度为1977bp,它对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：1中1-1977位碱基所对应，OsCRKS2基因编码的氨基酸序列为658个。OsCRKS2基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的OsCRKS2基因可以通过转基因方法，使OsCRKS2基因在水稻中超表达，以提高水稻对干旱胁迫耐受能力。

携带有本发明OsCRKS2基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射或电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Methodfor Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

本发明OsCRKS2基因的表达载体可以转化的宿主是包括水稻等多种植物宿主，用于培育抗旱植物新品种。

本发明基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达基因，提高植物抗旱性。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明涉及的OsCRKS2基因，属于水稻CRKs家族，目前尚没有与非生物逆境应答相关的水稻CRKs被报道。

2.首次从水稻中分离克隆出OsCRKS2基因，其CDS不同于水稻基因组数据库中预测结果，本发明分离克隆的OsCRKS2基因的CDS具有真实性，能够更正水稻基因组数据库中该基因的相关信息。

附图说明

图1为水稻oscrks2 CRISPR突变体基因编辑情况；

oscrks2-4，oscrks2-14,oscrks2-26为3个oscrks2 CRISPR突变体纯合无Cas9家系。

图2为水稻oscrks2 CRISPR突变体苗期干旱胁迫表型；

oscrks2-4，oscrks2-14,oscrks2-26为3个oscrks2 CRISPR突变体纯合无Cas9家系，中花11(ZH11)作为对照；图2中的A图和图2中的B图为oscrks2-4家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态；图2中的C图和图2中的D图为oscrks2-14家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态；图2中的E图和图2中的F图为oscrks2-26家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态。

图3为水稻oscrks2 CRISPR突变体苗期干旱胁迫存活率统计；

oscrks2-4，oscrks2-14,oscrks2-26为3个oscrks2 CRISPR突变体纯合无Cas9家系，中花11(ZH11)作为对照；图3中的A图为oscrks2-4家系苗期干旱胁迫存活率统计情况；图3中的B图为oscrks2-14家系苗期干旱胁迫存活率统计情况；图3中的C图为oscrks2-26家系苗期干旱胁迫存活率统计情况。

图4为水稻oscrks2 CRISPR突变体成株期干旱胁迫表型；

oscrks2-26为oscrks2 CRISPR突变体纯合无Cas9家系，中花11(ZH11)作为对照。图4中的A图为oscrks2-26家系和对照ZH11在干旱处理前的生长状态；图4中的B图为oscrks2-26家系和对照ZH11在干旱处理下的生长状态。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：

OsCRKS2基因的分离和克隆

设计引物OsCRKS2-FL-F：5’-ATGCAGATGCTGATCGTTTC-3’、OsCRKS2-FL-R：5’-CTACCTTGCCAATGTGATACT-3’。以水稻品种日本晴叶片cDNA作为模板，使用引物OsCRKS2-FL-F和OsCRKS2-FL-R扩增OsCRKS2基因编码的CDS序列，扩增的序列为SEQ ID NO:1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，33个循环；72℃延伸5min。

将扩增获得的PCR产物通过TA克隆的方法连入pGEM-T Easy载体，筛选阳性克隆并测序确认，获得OsCRKS2的CDS序列，序列为SEQ ID NO.1所示，该克隆命名为pGEM OsCRKS2质粒。

实施例2：

OsCRKS2基因超量表达载体的构建

将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsCRKS2质粒用引物OsCRKS2-OE-F：5’-tacgaacgatagccggtacc ATGCAGATGCTGATCGTTTC-3’和OsCRKS2-OE-R：5’-ttgcggactctagaggatcc CTACCTTGCCAATGTGATACT-3’扩增出包含OsCRKS2基因完整编码区段的DNA片段；

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。将获得的PCR产物通过Gibson Assembly的方法连入经限制性内切酶KpnI和BamHI消化的pU1301载体，对载体进行测序确认，最终获得可用于遗传转化的OsCRKS2基因超量表达载体。

实施例3：

构建oscrks2 CRISPR突变体

从水稻基因数据库Rice Data(http://www.ricedata.cn/gene/)中获得OsCRKS2基因的基因序列。根据CRISPR-P v2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)挑取一个靶位点。CRISPR突变体株系的载体构建可参照相关文献(和玉兵等.Programmed self-elimination of the CRISPR/Cas9 construct greatly accelerates the isolation ofedited and transgene-free rice plants.Mol.Plant.2018，05.005.)。

在CRISPR-P v2.0网站中选取的靶位点如下：

靶位点：TCCTAATGCTTCTCCTCTCT。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将构建好的CRISPR载体OsCRKS2-CRISPR转入到水稻品种“中花11”(一个常规水稻品种，来自中国农业科学院水稻科学研究所)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6:271-282，1994)基础上改良进行。

本实施例的具体遗传转化步骤如下：

(1)电转化：将最终CRISPR目标载体OsCRKS2-CRISPR，用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。

(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的CRISPR载体OsCRKS2-CRISPR)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，培养温度19-20℃。

(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250p pm，潮霉素浓度250ppm)。

(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(10)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

根据上述基因编辑靶位点，设计引物，对突变体中OsCRKS2基因的编辑情况进行检测。用引物(OsCRKS2-CR-F：5’-GTCCAAGCTAGAGCCGAAGTCAC-3’和OsCRKS2-CR-R：5’-AGTTCCATTGATGCTGGCCGTGT-3’)。对OsCRKS2基因进行特异的PCR扩增，将扩增出来的PCR产物进行测序，同时检测是否含有Cas9。测序结果显示(图1)，在oscrks2-4 CRISPR纯合无Cas9突变体家系中，OsCRKS2基因内部缺失4个碱基(SEQ ID NO.3所示)，在oscrks2-14CRISPR纯合无Cas9突变体家系中，OsCRKS2基因内部缺失5个碱基(SEQ ID NO.4所示)，在oscrks2-26 CRISPR纯合无Cas9突变体家系中，OsCRKS2基因在靶位点1处插入1个碱基(SEQID NO.5所示)，即三个突变体家系中OsCRKS2基因发生突变。

实施例4：

oscrks2 CRISPR突变体苗期干旱胁迫表型的鉴定

将已鉴定好基因型的纯合突变体(oscrks2)和对照野生型(即，非转基因，下同)水稻品种中花11(ZH11)催芽后直播到小圆桶中，小圆桶一半种植突变体材料，另一半种植对照野生型水稻品种中花11，各12株。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的水稻植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5-7天，拍照并调查植株的存活率。与ZH11对照相比，CRISPR纯合突变体植株表现为干旱敏感表型(图2)。干旱复水后小圆桶中oscrks2突变体和对照ZH11的存活率统计结果表明，oscrks2突变体在干旱复水后，存活率显著低于对照野生型ZH11(图3)。

实施例5：鉴定oscrks2 CRISPR突变体成株期干旱胁迫表型

为了鉴定突变体成株期的表型，将突变体及其对照种植于上面有可移动遮雨棚的沙土大田中，南方水稻土与粗沙按体积比为1:2混合而成，每行10株每家系种植2行，试验设3次生物学重复做严重干旱胁迫实验。干旱胁迫是对健康生长的成株期植株进行断水15-20天(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)，再复水生长。与ZH11对照相比，纯合突变体植株oscrks2-26表现为干旱敏感表型(图4)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> OsCRKS2基因在控制水稻抗旱性中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1977

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcagatgc tgatcgtttc cctcctaatg cttctcctct ctaccccgaa tctgttggta 60

gctaaacagc ttcccttctg cagcaacgcg aacaccatca cacacatgcc agagggcacc 120

tacaagacca acctgctcca gctcgccaaa aacctgatca ccaatgtcaa ccagacgcag 180

ctgcactctg ccaacggcac agccggggcg gccggtcctg acacagtata cggcgccgtg 240

ctctgccggg gggactcctc cgccgagagc tgcgctaccc gcctccagag agtgcttgac 300

acggccagca tcaatggaac tagtggcgat gactctggct actttcagaa ccagaagaat 360

gtcaccttgt acgaccatga tttccaggcc ctgctaagct tctccgacaa ggatttcatc 420

tccagcttca gcaacgcgcc ggagtgcact gtgagcgctt acctgaaccc tccgccggat 480

gctgatcgcg cgcagttcag ccagcttttc tctgagctca tggagaagat cgctgcagcc 540

gtggtgagta gacggccggt caactacttg acgggcaggg ggtggttcga cctcaagagc 600

cagacggtgt atgcgctggc gcagtgcacg gacggcatgc cgccggagaa ttgccggagt 660

tgcctggacg gcatcatcga cgaagggaag aagatggtcg gcggtggcct gacgggtggc 720

gcggtgctcg ggatgcgatg cagcctgtgg taccagacgg atgtcaagtt cttcgccggc 780

gacccagagg tgtcgctgca catgcctaca ccaagcaagt tttggatctg ggttgtaatt 840

ggatcgttct ccctcatggt atctatttca tggttgcttg ttcatatttg gatcaaacga 900

gagagaaaaa gagaacaagc aagatttgaa ctacgattgc tgtcgatggc agtacagaat 960

gtaataaatc tttggaggat tgaagaaggg aactcagggt tttcattgta tgatttctct 1020

cagataaaag aagctacaca aaacttctca agggaaaaca aacttgggca aggtggtttt 1080

ggagctgttt ataagggctt gttgccgggt ggtcttgaag tagcagtcaa aagactttca 1140

gcatgttctg tacaaggttt attggagttc aaaaatgaaa ttcagctgat agcaaagctt 1200

caacacaaaa atcttgtcaa gttactcggc tgttgtattg agggagagca tgaaaagatg 1260

ctcgtctacg aatacttgca aaacagaagc ttggacgtct tcatatttga ctttgtgaaa 1320

ggagcacaat taacctggtc aaagcgtcta cgcataattg atgggatagc tcaagggatt 1380

ctatatcttc acaatcattc acgagtatgt gttgttcata gggatttaaa agcaagcaat 1440

attctcttgg acagtgacat gactccaaaa atttcggatt ttgggatggc cagaatattt 1500

ggttcaaata tgattgaatc aaacaccacc agaatagtag gcacacatgg ttacatatct 1560

cccgaatatg ctttcgatgg ggtttgctcg atcaagtcag acgtcttcag tttcggcgtc 1620

ttggtcttgg aaatcataag tggaaagagg actgctggtt tctatcccta tgatggcaaa 1680

ctttgcaatc tcatttcata cgcttggcaa ctctggagat ctggacaggg gcatgagctg 1740

gtctgttgcc gtataggaaa caaccataaa gtgatacaaa ggtgcattca ggtggcacta 1800

ttatgtgttc aagagagggc agatgatagg ccttctatcg atcaggtggt cacgatgcta 1860

aacagcgagg aaatgacatt gcccaaacca aaccaaccag cttacttcta tgtccgatcc 1920

agtggctcag atgattcatc atgcaataac agtataagta tcacattggc aaggtag 1977

<210> 2

<211> 658

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Met Leu Ile Val Ser Leu Leu Met Leu Leu Leu Ser Thr Pro

1 5 10 15

Asn Leu Leu Val Ala Lys Gln Leu Pro Phe Cys Ser Asn Ala Asn Thr

20 25 30

Ile Thr His Met Pro Glu Gly Thr Tyr Lys Thr Asn Leu Leu Gln Leu

35 40 45

Ala Lys Asn Leu Ile Thr Asn Val Asn Gln Thr Gln Leu His Ser Ala

50 55 60

Asn Gly Thr Ala Gly Ala Ala Gly Pro Asp Thr Val Tyr Gly Ala Val

65 70 75 80

Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Ala Glu Ser Cys Ala Thr Arg Leu Gln

85 90 95

Arg Val Leu Asp Thr Ala Ser Ile Asn Gly Thr Ser Gly Asp Asp Ser

100 105 110

Gly Tyr Phe Gln Asn Gln Lys Asn Val Thr Leu Tyr Asp His Asp Phe

115 120 125

Gln Ala Leu Leu Ser Phe Ser Asp Lys Asp Phe Ile Ser Ser Phe Ser

130 135 140

Asn Ala Pro Glu Cys Thr Val Ser Ala Tyr Leu Asn Pro Pro Pro Asp

145 150 155 160

Ala Asp Arg Ala Gln Phe Ser Gln Leu Phe Ser Glu Leu Met Glu Lys

165 170 175

Ile Ala Ala Ala Val Val Ser Arg Arg Pro Val Asn Tyr Leu Thr Gly

180 185 190

Arg Gly Trp Phe Asp Leu Lys Ser Gln Thr Val Tyr Ala Leu Ala Gln

195 200 205

Cys Thr Asp Gly Met Pro Pro Glu Asn Cys Arg Ser Cys Leu Asp Gly

210 215 220

Ile Ile Asp Glu Gly Lys Lys Met Val Gly Gly Gly Leu Thr Gly Gly

225 230 235 240

Ala Val Leu Gly Met Arg Cys Ser Leu Trp Tyr Gln Thr Asp Val Lys

245 250 255

Phe Phe Ala Gly Asp Pro Glu Val Ser Leu His Met Pro Thr Pro Ser

260 265 270

Lys Phe Trp Ile Trp Val Val Ile Gly Ser Phe Ser Leu Met Val Ser

275 280 285

Ile Ser Trp Leu Leu Val His Ile Trp Ile Lys Arg Glu Arg Lys Arg

290 295 300

Glu Gln Ala Arg Phe Glu Leu Arg Leu Leu Ser Met Ala Val Gln Asn

305 310 315 320

Val Ile Asn Leu Trp Arg Ile Glu Glu Gly Asn Ser Gly Phe Ser Leu

325 330 335

Tyr Asp Phe Ser Gln Ile Lys Glu Ala Thr Gln Asn Phe Ser Arg Glu

340 345 350

Asn Lys Leu Gly Gln Gly Gly Phe Gly Ala Val Tyr Lys Gly Leu Leu

355 360 365

Pro Gly Gly Leu Glu Val Ala Val Lys Arg Leu Ser Ala Cys Ser Val

370 375 380

Gln Gly Leu Leu Glu Phe Lys Asn Glu Ile Gln Leu Ile Ala Lys Leu

385 390 395 400

Gln His Lys Asn Leu Val Lys Leu Leu Gly Cys Cys Ile Glu Gly Glu

405 410 415

His Glu Lys Met Leu Val Tyr Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Ser Leu Asp

420 425 430

Val Phe Ile Phe Asp Phe Val Lys Gly Ala Gln Leu Thr Trp Ser Lys

435 440 445

Arg Leu Arg Ile Ile Asp Gly Ile Ala Gln Gly Ile Leu Tyr Leu His

450 455 460

Asn His Ser Arg Val Cys Val Val His Arg Asp Leu Lys Ala Ser Asn

465 470 475 480

Ile Leu Leu Asp Ser Asp Met Thr Pro Lys Ile Ser Asp Phe Gly Met

485 490 495

Ala Arg Ile Phe Gly Ser Asn Met Ile Glu Ser Asn Thr Thr Arg Ile

500 505 510

Val Gly Thr His Gly Tyr Ile Ser Pro Glu Tyr Ala Phe Asp Gly Val

515 520 525

Cys Ser Ile Lys Ser Asp Val Phe Ser Phe Gly Val Leu Val Leu Glu

530 535 540

Ile Ile Ser Gly Lys Arg Thr Ala Gly Phe Tyr Pro Tyr Asp Gly Lys

545 550 555 560

Leu Cys Asn Leu Ile Ser Tyr Ala Trp Gln Leu Trp Arg Ser Gly Gln

565 570 575

Gly His Glu Leu Val Cys Cys Arg Ile Gly Asn Asn His Lys Val Ile

580 585 590

Gln Arg Cys Ile Gln Val Ala Leu Leu Cys Val Gln Glu Arg Ala Asp

595 600 605

Asp Arg Pro Ser Ile Asp Gln Val Val Thr Met Leu Asn Ser Glu Glu

610 615 620

Met Thr Leu Pro Lys Pro Asn Gln Pro Ala Tyr Phe Tyr Val Arg Ser

625 630 635 640

Ser Gly Ser Asp Asp Ser Ser Cys Asn Asn Ser Ile Ser Ile Thr Leu

645 650 655

Ala Arg

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcagatgc tgatcgtttc cctccgcttc tcctctctac cccgaatctg 50

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcagatgc tgatcgtttc cctcgcttct cctctctacc ccgaatctg 49

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcagatgc tgatcgtttc cctccttaat gcttctcctc tctaccccga atctg 55

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgcagatgc tgatcgtttc 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctaccttgcc aatgtgatac t 21

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tacgaacgat agccggtacc atgcagatgc tgatcgtttc 40

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttgcggactc tagaggatcc ctaccttgcc aatgtgatac t 41

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctaatgct tctcctctct 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtccaagcta gagccgaagt cac 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agttccattg atgctggccg tgt 23

Claims (3)

1. OsCRKS2基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的OsCRKS2基因编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示，其应用过程是以SEQ ID NO.10所示序列为靶点，进行CRISPR/Cas9突变，获得干旱敏感表型水稻。

2. 权利要求1所述的应用中的OsCRKS2基因为SEQ ID NO.1所示。

3. 根据权利要求1所述的应用，所述的干旱敏感表型水稻含有SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5所示的基因序列。