CN117721091A - OsCRK35基因在控制水稻抗旱性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，公开了OsCRK35基因在控制水稻抗旱性中的应用。本发明通过分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高水稻对干旱耐受能力的OsCRK35基因，所述OsCRK35基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示。本发明克隆到控制水稻干旱应答基因OsCRK35，并对候选基因进行CRISPR突变体表型鉴定，通过苗期及成株期干旱胁迫表型鉴定表明，缺失该基因片段时，水稻耐干旱胁迫能力降低，证实了该基因的功能及应用途径。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsCRK35基因在控制水稻抗旱性中的应用。本发明采用候选基因筛选的方法，克隆到控制水稻抗旱基因OsCRK35。运用CRISPR技术构建oscrk35突变体，共分离检测表明oscrk35突变体与干旱敏感表型是紧密关联的，证实了该基因的功能及应用途径。
背景技术
植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、冷害和高温会导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应这些不利的因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白和渗透调节物质以适应不利的生长环境(Xiong等，Cell signaling during cold,drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl),S165–S183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到了调控因子的精细调节。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强植物体对逆境的耐受能力，达到抵抗不良环境条件胁迫的效果。大多数类型的转录因子都参与了植物的非生物逆境应答反应，包括AP2/EREBP，bZip、HD-ZIP、MYB、MYC、NAC和Zinc finger类转录因子(Yamaguch i-Shinozaki K,ShinozakiK.Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance tode hydration and cold stresses.Annu Rev Plant Biol,2006,57:781-803)。通过基因工程，部分逆境应答转录因子已经成功应用于水稻抗逆遗传育种。利用SNAC1培育的转基因水稻植株在大田干旱环境下能提高结实率30％左右，而在正常条件下产量不受影响且没有其他表型变化。转基因植株在营养生长期对干旱和高盐的抗性也显著提高(Hu等.Overexpressing a NAM,ATAF,and CUC(NAC)transcription factor enh ances droughtresistance and salt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103:12987-12992)。这些抗逆转录因子是通过调控大量下游基因的表达来体现其功能。这些下游基因中往往含有参与信号转导和基因表达的调控蛋白，它们又进一步形成次级的调控网络。这些下游基因同样可以用于作物抗逆境的遗传改良。拟南芥中抗高温转录因子DREB2A的下游基因HsfA3同样可以提高转基因超表达植株对高温的抗性(Yoshida等.Functionalanalysis of an Arabidopsis heat-shock transcription factor HsfA3 in the transcriptional cascade downstream of the DREB2A stress-regulatorysystem.Biochem Biophys Res Comm un,2008,368:515-21)。
植物对外界环境做出及时而精确的反应，除了相关转录因子，还有很多其他调控因子参与了逆境信号的感知与传递。蛋白激酶和蛋白磷酸酶介导的蛋白质可逆磷酸化是信号转导过程中发生的重要事件之一。在磷酸化作用中，蛋白激酶在底物上加上一个磷酸基团；而蛋白激酶酶通过去除底物的磷酸基团行使相反的功能。在一个酶上添加或去除一个磷酸基团一般会导致酶的激活或失活，正是通过这样的方式，蛋白激酶和蛋白磷酸酶在酶的活性调控中发挥着重要的作用，进而调控着酶参与的生物学过程。类受体蛋白激酶(RLKs)定位于细胞质膜上，是一种含有氨基末端胞外结构域和羧基末端胞内激酶结构域的跨膜蛋白，通过其胞外结构域结合信号分子，激活胞内激酶结构域，从而完成信号的转导。其中，富含半胱氨酸类受体激酶(CRKs)的胞外结构域含有一个或两个DUF26结构域，含有三个保守的半胱氨酸残基C-X8-C-X2-C。拟南芥含有46个CRKs，在植物生长发育的调节、气孔反应、激素的应答、病原菌的防御以及生物和非生物胁迫中发挥重要功能。本发明涉及的OsCRK35基因属于水稻CRKs家族，目前尚没有与非生物逆境应答相关的水稻CRKs被报道。
水稻是重要的粮食作物和模式植物，在极端气候条件频发的今天，培育抗逆性增强的水稻具有重要的意义。鉴于OsCRK35基因是富含半胱氨酸的类受体激酶，是否能提高水稻的抗逆性目前尚无相关报道。因此，从水稻中分离出OsCRK35基因，并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供水稻中OsCRK35基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的OsCRK35基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。
本发明的另一个目的在于提供了水稻中OsCRK35基因在创制抗旱水稻中的应用，所述的OsCRK35基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
采用候选基因筛选的方法，申请人克隆到控制水稻抗旱性基因OsCRK35，该基因属于CRKs蛋白家族。该基因的功能缺失会导致水稻在干旱条件下抗旱性减弱。所述基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白的基因之一为SEQ ID NO.1所示。
本发明的保护范围包括：
水稻中OsCRK35基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的OsCRK35基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示；
以上所述的应用，具体为：
提高水稻中OsCRK35基因的表达量来提高水稻的抗旱性；
降低水稻中OsCRK35基因的表达量来减弱水稻的抗旱性；
敲除、抑制或者沉默水稻中OsCRK35基因的来减弱水稻的抗旱性。
以上所述的应用中，优选的，所述的敲除采用的是CRISPR/Cas9系统，所述系统中gRNA的靶位点为靶位点1：CCGGCCAGCCGTGGCCGAGC；靶位点2：TCTACGGCGTCATGCTCTGC。。
以上所述的应用中，CRISPR/Cas9系统编辑后的抗旱性减弱的水稻，具有SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示多核苷酸。
水稻中OsCRK35基因在创制抗旱水稻中的应用，所述应用具体为：将提高水稻中OsCRK35基因表达量的物质导入水稻中；
以上所述的应用，优选的，所述的物质为含有OsCRK35基因的核酸分子，或其表达框，重组载体，重组微生物；
所述的OsCRK35基因为SEQ ID NO.1所示。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
申请人首次披露水稻的OsCRK35基因与水稻的抗旱性相关，该基因可转化包括水稻在内的多种植物，用于培育抗旱植物新品种。
附图说明
图1为水稻oscrk35 CRISPR突变体基因编辑情况；
oscrk35-11和oscrk35-13为2个oscrk35 CRISPR突变体纯合无Cas9家系。
图2为水稻oscrk35 CRISPR突变体苗期干旱胁迫表型；
oscrk35-11和oscrk35-13为2个oscrk35 CRISPR突变体纯合无Cas9家系，中花11(ZH11)作为对照。
A图和B图为oscrk35-11家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态；C图和D图为oscrk35-13家系在干旱处理前和干旱复水后的生长状态。
图3为水稻oscrk35 CRISPR突变体苗期干旱胁迫存活率统计；
oscrk35-11和oscrk35-13为2个oscrk35 CRISPR突变体纯合无Cas9家系，中花11(ZH11)作为对照；
A图为oscrk35-11家系苗期干旱胁迫存活率统计情况；图3中的B图为oscrk35-13家系苗期干旱胁迫存活率统计情况。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在构建oscrk35 CRISPR突变体，克隆包含有OsCRK35基因完整编码区段的DNA片段，以及验证OsCRK35基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
实施例1：OsCRK35基因的分离和克隆
根据水稻基因数据库Rice Data(http://www.ricedata.cn/gene/)设计引物OsCRK35-FL-F(5’-ATGCG GCGGCGCTCGTCGCT-3’)和OsCRK35-FL-R(5’-CTATCTAGGAGACAATTGTG-3’)。以水稻品种日本晴叶片cDNA作为模板，使用引物OsCRK35-FL-F和OsCRK35-FL-R扩增OsCRK35基因编码的CDS序列。
PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，33个循环。将扩增获得的PCR产物通过TA克隆的方法连入pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序确认，获得OsCRK35的CDS序列(SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示)。
申请人将该克隆命名为pGEM OsCRK35质粒，可从该质粒上获得OsCRK35基因的完整编码区段的DNA片段。
实施例2：OsCRK35基因超量表达载体的构建
将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsCRK35质粒用引物OsCRK35-OE-F(5’-tacgaacgatagccggtacc ATGCGGCGGCGCTCGTCGCT-3’)和OsCRK35-OE-R(5’-ttgcggactctagaggatcc CTATCTAGGAGACAAT TGTG-3’)扩增出包含OsCRK35基因完整编码区段的DNA片段，
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环。将获得的PCR产物通过Gibson Assembly的方法连入经限制性内切酶KpnI和BamHI消化的pU1301载体，对载体进行测序确认，最终获得可用于遗传转化的OsCRK35基因超量表达载体。
实施例3：构建oscrk35 CRISPR突变体
从水稻基因数据库Rice Data(http://www.ricedata.cn/gene/)中获得OsCRK35基因的基因序列。根据CRISPR-P v2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)挑取一个靶位点。CRISPR突变体株系的载体构建可参照相关文献(和玉兵等.Programmed self-elimination of the CRISPR/Cas9 construct greatly accelerates theisolation ofedited and transgene-free rice plants.Mol.Plant.2018，05.005.)，限于篇幅本说明书不再展开描述。其中在CRISPR-P v2.0网站中选取的靶位点如下：
靶位点1：CCGGCCAGCCGTGGCCGAGC；靶位点2：TCTACGGCGTCATGCTCTGC。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(具体步骤如下所述)将构建好的CRISPR载体OsCRK35-CRIS PR转入到水稻品种“中花11”(一个常规水稻品种，来自中国农业科学院水稻科学研究所)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，PlantJ，6:271-282，1994)基础上改良进行(参见下面的转化步骤)。
本实施例的具体遗传转化步骤如下：
(1)电转化：将最终CRISPR目标载体OsCRK35-CRISPR，用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。
(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的CRISPR载体OsCRK35-CRISPR)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，培养温度19-20℃。
(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。
(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
(10)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
根据上述基因编辑靶位点位点，设计引物，对突变体中OsCRK35基因的编辑情况进行检测。用引物(OsCRK35-CR-F：5’-AGCTTACTAGCTTTCCATCATCCCACC-3’和OsCRK35-CR-R：5’-GTCGGA GACGCGGACGTAGCACT-3’)对OsCRK35基因进行特异的PCR扩增，将扩增出来的PCR产物进行测序，同时检测是否含有Cas9。测序结果显示，在oscrk35-11 CRISPR纯合无Cas9突变体家系(SEQ ID NO.3所示)中，OsCRK35基因在靶位点1处插入1个碱基，在靶位点2处插入1个碱基；在oscrk35-13CRISPR纯合无Cas9突变体家系(SEQ ID NO.4所示)中，OsCRK35基因在靶位点2处缺失1个碱基，即两个突变体家系中OsCRK35基因发生突变。
实施例4：oscrk35 CRISPR突变体苗期干旱胁迫表型的鉴定
将已鉴定好基因型的纯合突变体(oscrk35)(包括oscrk35-11和oscrk35-13)和对照野生型(即，非转基因，下同)水稻品种中花11(ZH11)催芽后直播到小圆桶中，小圆桶一半种植突变体材料，另一半种植对照野生型水稻品种中花11，各12株。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的水稻植株进行断水干旱胁迫7天，然后复水恢复7天，拍照并调查植株的存活率。
结果显示：与ZH11对照相比，CRISPR纯合突变体植株表现为干旱敏感表型(图2)。干旱复水后小圆桶中oscrk35-11突变体和对照ZH11的平均存活率分别为5.53％和33.33％，oscrk35-13突变体和对照ZH11的平均存活率分别为5.53％和38.9％。统计结果表明统计结果表明，oscrk35突变体在干旱复水后，存活率显著低于对照野生型ZH11(图3)。
Claims (10)
1. 水稻中OsCRK35基因在控制水稻抗旱性中的应用，所述的OsCRK35基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的控制是提高水稻中OsCRK35基因的表达量来提高水稻的抗旱性。
3.根据权利要求1所述的应用，所述的控制是降低水稻中OsCRK35基因的表达量来减弱水稻的抗旱性。
4.根据权利要求1所述的应用，所述的控制是敲除、抑制或者沉默水稻中的OsCRK35基因来减弱水稻的抗旱性。
5.根据权利要求4所述的应用，所述的敲除采用的是CRISPR/Cas9系统，所述系统中gRNA的靶位点为靶位点1：CGCCACCGTCCCTACCTCGA和靶位点2：GTCTCCGGCCATGTACGCCA。
6. 根据权利要求5所述的应用，CRISPR/Cas9系统编辑后的抗旱性减弱的水稻，具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示多核苷酸。
7. 水稻中OsCRK35基因在创制抗旱水稻中的应用，所述的OsCRK35基因编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示。
8.根据权利要求7所述的应用，其应用过程包括将提高水稻中OsCRK35基因表达量的物质导入水稻中。
9.根据权利要求8所述的应用，所述的物质为含有OsCRK35基因的核酸分子，或其表达框，重组载体，重组微生物。
10. 根据权利要求9所述的应用，所述的OsCRK35基因为SEQ ID NO.1所示。
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