CN111073873A

CN111073873A - Pp84蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN111073873A
Application number: CN201911417842.6A
Authority: CN
Inventors: 王瑜; 巩志忠; 郭亚真
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111073873B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及PP84蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明发现玉米PP84基因负调控植物的抗旱性，通过降低PP84基因的表达能够有效提高植物的抗旱性。本发明利用CRISPR/Cas9技术获得了PP84基因的稳定突变株系，相比于野生型玉米植株，PP84基因突变株系在干旱条件下的生长状况良好、叶片失水率降低，抗旱性显著提高。PP84基因的抗旱新功能为选育抗旱植物新品种提供了新的基因靶点和资源，为阐明植物干旱逆境信号应答的分子机制提供了理论依据，对农业生产具有重要意义。

Description

PP84蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及PP84蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

干旱是全球范围内最严重的非生物胁迫之一，干旱胁迫使植物生长发育受阻，植株矮小，作物产量和品质下降，给农业生产带来严重危害，是影响农业生产的世界性难题。因此，寻找参与植物干旱响应的基因，利用转基因过表达或基因编辑等技术突变这些基因，可以为分子育种和种质改良以及作物抗逆性提高提供候选基因资源。通过基因工程的方法进行抗逆新品种培育，可以提高育种效率，缩短杂交和筛选时间，且育种方向确定，是改良作物抗逆性状的有效方法之一，对增强作物抵抗生物和非生物逆境的能力、提高作物产量和品质以及缓解粮食短缺具有重要意义。

玉米(Zea mays)是三大粮食作物之一，也是重要的饲料作物，属于禾本科玉蜀黍属。随着B73和Mo17等玉米自交系基因组测序的完成，玉米的遗传背景更加清楚。同时，易于遗传转化的自交系不断被测序和开发，使转基因过表达和基因编辑技术的效率大大提高。这些技术手段为利用分子育种方法进行遗传性状改良提供了技术支持，对减轻干旱等非生物胁迫造成的玉米减产具有应用价值。

PP2C(type 2C protein phosphatase)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶中的M家族，其活性需要镁离子或锰离子。拟南芥中PP2C家族成员超过80个，分为10个亚家族，玉米中PP2C家族成员超过130个，分为11个亚家族(Clade A-I,U,K)。目前，PP2C家族蛋白的功能研究主要集中在双子叶模式植物拟南芥。不同PP2C亚家族的主要功能不同，其中，A类PP2C是ABA信号的关键负调节因子；B类PP2C参与负调控MAPK活性；C类PP2C参与干细胞发育；而F类PP2C的功能目前还不是很清楚，在拟南芥中推测F类PP2C参与抗病响应等。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供PP84蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明通过筛选CRISPR/Cas9突变体库，获得抗旱性提高的玉米突变体，经分析发现PP84蛋白的失活突变与玉米突变体的抗旱性提高相关。PP84蛋白属于F类PP2C蛋白磷酸酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。进一步地，本发明利用CRISPR/Cas9技术构建的PP84基因突变的转基因玉米，通过一系列实验，证明了PP84基因的突变能够显著提高玉米的抗旱性。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供PP84蛋白、其编码基因或其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在调控植物抗旱性中的应用。

第二方面，本发明提供PP84蛋白、其编码基因、其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在调控植物失水率中的应用。

第三方面，本发明提供PP84蛋白、其编码基因、其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在植物抗旱性的遗传育种中的应用。

优选地，上述应用中，通过降低PP84蛋白的表达量和/或活性，提高植物的抗旱性或降低植物的失水率。

所述降低PP84蛋白的表达量可为通过突变使得PP84蛋白失活。

本发明中，所述PP84蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％。

如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为玉米PP84蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如SEQID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的PP84蛋白的突变体。

本发明中，所述PP84蛋白的编码基因具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

(3)在严格条件下可以与如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为玉米自交系B73的PP84基因序列，在玉米基因组数据库中的编号为GRMZM5G829894。玉米PP84基因由4733个碱基组成，T05转录本的读码框为自5′端第963位到第3641位碱基。该基因由10个外显子组成，其中编码外显子8个，读码框分别为第1位到第44位碱基，第1051位到第1184位碱基，第1309位到第1407位碱基，第1498位到第1655位碱基，第1869位到第1957位碱基，第2056位到第2146位碱基，第2338位到第2414位碱基和第2498位到第2679位碱基，其余为其内含子序列。由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本专利保护范围内。由于玉米不同自交系的基因型存在自然变异，不同自交系中该基因的核苷酸序列或编码蛋白序列可能存在差异，但均在本专利保护范围内。考虑到密码子的简并性，所有编码所述PP84蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

本发明中，所述PP84蛋白的编码基因的抑制因子包括能够降低所述PP84蛋白的表达量和/或活性的核酸、蛋白质、化合物或组合物。

作为优选，所述核酸为gRNA或干扰RNA。

更优选地，所述gRNA的结合靶序列如SEQ ID NO.3所示。

上述gRNA可实现利用CRISPR/Cas9技术高效突变PP84基因。

本发明中，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

第四方面，本发明提供用于突变PP84基因的gRNA，所述gRNA的结合靶序列如SEQID NO.3所示。

优选地，所述gRNA的编码基因包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。该gRNA可实现利用CRISPR/Cas9技术高效突变PP84基因。

第五方面，本发明提供包含所述用于突变PP84基因的gRNA的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

第六方面，本发明提供一种抗旱玉米的选育方法，其为通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米中PP84蛋白的表达量和/或活性降低；所述PP84蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

具体地，所述转基因可包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述PP84蛋白的编码基因的抑制因子的重组载体导入玉米，获得转基因玉米株系。

PP84基因中可进行编辑突变的靶点不止一个，所有能够通过突变降低PP84基因的表达量和/或降低其蛋白质的生物学功能的突变方式均属于本发明要求保护的范围。

优选地，利用CRISPR/Cas9系统突变所述PP84蛋白的编码基因；所述CRISPR/Cas9系统使用的gRNA的结合靶序列如SEQ ID NO.3所示。

利用上述方法，本发明获得了PP84基因的突变株系，并通过自交得到去除CRISPR/Cas9背景的PP84基因稳定突变玉米株系。

作为本发明的一种实施方式，所述抗旱玉米的选育方法包括如下步骤：

(1)以如SEQ ID NO.3所示的序列作为编辑靶点，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体；

(2)将步骤(1)构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化至农杆菌中，构建重组农杆菌；

(3)利用步骤(2)获得的重组农杆菌侵染玉米幼胚，通过除草剂筛选和PCR鉴定筛选阳性植株，经DNA测序验证，获得PP84基因突变植株，PP84基因突变植株经自交繁种得到去除CRISPR/Cas9背景的PP84基因稳定突变玉米株系。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。优选地，所述单子叶植物为禾本科植物。更优选为玉米。

本发明的有益效果在于：本发明发现玉米PP84基因负调控植物的抗旱性，通过降低PP84基因的表达能够有效提高植物的抗旱性。本发明利用CRISPR/Cas9技术获得了PP84基因的稳定突变株系，相比于野生型玉米植株，PP84基因的突变株系在干旱条件下的生长状况良好、叶片萎蔫程度降低、叶片失水率降低，抗旱性显著提高，并且该突变株系为通过自交去除CRISPR/Cas9背景的玉米株系，能够在不同世代间稳定遗传，具有更高的稳定性和应用价值。本发明提供的PP84基因的抗旱新功能为选育抗旱植物新品种提供了新的基因靶点和资源，为阐明植物干旱逆境信号应答的分子机制提供了理论依据，对农业生产具有重要意义。本发明提供的抗旱植物的选育方法，与传统育种方式相比，具有育种时间短，目的性强等优势，显著缩短育种的周期，提高了抗旱育种的效率。

附图说明

图1为本发明实施例2中利用CRISPR/Cas9系统编辑PP84基因后的阳性突变体的测序结果；其中，WT代表野生型玉米，PP84(CRISPR)代表PP84基因阳性突变体。

图2为本发明实施例3中野生型玉米和PP84突变体经干旱处理后植株的生长情况；其中左侧三盆为野生型玉米，右侧三盆为PP84突变体。

图3为本发明实施例3中野生型玉米和PP84突变体的失水率检测结果；其中，WT代表野生型玉米，PP84 CRISPR代表PP84突变体。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中，如无特殊说明，玉米自交系生态型为B73；农杆菌菌株是EHA105。pBUE411C载体记载在非专利文献Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,BingLiu,Xue-Chen Wang and Qi-Jun Chen.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genomeediting in plants.BMC Plant Biology 2014,14:327.中。以下实施例中使用的主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Taraka公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自Sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。

实施例1CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建和鉴定

本实施例构建了用于PP84基因突变的CRISPR/Cas9基因编辑载体，具体方法如下：

1、PP84基因编辑靶点的筛选：

利用网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html，并结合人工筛选确定PP84基因的编辑靶点，其位于如SEQ ID NO.2所示的玉米PP84基因的第2287位～第2305位，靶点序列如SEQ ID NO.3所示。

2、CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

根据上述筛选确定的靶点设计引物如下：

SEQ ID NO.4：ID-1f：GGCGCTTAACATACTCAGCTGCT；

SEQ ID NO.5：ID-1r：AAACAGCAGCTGAGTATGTTAAG。

CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法如下：

(1)退火：将上述引物稀释后进行梯度退火，使其退火成双链，

(2)载体酶切：按照如表1所示的反应体系和反应程序进行载体酶切。

表1载体酶切反应体系和反应条件

(3)连接：按照如表2所示的反应体系和反应程序进行步骤(2)得到的酶切载体和步骤(1)的退火片段的连接。

表2连接反应体系和反应条件

(4)取步骤(3)得到的5μl酶切-连接体系的产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆测序，得到用于PP84基因突变的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

菌落PCR所用引物如下：

SEQ ID NO.4：ID-1f：GGCGCTTAACATACTCAGCTGCT；

SEQ ID NO.5：ID-1r：AAACAGCAGCTGAGTATGTTAAG。

测序引物如下：

SEQ ID NO.6：OsU3-FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGC TAC。

实施例2CRISPR/Cas9基因编辑玉米植株的构建和鉴定

将实施例1构建的测序正确的CRISPR/Cas9基因编辑载体通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。将鉴定正确的农杆菌单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接至大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD₆₀₀在0.8-1.0之间。侵染无菌条件下扒出的B73玉米幼胚后，诱导愈伤成苗，通过除草剂筛选和PCR鉴定筛选阳性植株。

对多个阳性植株进行测序发现，基因编辑结果存在不同的突变方式，其中一种突变使得PP84基因缺失一个碱基，造成PP84基因的移码突变(如图1所示)，导致PP84蛋白翻译提前终止，蛋白功能被破坏。T1代突变体经繁种获得T2代植株，可用于旱处理，观察表型。为防止再次发生突变，测序后挑出的突变体经过自交去掉Cas9，获得T3代稳定突变体后再进行干旱处理。

实施例3PP84突变体的旱处理表型检测

对实施例2构建的PP84突变体的T3代突变体进行旱处理和表型检测，以野生型玉米B73作为对照，具体方法如下：

在每个小盆中加入110g土，托盘里加上水，每小盆放4粒种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，在25℃温室培养，出苗后三天将长势不齐的一棵苗去掉，在托盘里加入1L水，吸满后将多余的水倒掉，开始进行旱处理(继续在25℃温室培养，培养过程不再给予水分)，旱处理约一周，观察对照和转基因植株生长、叶片萎蔫程度等表型。野生型及转基因植株各种3盆，作为生物学重复。结果如图2所示，结果显示，PP84突变植株的生长状况较对照明显增强，叶片萎蔫程度明显低于对照，说明与对照相比，PP84突变植株的抗旱性显著提高。

将对照和PP84突变植株在25℃温室下生长12天，分别取第二片叶，每三片为一个重复，用万分之一电子天平称量鲜重；在25℃放置0.5、1、2、3、4、5、6、7、8小时后，再进行称量，计算失水率，失水率的计算公式如下：失水率＝(起始重量-失水后重量)/起始重量×100％。

每次实验中，对照和PP84突变植株各做三个重复，三次独立重复实验。根据失水率和时间制作成失水曲线，结果如图3所示，结果显示，PP84突变植株的失水率明显低于对照，与对照相比，PP84突变植株的失水率降低了7％，说明PP84突变植株的抗旱性较对照具有显著提高。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> PP84蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

<130> KHP191117193.3

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Leu Ala Gly Asp Gly Ser Ala Asp Thr Ala His Leu Ser Asn

1 5 10 15

Asn Glu Asn Gly Arg Phe Ile Tyr Gly Val Ala Ser Ser Pro Gly Lys

20 25 30

Arg Ala Ser Met Glu Asp Phe Tyr Glu Ala Arg Ile Asp Asp Val Asp

35 40 45

Gly Glu Lys Ile Gly Met Phe Gly Val Tyr Asp Gly His Gly Gly Val

50 55 60

Arg Ala Ala Glu Tyr Val Lys Gln His Leu Phe Ser Asn Leu Ile Lys

65 70 75 80

His Pro Lys Phe Ile Thr Asp Thr Lys Ala Ala Ile Ala Glu Thr Tyr

85 90 95

Asn Leu Thr Asp Ser Glu Phe Leu Lys Ala Asp Ser Cys Gln Thr Arg

100 105 110

Asp Ala Gly Ser Thr Ala Ser Thr Ala Ile Ile Val Gly Asp Arg Leu

115 120 125

Leu Val Ala Asn Val Gly Asp Ser Arg Ala Val Ile Ser Lys Gly Gly

130 135 140

Gln Ala Ile Ala Val Ser Arg Asp His Lys Pro Asp Gln Thr Asp Glu

145 150 155 160

Arg Gln Arg Ile Glu Asp Ala Gly Gly Phe Val Met Trp Ala Gly Thr

165 170 175

Trp Arg Val Gly Gly Val Leu Ala Val Ser Arg Ala Phe Gly Asp Lys

180 185 190

Leu Leu Lys Gln Tyr Val Val Ala Asp Pro Glu Ile Lys Glu Glu Val

195 200 205

Val Asp Ser Ser Leu Glu Phe Leu Ile Leu Ala Ser Asp Gly Leu Trp

210 215 220

Asp Val Val Thr Asn Glu Glu Ala Val Ala Met Val Lys Pro Ile Gln

225 230 235 240

Asp Pro Gln Glu Ala Ala Asn Lys Leu Leu Glu Glu Ala Ser Arg Arg

245 250 255

Gly Ser Ser Asp Asn Ile Thr Val Val Ile Val Arg Phe Leu Tyr Gly

260 265 270

Thr Thr Gly Asp Lys Ser Gly Ala Asp Lys Glu Thr Thr Asn Asp Gln

275 280 285

Asn Ser

290

<210> 2

<211> 4733

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgagcctcc ataaagaagt cgccgatgtg agtcgtggcc tcgtgggcag tggcaaccta 60

ggatttgaat ctagagtagt tagaaataaa actttaacat atacaatagt gtataatctg 120

gcaccacgta tatataattt tcatcgatct ggtacataat aaaaataact aaaatatttc 180

ataatacttt taaatcatta aattagacta aacgttaagt gatagtttgt tttttagact 240

aaattttagg gtagtcggtc ggaggcctcc gcccctggtc gtggtggtgc ggccttaggg 300

ggtgtttggt ttctagggac taatgtttag tcccttcatt ttattccttt ttagtgtata 360

aattgttaaa tatggaaact aaaataaagt tttagtttct atatttggta attttagaac 420

taaaatggaa taaaatctag ggactaaata ttagtcccta taaaccaaac acccccttag 480

tcgtgattcg tgattcgtga ggggacagga caggaggcga gaaaagaggc cggggaccgg 540

ggtggcgaat ggcgatgacc gggtccgtcc agtcgcggcg cgcccgccac gtcatcctcc 600

cgccgatcgt tctcatccac tcttccgctg cttttccttt ctcctttctc ctctctcctc 660

tctccccttt cctctcccca agcaggcggg gcgagcgagc ccagcaggcg tctctcctct 720

cgtccatccg tttcctcctc cccctgcttc ccggctcgcc tccctcccct ccctgtgcgc 780

ctcttttcat gcgcgaggag ggaccgtggg gaccaccacc accagcacca ccacctccat 840

ccgtgcgcct ctcgctctcg ctggtggtgc tcctcctcct cctcctgctc ccggggcggg 900

cggcctcctt ttccacctcc tgctggtgcc agggccggga gggcgtcgcg gaggtggcgc 960

gcatggggct cgccggggac gggtcggcgg acaccgccca cctcaggttt tcctccctcc 1020

tcccttctcc ttcctctttc acctcccgct ttccctttcg cccccatcca tctggttgac 1080

ttcgccgtgg ggaacgagag gctagcttct caggaggcta tgacgcctcg tagccgagat 1140

ccatggcagc ggggacgaat tatactcctc tatctgctgc gccgtggccg tggattcggg 1200

acactggaat tattaggcac cgggcttggg cgcgacaggc ccagcctttc agttggatct 1260

gcccaattgt taatgtttga tcatgttggc catgagggtc gaacgatggc gggttactga 1320

tcagatcgtt cgggagctct cttctgcctc gtcgcacgat tggattttag gactattatt 1380

ccggtgtcac tttttttact tttgcgtgcc aagcatcagg atctattaag attttggtca 1440

tacatggctg atctaatgtc cactattaaa ccgaacctcg tgtcttttta actgacgatt 1500

ttacaggatt tgttgtgcaa gttaaccata tccgcaggcc ttgccgatgt attggctcat 1560

tgaatgtccc ccttgcaaac aagacattcc tcgcatcatt gctctttgaa tactaagtgc 1620

tacgtacaag tcctcactag ctagatgtgt tttctgcgtg caggtctgtc tacatttgat 1680

ttggtggcca attgttgaca agcttgtgtt tgttttctag tctaacataa cttgtgtgtt 1740

atactcatgt gttagatggt attccaagct aactacaaag aaataaagac taaagagtgt 1800

ctgttactct ggtgaacttt atggaagtta gatgttgaat tttctttttc gtccgaaata 1860

taaagcatac aaaactccat agcagctcaa tcagtttatt aatgtcatag gaaattcctt 1920

gtactgattt tctgtcttgt atataacact aacagtgtgc agtgtcacat aatccgaatt 1980

cacacttgtt tgacagaacg ttacccttgc agtaataatg aaaatgggcg gttcatttat 2040

ggagttgcga gttctcctgg taaaagagca tcgatggagg acttctatga ggcaagaata 2100

gacgacgttg atggagagaa aattggaatg ttcggtgtat atgatggtat gtattcgcta 2160

gcgacatctg aagtgatatc aattcccgcg gttttcctaa tgccaccact ctctgatgaa 2220

gttggtagtt tgagttgtaa ggttgagggc atggttttct gtttctgtag gtcatggagg 2280

agtccgagca gctgagtatg ttaagcagca ccttttcagc aatttaatca aacacccaaa 2340

gttcatcact gataccaagg ctgctatcgg tactttcata ttagcttaac tattgtagac 2400

ttttgacttg tacactgaga tatggtgatc ttgataccct tgtattattt ttgctgcagc 2460

cgaaacttac aacctcacag attcagaatt tctgaaagct gatagctgtc aaactcgaga 2520

tgctggctca actgcctcaa cagctattat tgtaggtgac cgtttgcttg ttgcaaatgt 2580

tggagattct agagccgtta tttctaaagg aggacaaggt aagtttctcg ttggtaacat 2640

gacatatctc aatgtctttt cctatacttc cacatgtatc ggaaactttc aaattattat 2700

atgctgtgta ttttcctgga cgagtatttc cttgtgacga atggataaac tgaatatcag 2760

gattccaagc taaccacgtt ccacttgtat tcgatatttt ttgttatgtt ttccccatct 2820

cggagctgca gcgattgcgg tttcaaggga tcacaaacct gatcagacag atgagagaca 2880

aagaattgag gacgcagggg gctttgttat gtgggctggt agtgattcct ctgattctat 2940

ctataaaaag aaactatctt atcttaatat gtgccattac tgttgcttct actgcttgat 3000

ttttcgaaat ttgtagggac atggcgagtg ggtggtgttc ttgctgtctc tcgcgcattt 3060

ggtgataaac tcttgaagca gtatgttgtc gctgaccctg aaatcaaggt ttgtcatgca 3120

cttatgtttt attacggatt gtcgggatag tttttcagac ctatcatggt ttgagggaat 3180

atggtggggt tgtaaacttg taataagtgc ctaaaaatgg ggattccatc atttagcaat 3240

gtcatacatc acccacaccc cctgtagcca tctgaaaacg atttttgctg ttacaatcag 3300

gaggaggtgg tcgacagctc ccttgaattc ctcatccttg ctagtgatgg actctgggat 3360

gttgtcacta atgaggtacc tacagatatt gctaaatata ttcattcagt gcaattggtc 3420

tgtctgtcac tcttacctga cgttatgtat ttttccagga agctgttgcc atggtcaagc 3480

ctattcagga cccccaggaa gcagcaaaca agcttctcga agaagcgtcc cgaaggggaa 3540

gctctgataa catcaccgtt gtcatcgtcc gcttcctata tggaactacc ggtgataaat 3600

caggcgcaga caaagagacc accaatgacc aaaactccta attacctcct gtagggatcc 3660

ctcatgcgtg tgttttcttc tggctgttgt atctgatgct caaagtagat gctccgtgtg 3720

tcttccgctg ctgttccgca aggaaactga ctcccccgac cgtcgtcgtg atgctgcccg 3780

ctcatgctcc tagacgggaa tgactgccgc agaatgacga atagggctgg tgtgtgttac 3840

agtatggtcc tttacccctc ctttccatta agctctgtga tgtagctgtc cgtgctgttg 3900

attcatgaga tcatgctaga gatttttcct ggcagtgcgt gtaaaactgt cgaactattt 3960

gaacgaaagt tgtacactgc agtatgtaac aatctcctag atccgccttt tgtggcgtcc 4020

tgctgtcatg cacctgaatg ctaccaagcc gggacggagg tgagctatcg gtttactcgg 4080

tgtacagaaa cgggaaggtc gaatttttac agagcaagtg cgtggattat catattaatg 4140

tgcaaataaa ctgttacata tatgaaattt ggaccaaaca ggaatgaata atcacaatta 4200

ggaagattcg aatgtatgta agttaaagaa aggccagtct ttgacccatg ctaaaaaaac 4260

accatgcctc taggaccagt atggaagtta aagaaaggtc aatcttcata tgatatcgga 4320

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cattgtcttc atgaccgaga gcatcgacac aatatgcaga taatttatgc gacacaatga 4440

gaggagtaga agctggctta cagttgttga cacattttag gatatcacga gcatacttct 4500

tttgtgacaa aactaaacca tcatagacct tcttaacttt aattccaaaa aataatgaag 4560

atctctaaga tcttttaatg caaaactctc tattaaatct ttaagcaatg cagaaactgt 4620

ttcactagat gaacttataa ctatgatatc attatatata tatatatata tgctaatata 4680

tgtatagttt atgtattaga agccctaggc ttttataact agagggagct ctg 4733

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcagctgag tatgttaag 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacagcagc tgagtatgtt aag 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacaggcgtc ttctactggt gctac 25

Claims

1.PP84蛋白、其编码基因、其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在调控植物抗旱性中的应用。

2.PP84蛋白、其编码基因、其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在调控植物失水率中的应用。

3.PP84蛋白、其编码基因、其编码基因的抑制因子或含有其编码基因或其编码基因的抑制因子的生物材料在植物抗旱性的遗传育种中的应用。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，通过降低PP84蛋白的表达量和/或活性，提高植物的抗旱性或降低植物的失水率。

5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述PP84蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述PP84蛋白的编码基因的抑制因子包括能够降低所述PP84蛋白的表达量和/或活性的核酸、蛋白质、化合物或组合物；

优选地，所述核酸为gRNA或干扰RNA；

更优选地，所述gRNA的结合靶序列如SEQ ID NO.3所示。

7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

8.一种用于突变PP84基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA的结合靶序列如SEQ ID NO.3所示。

9.一种抗旱玉米的选育方法，其特征在于，包括：通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米中PP84蛋白的表达量和/或活性降低；

所述PP84蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统突变所述PP84蛋白的编码基因；所述CRISPR/Cas9系统使用的gRNA的结合靶序列如SEQ ID NO.3所示。