CN109112142A - OsNMCP1基因在控制水稻耐旱中的应用 - Google Patents

OsNMCP1基因在控制水稻耐旱中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsNMCP1基因在控制水稻耐旱中的应用。本发明采用候选基因筛选方法，通过反向遗传学手段，克隆得到一个控制水稻耐旱应答基因OsNMCP1，该基因的核苷酸序列如SEQ NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ NO：3所示。苗期和抽穗期干旱胁迫表型鉴定结果表明，超表达OsNMCP1基因造成转基因水稻对干旱抗性提升，而OsNMCP1基因的缺失突变则导致水稻抗旱能力显著降低。本发明证实了该基因的生物学功能及其应用的途径和方法。

Description

OsNMCP1基因在控制水稻耐旱中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及OsNMCP1基因在控制水稻耐旱中的应用。本发明采用候选基因筛选的方法，通过反向遗传学手段，克隆到控制水稻耐旱应答基因OsNMCP1，苗期和成株期干旱胁迫表型鉴定结果表明，超表达OsNMCP1基因可以提高水稻在干旱环境下根的发育与生长，而OsNMCP1基因的缺失则会导致水稻根部的生长迟缓，细胞的发育受到阻碍，根长变短，证实了该基因的功能及应用途径。
背景技术
植物不像动物一样具有可移动的能力，因此在非生物逆境(如干旱、涝害、高温、低温、盐碱等)来临时，植株的生长必将受到严重的影响，严重制约着植物的生长发育和作物的生产增收。水稻是世界上三大主要粮食作物之首，研究水稻对非生物逆境的适应和抵抗机制，将有助于对其进行抗逆遗传改良，提高作物产量。植物为了抵抗或适应这些不利的因素，在长期的进化过程中形成了一系列复杂的逆境应答调控机制,通过多种途径将这些非生物逆境的信号传递到细胞内，并调控一些逆境应答基因的表达，产生一些增加细胞抗旱胁迫的功能蛋白、渗透调节物质和传递信号调控基因表达的转录因子，对外界的变化做出相应的反应，最大限度地降低胁迫带来的伤害，维持植物体的基本生理活动(Xiong等，Cellsignaling during cold,drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl),S165–S183，2002)。植物抗旱是一个复杂的特征，而干旱胁迫通常伴随着高温或其他胁迫。植物利用多种策略来应对干旱胁迫，并通过不同的信号级联和渗透调节，通过形态和生理变化来适应干旱。抗旱性大致可以分为四种类型：逃旱性(drought escape，DE)，避旱性(droughtavoidance，DA)，耐旱性(drought tolerance，DT)和复水抗旱性(drought recovery，DR)。避旱性主要是通过减少水分的丢失和维持水分的吸收来提高细胞的水势，而增大根系密度和深度，增强水分传导是主要的方式之一。(Nguyen等，Breeding for Drought Resistancein Rice:Physiology and Molecular Genetics Considerations.Crop Science,1997,37(5):1426-1434；Hu等，Genetic Engineering and Breeding of Drought-ResistantCrops.Annu Rev Plant Biol 2014；65)。根系几乎是植物吸收水分的唯一器官，其在植物抗旱中扮演着无可替代的角色。纵深发达的根系是植株渡过干旱的重要保证。在以往传统的认识中，当面临干旱时，植物会通过增加根系的长度，根系粗度，侧根数目和根毛密度等手段来增加水分的吸收面积。而最近的研究表明，在干旱胁迫中，为了吸收更深层土壤中的水分，拟南芥根系最大的变化是牺牲横向的侧根发育，转而将能量和营养物质更多地投入到根系的轴向生长上(Koevoets等，Roots Withstanding their Environment:ExploitingRoot System Architecture Responses to Abiotic Stress to Improve CropTolerance.Frontiers in Plant Science,2016,7(112):1335)。在干旱胁迫下，植物为了更好地抵御干旱，根系除了吸收更多的水分之外，在分子调控层面上也做出了很多的贡献。
水稻的品质和产量受到干旱，盐渍和低温等非生物胁迫的严重制约。因此，培育节水抗旱水稻对我国农业的可持续发展具有十分重要的意义。根系是植物直接吸收水分和营养的主要器官，发达的根系有利于增加植株的生存和复原抗性的能力。根的伸长在植物早期抵御干旱的过程中发挥着至关重要的作用，是植物躲避干旱的主要策略之一。对OsNMCP1进行进一步的功能研究，能够丰富根尖介导避旱机制的认识，为作物抗旱遗传育种提供新的思路。鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的涉及一个调控水稻根发育的核纤层蛋白基因OsNMCP1提高水稻的抗旱性改良中的应用。
本发明的技术方案如下所述：
本发明分离和应用一种包含OsNMCP1基因的DNA片段，缺失该片段时，水稻抗干旱胁迫能力减弱，而利用组成型启动子驱动该片段超量转录OsNMCP1基因后，水稻对干旱胁迫耐受力增强。
OsNMCP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，序列长度为2964bp，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：3所示，编码987个氨基酸残基。
可以采用PCR技术，从水稻基因组DNA和由mRNA反转录而得的cDNA中扩增得到本发明的OsNMCP1基因，可将这一序列构建到pU1301(见图9)等基因超量表达载体上，通过转化水稻植株，可通过提高该基因的表达量，从而获得对干旱耐受能力增强的转基因水稻植株。
携带有本发明OsNMCP1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的OsNMCP1基因的核苷酸序列，序列全长为5080bp。
序列表SEQ ID NO:2是本发明克隆的OsNMCP1基因的的cDNA序列，即OsNMCP1基因的编码区(CDS)序列(1-2964bp)及其对应的氨基酸序列，编码987个氨基酸残基。
序列表SEQ ID NO:3是本发明克隆的OsNMCP1基因编码的蛋白质的序列。
图1：水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体和OsNMCP1超表达植株苗期干旱胁迫表型及干旱胁迫后存活率的统计。附图标记说明：图1中的A图为水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体植株苗期干旱胁迫前和胁迫后复水表型；图1中的B图为水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体植株苗期干旱胁迫后存活率的统计结果；图1中的C图为OsNMCP1基因T-DNA插入突变体植株基因型检测；图1中的D图为水稻OsNMCP1基因超表达植株苗期干旱胁迫前和胁迫后复水表型；图1中的E图为水稻OsNMCP1基因超表达植株苗期干旱胁迫后存活率的统计结果；图1中的F图为OsNMCP1基因超表达植株基因表达量检测。图1中的统计结果均基于三次重复，误差线表示标准偏差(SD)。
图2：水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体成株期正常生长和干旱胁迫后复水表型及对应的根部长度和根体积的测量。附图标记说明：图2中的A图和B图分别为PVC管中水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体和野生型(非转基因)植株正常生长条件下地上和地下部分表型；图2中的D图和E图分别为水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体和野生型植株干旱胁迫后地上和地下部分表型；图2中的C图和F图分别为水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体和野生型植株正常生长和干旱胁迫后根长度和根体积测量统计结果。结果基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。
图3：水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体与野生型对照苗期根长差异表型和树脂切片后细胞差异比较结果。附图标记说明：图3中的A图为野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体主根长度差异；图3中的图B和C分别为野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体侧根数目差异；图3中的D图为根尖的四个区：即，根冠，分生区，伸长区和成熟区；图3中的E图为OsNMCP1基因在四个不同根尖分区的表达量差异；图3中的F图为启动子驱动GUS标签蛋白表达的材料，GUS染色观察主要在成熟区表达，根冠基本不表达的基因，在此作为一个取样对照；图3中的G图和H图分别为野生型和OsNMCP1基因突变体以及野生型和OsNMCP1基因超表达材料根尖伸长区切片细胞长度差异比较。图3中的统计数据均基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。
图4：水稻OsNMCP1基因在不同浓度脱落酸(ABA)和吲哚乙酸(IAA)处理和干旱胁迫下表达水平检测以及野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体低浓度ABA和IAA处理的表型。附图标记说明：图4中的A图和B图分别为水稻OsNMCP1基因在不同浓度ABA、IAA处理下的表达水平；图4中的C图为OsNMCP1基因在正常条件和干旱胁迫后根和叶中的表达水平；图4中的D图、E图和F图分别为野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体在正常、0.05μM ABA和0.03μM IAA处理后的表型；图4中的G图为为野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体在正常、低浓度ABA和IAA处理后根长统计结果。图4中的统计数据均基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。
图5：水稻OsNMCP1基因T-DNA插入突变体和OsNMCP1超表达植株及对应的野生型苗期正常和干旱处理后根尖伸长区树脂切片图。附图标记说明：图5中的A图和B图是野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体苗期正常和干旱处理后根尖伸长区树脂切片图；图5中的C图和D图是野生型和OsNMCP1超表达植株及对应的野生型苗期正常和干旱处理后根尖伸长区树脂切片图。
图6：野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体苗期在正常、0.05μM ABA和0.03μMIAA处理后根尖切片结果。附图标记说明：图6中的A图、B图和C图是野生型苗期在正常、低浓度ABA和IAA处理后根尖显微结构；图6中的D图、E图和F图分别是OsNMCP1基因T-DNA插入突变体苗期在正常、0.05μM ABA和0.03μM IAA处理后根尖显微结构。
图7：野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体苗期正常条件和脱水处理3h至叶片卷曲IAA和ABA含量测定，以及野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体中不同生长素相关基因的表达水平检测。附图标记说明：图7中的A图为野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体苗期正常条件和脱水处理3h至叶片卷曲时IAA含量测定；图7中的B图为野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体苗期正常条件和脱水处理3h至叶片卷曲时ABA含量测定；图7中的C图为野生型和OsNMCP1基因T-DNA插入突变体中不同植物激素相关基因的相对表达水平。图7中的结果均基于三次重复，误差线代表标准偏差(SD)。
图8：OsNMCP1基因融合GFP稳定表达转基因植株细胞核免疫荧光精细定位观察。附图标记说明：图8中的A图和D图分别为GFP抗体免疫荧光观察，绿色荧光代表OsNMCP1基因的表达位置；图8中的B图和E图分别为PI染料，染细胞核和细胞框架(红色荧光)；图8中的C图和F图分别为GFP和PI叠加的效果图。图8中的A图、B图和C图为20倍物镜观察；图8中的D图、E图和F图为60倍物镜观察。
图9：是商购的pU1301质粒图谱。
图10：是商购的pDONRT221质粒图谱。
图11：是商购的pH7WGF2质粒图谱。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有OsNMCP1基因完整编码区段的DNA片段，以及验证OsNMCP1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
实施例1：分离克隆OsNMCP1基因
申请人采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从已经测序的水稻品种日本晴(原始材料来自中国农业科学院作物科学研究所，为常规实验材料)叶片提取总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSIII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA，反应条件：65℃5min，42℃120min，70℃10min。以该cDNA为模板，以引物NMCPI-1301UF：5’-TACGAACGATAGCCGGTACCATGGCGAGCCCGCGGTC-3’和NMCPI-1301UR：5’-TTGCGGACTCTAGAGGATCCTCAAGTTATGAGGAAACGCCACAGC-3’扩增出OsNMCP1基因的全长cDNA(2964bp，见序列表SEQ ID NO:2)。PCR反应条件：95℃预变性3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃3min，35个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物用“一步法”(Gibson等，Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.NatMethods,2009,6(5):343-345)连入pCAMBIA1301U载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序确认，获得OsNMCP1基因全长cDNA，申请人将这个克隆命名为p1301U-OsNMCP1，即后续用于超量表达的载体。
实施例2：osnmcp1突变体的分离鉴定
从韩国Postech水稻突变体库(http://www.postech.ac.kr)中挑取OsNMCP1基因位点相应的T-DNA插入突变体1C-01360(nm1，Hwayoung背景)。其中在上述网站突变体库中所登录的nm1突变体1C-01360的侧翼序列(该序列长度为1121bp)，序列如下：
ATCAGCGTACGTGCTTTTGAGTTCAGGCGCACATCTTTATGTAAATAATTTGCATTAGGTCGCTCATCAATGTCATTCGTGCTAGTAGTATTTGTTTGAGTTTGACTAAACTTCAGGTTTTGTTTTAGACGCAGACGACCACTAATGATTTTCCGTCGTGGGGTGCACTAATAGAACGTCTGAACGTTTTCTGCGTGCTTAGACGAGTTCACATTGACCATCAATTTAGTACTAAAAAATTAGCAGAATATTTAGCAGGGTTTGTACTACTTAACTACTTATTGAAATAGAGTTTTATTTGCTATAAATCTTTCGTATTGATCTGTAAAGACAAAATAACATAGTTGTAACAGCGTCCTAATAAATACTTCCTAATCAATTTACCCAAAGTAGGTGGGAATGAAATGGGAAGCTTGGCAAAGGGTAATCAATTTCATGAACAATCATTTTCTGATATAATGAAACAGACATCCTCATTAATCTTCAGTTGAAACAGACATCCTGAAACATGGACCCGACACTGAGAAATTTGGCACGGCCTTACTTATAACATAACGGTATTTAAGCCAATAAGACGAATCAAATGAATATCAAACCATCTACGTTAACTTTGCTTCCACTTCGCACAACAGCAAGAGGTTACCAGGGCGCCCCCATCATTTTTTACACAACCACTTTACAAGTCGAAGAAGCAACAGAGGCAAGAAGATGGAAAACACAGTGGAGGATTCAGCTCAGCAGCGGCTTCCAAAACTGCCGCTGCTCACAATACCACATGCACACACAACTAGACACAAAGGCTTCCCCTTTCAATCCGAGAGGGGGGCAATGCCGAAAGCAATACAGCTAAAGTGATTATCTTTATAAGAGAGGTAACTGTCAGCCTACAGTTAGCTCTGTATTATCTATCAGAGGTGAAACTAATCTCCATCAAGTTATGAGGAAACGCCACAGCTTCTTCGCTGAAGATGTTTTCTCTTCCTCTTCCTCTTCATCTTCCTCGTCAGAGTCATTGTTGTCCTCAGGTCCATCTACATTAGATGTTTCAGTTGCAGACTGCAAATCGAAAACAGAATATAGTAAGTTCAATGGACCAAGGCACATACTAAAAGCATATGATGAGAATAGTGCAGCTGCAGCTGAAAGAGGAATTACCACTGTAGCCTCCACCGAAGGTTCCTCTTGGACAGAATCTGAATTATCCACTATTCCGTTCACGTAAGGCACATCAACAGATGAAGCTGGTTCTCCTGGTTTTGTAAGGTTCTCTGGCCCTTTATCGCCGTATTCATGTTCCTTGC
根据T-DNA插入位点，设计引物nm1-A：5’-TCAGCGTACGTGCTTTTGAG-3’和nm1-B：
5’-CAGCTGCAGCTGCACTATTC-3’，并配合T-DNA特异引物pGAR：
5’–TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC-3’鉴定了nm1纯合突变体。同时反转录，PCR结果显示，在nm1纯合突变体中，OsNMCP1基因的转录无法被检测到(图1中的C图)，即表明nm1突变体中OsNMCP1基因被显著抑制。
将已鉴定好基因型的nm1纯合突变体和野生型对照材料HY脱粒去壳后，用75％酒精洗2min，0.15％升汞洗15min，用无菌dH2O洗5-7次，在生根培养基上生长5天。挑选长势一致的苗子移栽到小圆桶中。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致。对健康生长的4叶期的植株进行断水干旱胁迫5-8天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复，5天后开始观察恢复状态，可以每隔一天拍照一次，选择差异最显著的时刻记录并调查植株的存活率。同时将另外的生长一个月的苗子移栽到泡好土的PVC管中，待生长到生殖生长时期(即，幼穗分化的3-4期)，开始断水胁迫，胁迫一周后复水继续生长，待种子成熟。将PVC管倒置拔出植株，轻柔用水冲洗植株根部，尽量避免根部受损，测量根长度，再用杯子溢水法测量根的体积。实验结果表明，nm1突变体苗期相比于野生型植株表现为干旱敏感表型(图1中的A图)。存活率统计结果，nm1突变体基本没有存活的，而野生型植株有50％的存活率(此为三个重复的平均结果)(见图1中的B图)。成株期胁迫具有相同表型，nm1突变体相比于野生型表现为干旱敏感(见图2中的A图、D图)，根长和根体积测量结果显示正常条件下nm1突变体根长变短，根体积变小(图2中的B图、C图)，而干旱胁迫后，差异增大(图2中的E图、F图)。OsNMCP1基因缺失后，使得植株根系结构变短变小，不利于在干旱下生长。因此OsNMCP1基因在维持植株根系结构中起着十分重要的作用。
实施例3：OsNMCP1基因超量表达载体的构建和转化
超量表达载体构建方法如下：首先将实施例1中得到的阳性克隆p1301U-OsNMCP1质粒测序正确后用于转化。即通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种ZH11中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6:271-282，1994)基础上改良进行。转化载体中共获得了20株独立的转基因水稻植株。
具体步骤：(1)愈伤组织诱导：将成熟的水稻品种中花11(或称ZH11)种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上(成分见后)。将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，培养温度为25±1℃。(2)愈伤组织继代培养：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，培养温度为25±1℃。(3)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，放于预培养培养基上黑暗下培养2周，培养温度为25±1℃。(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于澳大利亚CAMBIA实验室，商用菌株)两天，培养温度为28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28℃摇床上培养2-3小时。(5)农杆菌侵染：将预培养的愈伤组织转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD600 0.8-1.0；将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养培养基上培养3天，培养温度为19-20℃。(6)愈伤组织的洗涤和选择培养：用灭菌水洗涤愈伤组织至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤组织至选择培养基(成分见后)上选择培养2-3次，每次2周(第一次筛选时的羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次及以后的羧苄青霉素浓度为250ppm，潮霉素浓度为250ppm)。(7)分化：将抗性愈伤组织转移至预分化培养基(成分见后)上，于黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤组织至分化培养基上，在光照(按水稻组织培养常规人工光照条件)下培养，培养温度为26℃。(8)生根：剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基中的光照下培养2-3周，培养温度为26℃。(9)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
转化中所用试剂和培养基的配制：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基氨基嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein EnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。
(2)主要溶液配方：
1)N6培养基大量元素母液[按10倍浓缩液(即10×)]的配制：
逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。
2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100×)]的配制
室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100×)的配制
准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，用蒸馏水定容至1000mL，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100×)配制
加蒸馏水水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制
室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。
7)2,4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml。
8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。
9)AS贮存液的配制：秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基
加蒸馏水至250ml，用1N的氢氧化钾调节pH至5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
加蒸馏水至900ml，用1N的氢氧化钾调pH至6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH至5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
实施例4：OsNMCP1基因超量表达转基因家系干旱表型鉴定
将转基因出苗的植株T0代苗出苗一个月后取RNA样品，进行反转录，同实施例1反转录方法得到cDNA样品，用OsNMCP1基因的靠近3-UTR引物检测表达量，检测引物的序列为NM1-qRT-F：5’-GAAGGAATCCCTGCTTGACA-3’，NM1-qRT-R：5’-TCTCGGCCCGTTCTTTAC-3’，同时用引物序列(uF：AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3’和uR：5’-ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA)对水稻ubiquitin1基因(LOC_Os03g13170)作特异性扩增，以作为内对照进行定量分析。反应条件：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，共40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析(按常规方法)。将检测的苗子收种后分离T1代苗子，再次检测表达量，得到超表达植株(图1的中F图)。从超表达植株上收种即为T1代种子。将T1代种子在含有潮霉素的1/2MS生根培养基上生长5天。挑选长势一致的苗子移栽到小圆桶中。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2:3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致。对健康生长的4叶期的植株进行断水干旱胁迫5-8天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复，5天后开始观察恢复状态，可以每隔一天拍照一次，选择差异最显著的时刻记录并调查植株的存活率。试验结果表明，OsNMCP1基因超量表达植株苗期相比于野生型植株表现为干旱不敏感表型(图1的中D图)。存活率统计结果表明，OsNMCP1基因超量表达的植株存活率达到80％以上，而野生型植株只有10％左右的存活率(此为三个重复的平均结果)(见图1中的E图)。再一次证实OsNMCP1基因在提高水稻的抗旱性中起到重要作用。
实施例5：OsNMCP1基因影响水稻植株根系结构并受到植物激素的试验
将OsNMCP1基因突变体和野生型种子用实施例2中种子消毒后播种在生根培养基上，待植株到苗期7天时对生长状况进行观察，可以看到OsNMCP1基因突变体植株根长短于野生型(见图3中的A图)，同时侧根数目也少于野生型植株(见图3中的B图、C图)，对根尖的四个区：根冠(区)，分生区，伸长区和成熟区进行精细取样(图3中的D图)，检测OsNMCP1基因的表达水平，可以看到OsNMCP1基因在伸长区表达量最高，结果见图3中的E图。图3中的F图是用OsNMCP1基因的启动子驱动GUS表达检测在成熟区表达量高，在根冠(区)基本不表达对照基因，图中显示取样分布可行。OsNMCP1基因突变体和野生型，OsNMCP1基因超表达和对应野生型植株苗期根尖取样，戊二醛固定，树脂包埋法包埋根尖样品，超薄切片机进行切片，甲苯胺蓝染色后用DIC显微镜进行细胞观察，可以看到OsNMCP1基因突变体植株伸长区细胞短于野生型伸长区细胞(图3中的G图)，OsNMCP1基因超表达植株伸长区细胞长于野生型伸长区细胞(图3中的H图)。同样地，将OsNMCP1基因突变体和OsNMCP1基因超表达植株对应的野生型植株进行干旱处理，取根尖样品进行切片观察，结果显示，干旱胁迫后OsNMCP1基因突变体植株根尖伸长区细胞缩水比野生型更厉害(见图5中的A图、B图)，OsNMCP1基因超表达植株根尖伸长区细胞缩水比野生型更能维持正常状态(见图5中C图、D图)。
在本发明的实施中，观察到根的发育受到植物激素的影响，用不同浓度的植物激素如IAA和ABA处理野生型植株，检测OsNMCP1基因的表达情况，可以看到低浓度的植物激素可以诱导OsNMCP1基因的表达，而高浓度的植物激素对其影响不大(见图4中的A图、B图)，因此本发明选择低浓度的植物激素处理野生型和OsNMCP1基因突变体植株，结果显示植物激素处理可以恢复OsNMCP1基因突变体的根表型(图4中的D图、E图和F图)。本实施例对根的长度做了统计(图4中的G图)。正常生长情况下，OsNMCP1基因突变体的根长要短于野生型，而低浓度的IAA和ABA可以恢复根长。
检测OsNMCP1基因突变体植株根中植物激素IAA和ABA的含量与野生型植株根中的差异，将OsNMCP1基因突变体植株和野生型植株水培种植一个月苗子，正常样品为从水培液中取出样品，干旱样品为脱水处理3小时至叶片卷曲，样品放液氮罐中取回后进行冷冻干燥冻干样品，打样机打碎样品成粉末状，称取相同粉末0.1g，放入1.5ml eppendorf离心管中，加入750ul配好的含有IAA和ABA内标的Buffer1抽提液(甲醇：ddH2O：乙酸＝80：19：1(V:V:V)；d5-IAA：作为IAA,IAA-Asp,IAA-Ala内标，10ng/mL,Sigma-Aldrich,USA；d6-ABA：作为ABA内标，10ng/mL,Olomouc,Czech Republic)，颠倒混匀，置冰上，避光；4℃静音混合器旋转避光抽提16小时以上；4℃、13000rpm离心10分钟，吸上清于一新离心管中；在沉淀中加450μl抽提buffer 2((不含内标)组分：甲醇：ddH2O：乙酸＝80：19：1(V:V:V))，4℃、脱色摇床300转/分钟避光抽提4小时以上，4℃、13000rpm离心10分钟，吸上清，合并两次上清；用1ml注射器吸取合并的上清过0.22μm滤膜(购自天津市津腾实验设备有限公司，尼龙66)，至一新的1.5ml离心管中，在通风橱中用氮气吹干，加200ul甲醇颠倒几次后4℃溶解3-6小时；溶解液在4℃、13000rpm离心15分钟后，轻轻吸取上清150-180μl至内插管中，放置于质谱专用上样瓶等待上样(刘等，convenient method for simultaneous quantification ofmultiple phytohormones and metabolites:application in study of rice-bacteriuminteraction.Plant Methods 8,2.2012)。测定结果表明OsNMCP1基因突变体植株根部IAA含量低于野生型，而干旱处理后含量差异增大(图7中的A图)，OsNMCP1基因突变体植株根部ABA含量低于野生型植株，而干旱处理后含量差异增大(图7中的B图)，植物激素在植物生长中起重要作用，OsNMCP1基因缺失后植物激素不能正常合成，进而影响植株根的发育。
实施例6：OsNMCP1基因表达的蛋白分布于细胞核的核外周试验
本实施例将OsNMCP1基因融合GFP绿色荧光蛋白标签构建载体，采用免疫荧光的方法用GFP的抗体进行OsNMCP1基因的定位观察。具体步骤如下：用引物序列NMattB1(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGCGAGCCCGCGGTC-3’)和NMattB2(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAAGTTATGAGGAAACGCCACAGC-3’)(不包含终止密码子)，扩增出包含OsNMCP1全长的DNA片段，反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，35个循环；72℃延伸10min。该片段纯化后用gateway方法(参考invitrogen公司的Gateway manual使用手册)的BP反应连接到中间载体pDONRT221(见图10，购买于invitrogen公司)上，测序正确后再用LR反应连接到能够与GFP融合表达的终载体pH7WGF2，0(见图11，购自invitrogen公司)，用载体测序正确后质粒转化农杆菌，农杆菌侵染产生转基因稳定表达植株，操作方法同实施例3中的转化步骤。
将获得的检测好的转基因植株后，从该植株上收获种子，发芽7天后取根尖样品，用4％的多聚甲醛固定，1×PBS缓冲液(gibco by life technology,lot:1916735)洗两次，用0.02mg/mL的甘氨酸终止固定，用1×PBS缓冲液洗两次，再用5％的琼脂糖包埋根尖样品，凝固后用震动切片机对根尖进行切片，切片厚度为50μm，切好后用PBST 4℃冰箱封闭过夜，次日早上用1×PBS缓冲液洗两次，加入体积比为1:1000的GFP一抗，孵育2个小时，用1×PBS缓冲液洗两次，加入体积比为1:500的488发光二抗孵育2个小时，用1×PBS缓冲液洗两次，进行confocal荧光观察，制片的时候加入稀释的PI染料。观察结果显示，在20×低倍镜下，可以看到绿色荧光在细胞核发光(图8中A图、B图、C图)，而将视野调制高倍镜60×时，可以看到绿色荧光主要在细胞核的外围，并不是分布于整个细胞核(图8中D图、E图和F图)。这证实OsNMCP1基因是一个核外围基因，同已报道的细胞核纤层蛋白分布相同，OsNMCP1基因可能在维持细胞核内各种信号转导路径中起到重要作用有关。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> OsNMCP1基因在控制水稻耐旱中的应用
<141> 2018-07-28
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5080
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(5080)
<400> 1
gggcaggagc catggcgagc ccgcggtcgg caggtggggt gggaggagga ggcggaggag 60
gaggaggaag tggtggcgca gccgcggggg acgacgcgat ctggagtaag ctccgggagg 120
ccggcttcga cgaggagtcc ctcaagcgcc gcgacaaggc ggcgctcatt gcgtacatct 180
cgcggctcga gtccgaggta cccacctcac tctctctctc ccccctcctc ccctccttgt 240
gcgtgctgga tggcaaggtt cttggatttc ttgatttgat ggtttgactc cctcagtagc 300
tagttcttgg tggagggttt cctcctagga gaggagaaag attgatggcc gagaagaatc 360
ggcggaacgt cgatgaagtc ttcctcttgg aatcattcgc tgcgtgggtt cttgtgtgac 420
taatgtcgag tttggtgcgc tatgagttat cgggaaagaa gaaaaatcat tttgggattt 480
tggtggttgc tcagttcttt gtttcttagg tacagctgac atgctggatg ggtttattaa 540
tgattcaaga agctattttt tttgcgttgg tgtttagaat cgttatcttg gaatgtttgt 600
catttagttt agcttgcttg gattagttag tggctgaact gtaattgtat aagtttgctt 660
cttttatttt tttttttaca tttttacatt caacttattt atctatttct ttcgctttgg 720
ggtttctact gttgcaacta tacatatgta ttctgggtta gcttgtctgg attgaaatag 780
tagattgctt tatgcattgc ggtagcatac gattaatgtt ggaagatgcc atggctatta 840
ttacattggt atttgccgaa accattcatt gatctgtatg caatttgtat caatagtaaa 900
gtctgcacat cagtaaacca gttagtctat tatttacttc tttcctattc accatcggat 960
gtatgcccaa atgttaaata cctacattgt cataagctat catatttagg acctattgca 1020
catgttgtaa ctaaaggcaa atttacacgt tttgctctgc agaagaatgg taaataaaat 1080
atctgcttta tcttattctt tgcttgtttt gttgtagatt tatcaatacc aacacaatct 1140
tggtcttgtt ttgatggagc ggaaggagtt aacatccaag catgagcaac ttagagctgc 1200
ttcggaatct gctgagatta tgcacaagcg tgaacgtgca gcccagcagt ctgctttagc 1260
tgaagcaagg aagaaggaag aaaacctgaa aaagagttta ggcatccaaa aggagtgtgt 1320
tgctaatgta agtttttatc ccaaataata gctcagaagc aaaatttatt atttatgtct 1380
atgagaacaa aagaaaaatt cactgtacat gagacattct gagatttaat ttttttatcc 1440
aattcatata taatgataat gtggccctta ttcaattttt tctggtagct tgaaaaagca 1500
ttgcatgata tgcgtgggga aacagctgaa acaaaggttt catatgaatc gaaattggct 1560
gaagctcttc aattgatgga ggctgcacac aagaaatttg atgaggcaga agagaagctt 1620
cttctagcaa aatctttgga ggcagagtcc atacggactc ataatgcagc actgagaagt 1680
ttacatgaca tcgatgatcg cgaagatcag cttagaagag accgaatttc ttgtgagctc 1740
gagtgagtgt tctatgttcc accttttcaa ttaaatcgtc tttcttatat agtatagctt 1800
aattcagttc agtaaatcac tgtcaaaatg cttttaattt ttttagtcaa ctgtgtactt 1860
tgtaagatat tcttgcatag tttagtgggc atcttttatt ccttttccct aaatcaggca 1920
tgctaatgca ggaatgaggc caaagagaag gaaattagcc tccagaggaa atcgttgaac 1980
gatatgaaga aaattttgca tgaaaaggag gaagtattac taaaggaaca agctctactc 2040
aatcagaggg acgagaacat ccttgagaga ttagcttatg ttactcactc agagaaaaga 2100
gtggaagaag aaaagaatat tcttgaagct gaacggaagg ttttgttaga ggaaaaatat 2160
aagttggagc tgaaaatgga ggcaatagtt tcaagagagg aagtatgtat atttttctcc 2220
ttttattacc acctatatat cattgcgaaa gttctgtcta acaaaattga tctcttttgc 2280
aggctctgat tcagaaggaa tccctgcttg acaaaaggga gagtgaatta ttaattttgc 2340
aagagacaat cgcaagtaaa gaacgggtaa gattctccaa tttcactatt gacaatgtgt 2400
gttgtgactt aacctcttgt aaatcatctt gaatttctgc tgcaggccga gattgaaagg 2460
ttgaatcagg aacaagctat agccttggag aggagaaaac atgattttga atctgagatg 2520
gcaaacaaac aaatgtcttt tgatgcagca atggaggtga caagaaatgc gctgcatcag 2580
agagaatgtg ctctcagtga gcaggaatct gtggttgtgc aaagatccca gaatcttgac 2640
cttcagctag ctgaattagc aagcaaggaa aaggcgttgg cagggagatc agatgagttg 2700
aaagaggagg aggaaaagct cttgttacac agagaagcca tacacaatga acttcaaaaa 2760
gaaagggaag aaatacaaag gattaaatcg gatttggaga aggaaaaggc tttctttgaa 2820
gaggagaaac gggaagcaat tcaagcccaa caagatctag caataacaca agcagataga 2880
gatgagttgc ttactctgca gatgaaactt aaagaagaaa ttgacagcct cagagcccaa 2940
aaaagggaac tcatggctga tgcagatagg ctgcaagccg aaaaggaaag gtttgagatt 3000
gaatgggagc tgattgatga aaagaaagag gagctacaaa aggaagcgat cagaattgct 3060
gaagaacgaa gagcaataac tgagtatctg aagaatgaat ctgatatcat caaacaggag 3120
aaggataatc tccgtgttca gttcaaaagt aattcagaaa cactctctcg tgaacacaaa 3180
gagttcatga gtaagatgca gcaagaacat gcaagttggc tgagtaagat tcaacaagaa 3240
aggcaagatc tgaagagaga cattgatatc cagagggtgg aattgctaaa ttctgctaag 3300
gcaaggcaga tggaaataga ttcttatttg agggaaaggg aggaagagtt tgagcagaaa 3360
aaggccaagg aactcgaaca catcaattct cagaaggaga tgatcaacac aaaattagaa 3420
catgttgcag ttgaattgca gaaacttaag gatgagagaa aagaagctac tttggaacgt 3480
gagaggagag agcaagagtt gtctgagata aaaggcacta ttgaagcctt gaataatcaa 3540
cgggagaagc tgcaagagca aagaaaacta ttacattcag accgagaagc aattacagtg 3600
caaattcaac aacttaatgt gttggaagaa ctgaaaattg attctgaaaa taagcaactg 3660
tctttgttac aacatgataa gtcaaagctt ggaagtgata taaatgtgaa agacaatcat 3720
catgataact cccattcttc accaaagcaa cgttttggaa ggaaactaga cctttctcca 3780
gtctcaacac cgatttcttg ggttcgaaaa tgtgctcagg tgatattcaa acggtctcca 3840
gagaagagcg ctagccatga tcaatttgtc cagaatggtg tgccaaagaa agttggagac 3900
tctgtggatg ttgaagatgt gaatttggac tttgcaaaag ttggtcaaaa gaggcttaat 3960
catttggttt cttgtgacca aactgaagtt ttagagccaa aacgaaagca cagaaggagt 4020
actattcaga aagttaatgg aggggaaatc acttccaact ggtatgattt gtttttacac 4080
tactatctga acttttgaaa gcagcgtgac tattttaatt taatgtttct tcatgccctt 4140
cactaacaat ctgatattga cagcctgtca gctctagaag agaaatgctc caagaatgaa 4200
catgatgaag ccccacttgg tttatccaac acctgcaagg aacatgaata cggcgataaa 4260
gggccagaga accttacaaa accaggagaa ccagcttcat ctgttgatgt gccttacgtg 4320
aacggaatag tggataattc agattctgtc caagaggaac cttcggtgga ggctacagtg 4380
gtaattcctc tttcagctgc agctgcacta ttctcatcat atgcttttag tatgtgcctt 4440
ggtccattga acttactata ttctgttttc gatttgcagt ctgcaactga aacatctaat 4500
gtagatggac ctgaggacaa caatgactct gacgaggaag atgaagagga agaggaagag 4560
aaaacatctt cagcgaagaa gctgtggcgt ttcctcataa cttgatggag attagtttca 4620
cctctgatag ataatacaga gctaactgta ggctgacagt tacctctctt ataaagataa 4680
tcactttagc tgtattgctt tcggcattgc ccccctctcg gattgaaagg ggaagccttt 4740
gtgtctagtt gtgtgtgcat gtggtattgt gagcagcggc agttttggaa gccgctgctg 4800
agctgaatcc tccactgtgt tttccatctt cttgcctctg ttgcttcttc gacttgtaaa 4860
gtggttgtgt aaaaaatgat gggggcgccc tggtaacctc ttgctgttgt gcgaagtgga 4920
agcaaagtta acgtagatgg tttgatattc atttgattcg tcttattggc ttaaataccg 4980
ttatgttata agtaaggccg tgccaaattt ctcagtgtcg ggtccatgtt tcaggatgtc 5040
tgtttcaact gaagattaat gaggatgtct gtttcattat 5080
<210> 2
<211> 2964
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2964)
<400> 2
atg gcg agc ccg cgg tcg gca ggt ggg gtg gga gga gga ggc gga gga 48
Met Ala Ser Pro Arg Ser Ala Gly Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
gga gga gga agt ggt ggc gca gcc gcg ggg gac gac gcg atc tgg agt 96
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ala Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser
20 25 30
aag ctc cgg gag gcc ggc ttc gac gag gag tcc ctc aag cgc cgc gac 144
Lys Leu Arg Glu Ala Gly Phe Asp Glu Glu Ser Leu Lys Arg Arg Asp
35 40 45
aag gcg gcg ctc att gcg tac atc tcg cgg ctc gag tcc gag att tat 192
Lys Ala Ala Leu Ile Ala Tyr Ile Ser Arg Leu Glu Ser Glu Ile Tyr
50 55 60
caa tac caa cac aat ctt ggt ctt gtt ttg atg gag cgg aag gag tta 240
Gln Tyr Gln His Asn Leu Gly Leu Val Leu Met Glu Arg Lys Glu Leu
65 70 75 80
aca tcc aag cat gag caa ctt aga gct gct tcg gaa tct gct gag att 288
Thr Ser Lys His Glu Gln Leu Arg Ala Ala Ser Glu Ser Ala Glu Ile
85 90 95
atg cac aag cgt gaa cgt gca gcc cag cag tct gct tta gct gaa gca 336
Met His Lys Arg Glu Arg Ala Ala Gln Gln Ser Ala Leu Ala Glu Ala
100 105 110
agg aag aag gaa gaa aac ctg aaa aag agt tta ggc atc caa aag gag 384
Arg Lys Lys Glu Glu Asn Leu Lys Lys Ser Leu Gly Ile Gln Lys Glu
115 120 125
tgt gtt gct aat ctt gaa aaa gca ttg cat gat atg cgt ggg gaa aca 432
Cys Val Ala Asn Leu Glu Lys Ala Leu His Asp Met Arg Gly Glu Thr
130 135 140
gct gaa aca aag gtt tca tat gaa tcg aaa ttg gct gaa gct ctt caa 480
Ala Glu Thr Lys Val Ser Tyr Glu Ser Lys Leu Ala Glu Ala Leu Gln
145 150 155 160
ttg atg gag gct gca cac aag aaa ttt gat gag gca gaa gag aag ctt 528
Leu Met Glu Ala Ala His Lys Lys Phe Asp Glu Ala Glu Glu Lys Leu
165 170 175
ctt cta gca aaa tct ttg gag gca gag tcc ata cgg act cat aat gca 576
Leu Leu Ala Lys Ser Leu Glu Ala Glu Ser Ile Arg Thr His Asn Ala
180 185 190
gca ctg aga agt tta cat gac atc gat gat cgc gaa gat cag ctt aga 624
Ala Leu Arg Ser Leu His Asp Ile Asp Asp Arg Glu Asp Gln Leu Arg
195 200 205
aga gac cga att tct tgt gag ctc gag aat gag gcc aaa gag aag gaa 672
Arg Asp Arg Ile Ser Cys Glu Leu Glu Asn Glu Ala Lys Glu Lys Glu
210 215 220
att agc ctc cag agg aaa tcg ttg aac gat atg aag aaa att ttg cat 720
Ile Ser Leu Gln Arg Lys Ser Leu Asn Asp Met Lys Lys Ile Leu His
225 230 235 240
gaa aag gag gaa gta tta cta aag gaa caa gct cta ctc aat cag agg 768
Glu Lys Glu Glu Val Leu Leu Lys Glu Gln Ala Leu Leu Asn Gln Arg
245 250 255
gac gag aac atc ctt gag aga tta gct tat gtt act cac tca gag aaa 816
Asp Glu Asn Ile Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Val Thr His Ser Glu Lys
260 265 270
aga gtg gaa gaa gaa aag aat att ctt gaa gct gaa cgg aag gtt ttg 864
Arg Val Glu Glu Glu Lys Asn Ile Leu Glu Ala Glu Arg Lys Val Leu
275 280 285
tta gag gaa aaa tat aag ttg gag ctg aaa atg gag gca ata gtt tca 912
Leu Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Glu Leu Lys Met Glu Ala Ile Val Ser
290 295 300
aga gag gaa gct ctg att cag aag gaa tcc ctg ctt gac aaa agg gag 960
Arg Glu Glu Ala Leu Ile Gln Lys Glu Ser Leu Leu Asp Lys Arg Glu
305 310 315 320
agt gaa tta tta att ttg caa gag aca atc gca agt aaa gaa cgg gcc 1008
Ser Glu Leu Leu Ile Leu Gln Glu Thr Ile Ala Ser Lys Glu Arg Ala
325 330 335
gag att gaa agg ttg aat cag gaa caa gct ata gcc ttg gag agg aga 1056
Glu Ile Glu Arg Leu Asn Gln Glu Gln Ala Ile Ala Leu Glu Arg Arg
340 345 350
aaa cat gat ttt gaa tct gag atg gca aac aaa caa atg tct ttt gat 1104
Lys His Asp Phe Glu Ser Glu Met Ala Asn Lys Gln Met Ser Phe Asp
355 360 365
gca gca atg gag gtg aca aga aat gcg ctg cat cag aga gaa tgt gct 1152
Ala Ala Met Glu Val Thr Arg Asn Ala Leu His Gln Arg Glu Cys Ala
370 375 380
ctc agt gag cag gaa tct gtg gtt gtg caa aga tcc cag aat ctt gac 1200
Leu Ser Glu Gln Glu Ser Val Val Val Gln Arg Ser Gln Asn Leu Asp
385 390 395 400
ctt cag cta gct gaa tta gca agc aag gaa aag gcg ttg gca ggg aga 1248
Leu Gln Leu Ala Glu Leu Ala Ser Lys Glu Lys Ala Leu Ala Gly Arg
405 410 415
tca gat gag ttg aaa gag gag gag gaa aag ctc ttg tta cac aga gaa 1296
Ser Asp Glu Leu Lys Glu Glu Glu Glu Lys Leu Leu Leu His Arg Glu
420 425 430
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Ala Ile His Asn Glu Leu Gln Lys Glu Arg Glu Glu Ile Gln Arg Ile
435 440 445
aaa tcg gat ttg gag aag gaa aag gct ttc ttt gaa gag gag aaa cgg 1392
Lys Ser Asp Leu Glu Lys Glu Lys Ala Phe Phe Glu Glu Glu Lys Arg
450 455 460
gaa gca att caa gcc caa caa gat cta gca ata aca caa gca gat aga 1440
Glu Ala Ile Gln Ala Gln Gln Asp Leu Ala Ile Thr Gln Ala Asp Arg
465 470 475 480
gat gag ttg ctt act ctg cag atg aaa ctt aaa gaa gaa att gac agc 1488
Asp Glu Leu Leu Thr Leu Gln Met Lys Leu Lys Glu Glu Ile Asp Ser
485 490 495
ctc aga gcc caa aaa agg gaa ctc atg gct gat gca gat agg ctg caa 1536
Leu Arg Ala Gln Lys Arg Glu Leu Met Ala Asp Ala Asp Arg Leu Gln
500 505 510
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Ala Glu Lys Glu Arg Phe Glu Ile Glu Trp Glu Leu Ile Asp Glu Lys
515 520 525
aaa gag gag cta caa aag gaa gcg atc aga att gct gaa gaa cga aga 1632
Lys Glu Glu Leu Gln Lys Glu Ala Ile Arg Ile Ala Glu Glu Arg Arg
530 535 540
gca ata act gag tat ctg aag aat gaa tct gat atc atc aaa cag gag 1680
Ala Ile Thr Glu Tyr Leu Lys Asn Glu Ser Asp Ile Ile Lys Gln Glu
545 550 555 560
aag gat aat ctc cgt gtt cag ttc aaa agt aat tca gaa aca ctc tct 1728
Lys Asp Asn Leu Arg Val Gln Phe Lys Ser Asn Ser Glu Thr Leu Ser
565 570 575
cgt gaa cac aaa gag ttc atg agt aag atg cag caa gaa cat gca agt 1776
Arg Glu His Lys Glu Phe Met Ser Lys Met Gln Gln Glu His Ala Ser
580 585 590
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Trp Leu Ser Lys Ile Gln Gln Glu Arg Gln Asp Leu Lys Arg Asp Ile
595 600 605
gat atc cag agg gtg gaa ttg cta aat tct gct aag gca agg cag atg 1872
Asp Ile Gln Arg Val Glu Leu Leu Asn Ser Ala Lys Ala Arg Gln Met
610 615 620
gaa ata gat tct tat ttg agg gaa agg gag gaa gag ttt gag cag aaa 1920
Glu Ile Asp Ser Tyr Leu Arg Glu Arg Glu Glu Glu Phe Glu Gln Lys
625 630 635 640
aag gcc aag gaa ctc gaa cac atc aat tct cag aag gag atg atc aac 1968
Lys Ala Lys Glu Leu Glu His Ile Asn Ser Gln Lys Glu Met Ile Asn
645 650 655
aca aaa tta gaa cat gtt gca gtt gaa ttg cag aaa ctt aag gat gag 2016
Thr Lys Leu Glu His Val Ala Val Glu Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu
660 665 670
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Arg Lys Glu Ala Thr Leu Glu Arg Glu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Ser
675 680 685
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Glu Ile Lys Gly Thr Ile Glu Ala Leu Asn Asn Gln Arg Glu Lys Leu
690 695 700
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705 710 715 720
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Gln Ile Gln Gln Leu Asn Val Leu Glu Glu Leu Lys Ile Asp Ser Glu
725 730 735
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Asn Lys Gln Leu Ser Leu Leu Gln His Asp Lys Ser Lys Leu Gly Ser
740 745 750
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Asp Ile Asn Val Lys Asp Asn His His Asp Asn Ser His Ser Ser Pro
755 760 765
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Lys Gln Arg Phe Gly Arg Lys Leu Asp Leu Ser Pro Val Ser Thr Pro
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Ile Ser Trp Val Arg Lys Cys Ala Gln Val Ile Phe Lys Arg Ser Pro
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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Glu Val Leu Glu Pro Lys Arg Lys His Arg Arg Ser Thr Ile Gln Lys
850 855 860
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Val Asn Gly Gly Glu Ile Thr Ser Asn Cys Leu Ser Ala Leu Glu Glu
865 870 875 880
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Lys Cys Ser Lys Asn Glu His Asp Glu Ala Pro Leu Gly Leu Ser Asn
885 890 895
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Thr Cys Lys Glu His Glu Tyr Gly Asp Lys Gly Pro Glu Asn Leu Thr
900 905 910
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Lys Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ser Val Asp Val Pro Tyr Val Asn Gly
915 920 925
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930 935 940
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Thr Val Ser Ala Thr Glu Thr Ser Asn Val Asp Gly Pro Glu Asp Asn
945 950 955 960
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965 970 975
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Ser Ala Lys Lys Leu Trp Arg Phe Leu Ile Thr
980 985
<210> 3
<211> 987
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 3
Met Ala Ser Pro Arg Ser Ala Gly Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ala Ala Gly Asp Asp Ala Ile Trp Ser
20 25 30
Lys Leu Arg Glu Ala Gly Phe Asp Glu Glu Ser Leu Lys Arg Arg Asp
35 40 45
Lys Ala Ala Leu Ile Ala Tyr Ile Ser Arg Leu Glu Ser Glu Ile Tyr
50 55 60
Gln Tyr Gln His Asn Leu Gly Leu Val Leu Met Glu Arg Lys Glu Leu
65 70 75 80
Thr Ser Lys His Glu Gln Leu Arg Ala Ala Ser Glu Ser Ala Glu Ile
85 90 95
Met His Lys Arg Glu Arg Ala Ala Gln Gln Ser Ala Leu Ala Glu Ala
100 105 110
Arg Lys Lys Glu Glu Asn Leu Lys Lys Ser Leu Gly Ile Gln Lys Glu
115 120 125
Cys Val Ala Asn Leu Glu Lys Ala Leu His Asp Met Arg Gly Glu Thr
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Arg Asp Arg Ile Ser Cys Glu Leu Glu Asn Glu Ala Lys Glu Lys Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Glu Lys Glu Glu Val Leu Leu Lys Glu Gln Ala Leu Leu Asn Gln Arg
245 250 255
Asp Glu Asn Ile Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Val Thr His Ser Glu Lys
260 265 270
Arg Val Glu Glu Glu Lys Asn Ile Leu Glu Ala Glu Arg Lys Val Leu
275 280 285
Leu Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Glu Leu Lys Met Glu Ala Ile Val Ser
290 295 300
Arg Glu Glu Ala Leu Ile Gln Lys Glu Ser Leu Leu Asp Lys Arg Glu
305 310 315 320
Ser Glu Leu Leu Ile Leu Gln Glu Thr Ile Ala Ser Lys Glu Arg Ala
325 330 335
Glu Ile Glu Arg Leu Asn Gln Glu Gln Ala Ile Ala Leu Glu Arg Arg
340 345 350
Lys His Asp Phe Glu Ser Glu Met Ala Asn Lys Gln Met Ser Phe Asp
355 360 365
Ala Ala Met Glu Val Thr Arg Asn Ala Leu His Gln Arg Glu Cys Ala
370 375 380
Leu Ser Glu Gln Glu Ser Val Val Val Gln Arg Ser Gln Asn Leu Asp
385 390 395 400
Leu Gln Leu Ala Glu Leu Ala Ser Lys Glu Lys Ala Leu Ala Gly Arg
405 410 415
Ser Asp Glu Leu Lys Glu Glu Glu Glu Lys Leu Leu Leu His Arg Glu
420 425 430
Ala Ile His Asn Glu Leu Gln Lys Glu Arg Glu Glu Ile Gln Arg Ile
435 440 445
Lys Ser Asp Leu Glu Lys Glu Lys Ala Phe Phe Glu Glu Glu Lys Arg
450 455 460
Glu Ala Ile Gln Ala Gln Gln Asp Leu Ala Ile Thr Gln Ala Asp Arg
465 470 475 480
Asp Glu Leu Leu Thr Leu Gln Met Lys Leu Lys Glu Glu Ile Asp Ser
485 490 495
Leu Arg Ala Gln Lys Arg Glu Leu Met Ala Asp Ala Asp Arg Leu Gln
500 505 510
Ala Glu Lys Glu Arg Phe Glu Ile Glu Trp Glu Leu Ile Asp Glu Lys
515 520 525
Lys Glu Glu Leu Gln Lys Glu Ala Ile Arg Ile Ala Glu Glu Arg Arg
530 535 540
Ala Ile Thr Glu Tyr Leu Lys Asn Glu Ser Asp Ile Ile Lys Gln Glu
545 550 555 560
Lys Asp Asn Leu Arg Val Gln Phe Lys Ser Asn Ser Glu Thr Leu Ser
565 570 575
Arg Glu His Lys Glu Phe Met Ser Lys Met Gln Gln Glu His Ala Ser
580 585 590
Trp Leu Ser Lys Ile Gln Gln Glu Arg Gln Asp Leu Lys Arg Asp Ile
595 600 605
Asp Ile Gln Arg Val Glu Leu Leu Asn Ser Ala Lys Ala Arg Gln Met
610 615 620
Glu Ile Asp Ser Tyr Leu Arg Glu Arg Glu Glu Glu Phe Glu Gln Lys
625 630 635 640
Lys Ala Lys Glu Leu Glu His Ile Asn Ser Gln Lys Glu Met Ile Asn
645 650 655
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660 665 670
Arg Lys Glu Ala Thr Leu Glu Arg Glu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Ser
675 680 685
Glu Ile Lys Gly Thr Ile Glu Ala Leu Asn Asn Gln Arg Glu Lys Leu
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Gln Glu Gln Arg Lys Leu Leu His Ser Asp Arg Glu Ala Ile Thr Val
705 710 715 720
Gln Ile Gln Gln Leu Asn Val Leu Glu Glu Leu Lys Ile Asp Ser Glu
725 730 735
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755 760 765
Lys Gln Arg Phe Gly Arg Lys Leu Asp Leu Ser Pro Val Ser Thr Pro
770 775 780
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785 790 795 800
Glu Lys Ser Ala Ser His Asp Gln Phe Val Gln Asn Gly Val Pro Lys
805 810 815
Lys Val Gly Asp Ser Val Asp Val Glu Asp Val Asn Leu Asp Phe Ala
820 825 830
Lys Val Gly Gln Lys Arg Leu Asn His Leu Val Ser Cys Asp Gln Thr
835 840 845
Glu Val Leu Glu Pro Lys Arg Lys His Arg Arg Ser Thr Ile Gln Lys
850 855 860
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865 870 875 880
Lys Cys Ser Lys Asn Glu His Asp Glu Ala Pro Leu Gly Leu Ser Asn
885 890 895
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900 905 910
Lys Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ser Val Asp Val Pro Tyr Val Asn Gly
915 920 925
Ile Val Asp Asn Ser Asp Ser Val Gln Glu Glu Pro Ser Val Glu Ala
930 935 940
Thr Val Ser Ala Thr Glu Thr Ser Asn Val Asp Gly Pro Glu Asp Asn
945 950 955 960
Asn Asp Ser Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Thr Ser
965 970 975
Ser Ala Lys Lys Leu Trp Arg Phe Leu Ile Thr
980 985

Claims (3)

1.一种分离的OsNMCP1基因在提高水稻对干旱胁迫耐受能力中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ NO：1所述序列的1-5080位碱基所示。
2.一种分离的OsNMCP1基因在提高水稻对干旱胁迫耐受能力中的应用，其特征在于，该基因编码的蛋白质序列如SEQ NO：3所示。
3.权利要求1或2的应用，其特征在于，通过转基因，使OsNMCP1基因在水稻中超表达，提高水稻对干旱胁迫耐受能力。
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