CN1952142A - 利用水稻病程相关基因OsPR4－1提高植物抗旱能力 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻DNA片断的分离克隆、功能验证及其应用。所述的DNA片断包含水稻逆境相关基因OsPR4－1，它赋予植物对干旱等逆境胁迫的耐受能力。将该DNA片段与其外源调节序列直接转入植物体，转基因植物对干旱胁迫的耐受能力显著增强。

Description

利用水稻病程相关基因OsPR4-1提高植物抗旱能力

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物抗旱有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)、水稻Actin1启动子和干旱诱导型启动子(HVA1)分别结合后直接转入一般植物体，转基因植株的抗旱能力显著提高。

背景技术

植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱往往导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育抗旱性作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应环境不利因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong等，Cell signaling during cold，drought and salt stress.Plant Cell.14：S165-S183，2002)。功能蛋白主要是一些在植物抗逆反应中直接起保护作用的蛋白质，包括保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白、合成渗透调节物质的关键酶类、清除活性氧(ROS)等具有生物活性的蛋白质或酶类，通过遗传转化一些编码这类蛋白的基因提高植物的抗逆性已有许多报道。例如，LEA是具有高度的亲水性，使植物能够在缺水条件下保持膜系统及生物大分子免受破坏的功能蛋白，将大麦的LEA蛋白基因HVA1转入水稻，转基因水稻的抗旱性和耐盐性均比对照有明显提高；且抗性高低程度明显与LEA蛋白含量多少有关(Xu等，Expression of a Late Embryogenesis Abundant Protein Gene，HVA1，from Barley Confers Tolerance toWater Deficit and Salt Stress in Transgenic Rice.Plant Physiol，110：249-257，1996)。拟南芥钠氢离子交换蛋白基因AtNHX1不仅在拟南芥中表达能提高植株的抗盐性(Shi等，Regulation of expression of the vacuolarNa+/H+antiporter gene AtNHX1 by salt stress and abscisic acid.Plant Mol Biol，50：543-550，2002)，将其转化番茄，转基因植株抗盐性明显提高(Zhang等，Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulatesalt in foliage but not in fruit.Nat Biotechnol，19：765-768，2001)。渗透调节物质是植物在高盐或干旱条件下，为了消除胁迫所造成的伤害，维持渗透平衡和体内水分，在细胞中产生和积累的一些小分子有机化合物，主要有：氨基酸及其衍生物(脯氨酸、甘氨酸甜菜碱等)、糖类(海藻糖、果聚糖等)、多元醇(甘露糖醇等)。在植物中遗传转化一些合成渗透调节物质的基因，如海藻糖合成酶(Garg等，Trehaloseaccumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses.Proc NatlAcad Sci U S A，99：15898-15903，2002)和脯氨酸合成酶基因P5CS(Kishor等，Overexpression of[delta]-Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase Increases Proline Production and Confers Osmotolerancein Transgenic Plants.Plant Physiol，108：1387-1394，1995)，能显著提高植物抗旱、耐盐性。将大肠杆菌的甘露醇磷酸脱氢酶基因mtlD转入小麦，150mM的高盐条件胁迫下，转基因植株的鲜重、干重和株高分别只降低了40％、8％和18％，而对照则降低了70％、56％和40％(Abebe等，Tolerance ofmannitol-accumulating transgenic wheat to water stress and salinity.Plant Physiol，131：1748-1755，2003)。清除活性氧ROS的酶类包括谷胱甘肽S转移酶GST、可溶性环氧化物水解酶、超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD等；它们协同作用共同抵抗逆境胁迫产生的氧化伤害。将来源于拟南芥的Fe-SOD基因在烟草中超量表达，转基因植株对干旱所引起的氧化伤害比对照轻许多，增强了其对干旱的耐受能力(VanCamp等，Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducingFe-superoxide dismutase in chloroplasts.Plant Physiol，112：1703-1714，1996)。

水稻是最重要的粮食作物之一，培育抗旱水稻无疑具有非常重要的意义。病程相关蛋白(Pathogenesis-relatedprotein，PR)是与植物抗病反应相关的主要功能蛋白，目前至少鉴定出了17个PR基因家族(Christensen等，The molecular characterization of two barley proteins establishes the novelPR-17 family of pathogenesis-related proteins，Mol.Plant Pathol.3：135-144，2002)。尽管有证据表明一些病程相关蛋白基因也能受一些非生物逆境胁迫(如伤害)的诱导表达(Agrawal等，Isolation ofa novel rice PR4 type gene whose mRNA expression is modulated by blast pathogen attack and signalingcomponents，Plant Physiol.Biochem.41：81-90，2003)，但还未见利用这些生物逆境相关基因提高植物抗逆性的报道。因此，鉴定出对提高非生物逆境抗性有效果的抗病相关基因，对于培育既抗非生物逆境又抗病的水稻新品种将具有非常重要意义。

发明内容

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含逆境相关蛋白基因完整编码区段的DNA片段，利用这个基因改良水稻或其它植物抗旱的能力。对这个基因进行结构分析表明它属于水稻病程相关蛋白基因PR4家族的一个成员，因此被命名为OsPR4-1。

本发明涉及分离和应用一种包含OsPR4-1基因的DNA片段，该片段赋予植物在干旱等逆境条件下耐受性增强的能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的OsPR4-1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsPR4-1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsPR4-1基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植株，可获得对干旱胁迫耐受力得到增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。

携带有本发明OsPR4-1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2^ndEdition)。

可使用包括本发明的OsPR4-1基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱，抗盐或抗寒的植物品种。

本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物对逆境的耐受能力。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID No：1显示的是本发明分离克隆的包含有OsPR4-1基因编码区的DNA片段序列。

图1：OsPR4-1基因分离和鉴定流程图。

图2：本发明超量表达载体的构建

图3：采用ClustalW软件(公开使用软件)将OsPR4-1基因与PR4类基因进行同源性比较结果。

图4：用Northern杂交检测OsPR4-1基因在干旱，高盐，低温和ABA等逆境胁迫不同时间点的表达水平。

图5：OsPR4-1基因在转基因植株中的表达情况，第一道为对照，其余为转基因独立转基因植株。OsPR4-1转基因水稻植株分别命名为S10-N(其中S10为pC1301H-OsPR4-1载体，含有诱导型启动子HVA1，N独立转化植株的编号)，S11-N(S11为pC1301S-OsPR4-1载体，含有组成型启动子CaMV 35S)和S12-N(S12为pC1301A-OsPR4-1载体，含有组成型启动子Actin1)。

图6：抽穗期代表性OsPR4-1超量表达转基因家系在田间干旱胁迫22天后的生长情况。

图7：孕穗期代表性OsPR4-1超量表达转基因家系种植在PVC管中的抗旱表现。

图8：本发明的超量表达载体pCAMBIA1301的结构示意图。将本发明实施实例中用到的启动子(CaMV 35S，Actin1或HVA1)分别插入多克隆位点EcoRI和SacI处，即构成本发明用到的转化载体pC1301S，pC1301A和pC1301H。

具体实施方式

本发明的前期工作获得了来源于水稻品种明恢63(一种中国普遍推广应用的一个水稻品种)的cDNA克隆EI77D14。该cDNA是OsPR4-1基因的cDNA片段，是一个受干旱诱导的病程相关蛋白PR4的同源基因。主要依据有以下几个方面：(1)采用cDNA芯片技术分析发现cDNA克隆EI77D14在水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)干旱胁迫处理15天后表达量增加3.2倍。对其进行测序，分析发现其编码产物与其它PR4蛋白家族成员的序列相似性高达75.2％(图2)，据此将此基因命名为OsPR4-1。(2)对其进行逆境条件下的表达谱分析(图3)，发现在胁迫处理的过程中，表达量有明显的提高。(3)将其全长基因在植株中超量表达(图4)，转基因植株的抗旱能力大大增强(图5，图6)。这些结果都表明OsPR4-1基因不仅是一个新的病程相关蛋白PR4的同源基因，并且可用于提高植物的抗旱能力。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有OsPR4-1基因完整编码区段的DNA片段以及验OsPR4-1基因功能的方法(发明流程如图1所示)。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆包含有OsPR4-1基因区段的DNA片段和OsPR4-1基因

通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高3.2倍)的EST(表达序列签)，经序列分析发现，该基因(OsPR4-1)可能是水稻病程相关蛋白PR4基因家族的一个成员，并且是5’端部分序列。通过查找日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆JO23075A19，并将其定位于第11染色体BAC克隆AC137744上。根据BAC克隆AC137744中OsPR4-1对应的基因组序列，预测其启动子区域，并设计引物PF(5-TAGGTACCGCCCATCTGCAACAGAGAAAGA，序列特异引物外加接头KpnI位点)和FR(5-TAGGATCCGAACTGTAATTTCGTTTATTCA，序列特异引物外外加接头BamHI)，将BAC克隆AC137744的9523-10392bp序列从“中旱5号”品种的总DNA中扩增出来。扩增产物就是本发明的序列1-870bp。具体步骤为：提取水稻品种“中旱5号”叶片中的总DNA(CTAB法抽提，Zhang等，genetic diversity anddifferentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，Theor Appl Genet，83，495-499，1992)作为模板进行扩增，反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序仪)，获得所需的包含有OsPR4-1基因的DNA片段。该克隆命名为pGEM-OsPR4-1。

采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫处理的水稻品种“中旱5号”中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第一链，反应条件为：65℃ 5min，42℃ 50min，70℃ 10min。用上述引物(PF和PR)扩增出OsPR4-1基因的全长cDNA。反应条件为：94℃预变性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因cDNA。该克隆命名为pGEM-OsPR4-1c。

实施例2：检测水稻内源基因OsPR4-1的诱导表达

以水稻品种“中旱5号”为材料，在3叶期分别进行干旱、冷害和高盐胁迫以及ABA处理。干旱处理是用20％的聚乙二醇(商品名为PEG6000，一种)浸泡幼苗根部，0h，2h，4h，8h，12h，24h后取样。冷害处理是将幼苗置于4℃生长箱，0h，12h，24h后取样。高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中并在0h，8h，12h，24h后取样。ABA处理是将幼苗根部浸泡在100μM/LABA溶液中并在0h，0.5h，3h，6h，12h和24h后取样。提取叶片的总RNA(Trizol试剂，Invitrogen)后按《分子克隆》(科学出版社，北京，1999年版)有关实验操作方法进行RNA转膜，并以OsPR4-1为探针做Northern杂交。结果表明，本发明克隆的基因OsPR4-1能被干旱、冷害、高盐和ABA诱导表达(如图3所示)，是一个逆境反应相关的基因。

实施例3，OsPR4-1基因超量表达载体的构建和转化

根据实施例2的结果，知道本发明基因OsPR4-1是能被干旱、冷害、高盐和ABA诱导表达的，为了能更好地阐明此基因的功能，发明人将其在水稻中超量表达，从转基因植株的表型来验证。方法是：首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-OsPR4-1质粒用BamHI和KpnI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带不同启动子的遗传转化载体pC1301S，pC1301A和pC1301H。酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsPR4-1基因的酶切片段和酶切后的载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体。这三个不同启动子的遗传转化载体都是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(图7，来自澳大利亚CAMBIA[Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture]实验室)基础上改建的，分别携带有广泛使用的组成型表达的CaMV 35S启动子和水稻Actin1启动子以及一个逆境诱导型启动子HVA1(Xu等，Expression of a LateEmbryogenesis Abundant Protein Gene，HVA1，from Barley Confers Tolerance to Water Deficit and Salt Stress inTransgenic Rice.Plant Physiol.1996；110：249-257，1996)。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系应用Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficienttransformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA，PlantJ，6：271-282，1994)进行。组培中所用的培养基配方如下：

(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(激动素或称细胞分裂素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2、4-二氯苯氧乙酸)；As(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)

(2)主要溶液配方：

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

硝酸钾(KNO₃)            28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)      4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)       4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)     1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)     1.66g

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

碘化钾(KI)              0.08g

硼酸(H₃BO₃)             0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)     0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)     0.15g

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

烟酸(Nicotinic acid)         0.1g

维生素B1(Thiamine HCl)       0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl)     0.1g

甘氨酸(Glycine)              0.2g

肌醇(Inositol)               10g

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

硝酸铵(NH₄NO₃)        16.5g

硝酸钾                19.0g

磷酸二氢钾            1.7g

硫酸镁                3.7g

氯化钙                4.4g

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

碘化钾                0.083g

硼酸                  0.62g

硫酸锰                0.86g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O) 0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)   0.0025g

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml。

8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。

9)AS贮存液的配制：秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(10X)          100ml

N6mix母液(100X)         10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)    10ml

维生素贮存液(100X)      10ml

2，4-D贮存液            2.5ml

脯氨酸(Proline)         0.3g

CH                      0.6g

蔗糖(Sucrose)           30g

Phytagel                3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

N6max母液(10X)       100ml

N6mix母液(100X)      10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 10ml

维生素贮存液(100X)   10ml

2，4-D贮存液         2.0ml

脯氨酸               0.5g

CH                   0.6g

蔗糖                 30g

Phytagel             3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X)       12.5ml

N6mix母液(100X)      1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X)   2.5ml

2，4-D贮存液         0.75ml

CH                   0.15g

蔗糖                 5g

琼脂粉(Agarose)      1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X)         12.5ml

N6mix母液(100X)        1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)   2.5ml

维生素贮存液(100X)     2.5ml

2，4-D贮存液           0.75ml

CH                     0.2g

蔗糖                   5g

琼脂粉                 1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X)         5ml

N6mix母液(100X)        0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)   0.5ml

维生素贮存液(100X)     1ml

2，4-D贮存液           0.2ml

CH                     0.08g

蔗糖            2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X)       25ml

N6mix母液(100X)      2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 2.5ml

维生素贮存液(100X)   2.5ml

2，4-D贮存液         0.625ml

CH                   0.15g

蔗糖                 7.5g

琼脂粉               1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μlHN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X)          25ml

N6mix母液(100X)         2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)    2.5ml

维生素贮存液(100X)      2.5ml

6-BA贮存液              0.5ml

KT贮存液                0.5ml

NAA贮存液               50μl

IAA贮存液               50μl

CH                      0.15g

蔗糖                    7.5g

琼脂粉                  1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X)           100ml

N6mix母液(100X)          10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)     10ml

维生素贮存液(100X)       10ml

6-BA贮存液               2ml

KT贮存液                 2ml

NAA贮存液                0.2ml

IAA贮存液           0.2ml

CH                  1g

蔗糖                30g

Phytagel            3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X)       50ml

MSmix母液(100X)      5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X) 5ml

维生素贮存液(100X)   5ml

蔗糖                 30g

Phytagel             3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

将不同启动子控制的OsPR4-1转基因水稻植株分别命名为S10-N(其中S10为pC1301H-OsPR4-1载体，含有诱导型启动子HVA1，N独立转化植株的编号)，S11-N(S11为pC1301S-OsPR4-1载体，含有组成型启动子CaMV 35S)和S12-N(S12为pC1301A-OsPR4-1载体，含有组成型启动子Actin1)。每个转化载体获得了至少80株独立的转基因水稻植株，本发明总共获得独立转基因水稻植株276株。

实施例4：OsPR4-1基因转基因T1家系在田间的干旱筛选

为了验证转基因水稻植株的抗旱性是否增强以及是否与转入的OsPR4-1基因有关，本发明采用Northern杂交技术对部分转基因水稻植株中OsPR4-1基因的表达进行检测(图4为Northern杂交(方法同实施例2)的结果，并对本发明T1代植株进行了田间抗旱筛选。具体步骤如下：T1代各家系的种子在含有潮霉素的水溶液(50mg/ml)浸种，去除不发芽种子，秧田播种，5叶期插秧苗于抗旱大棚沙田中，每家系种植20单株，分两行，每个转化载体选30个独立家系进行试验，每隔5个家系种植一份对照(20单株，分两行)。到成株期抽穗前3周断水，图5是断水22天后，代表性转基因植株和对照(水稻品种中花11)在田间的干旱筛选情况。

实验表明，转基因植株的抗旱性明显高于对照植株，说明OsPR4-1基因的确与干旱相关，其超量表达能提高转基因植物的抗旱性。为了更充分说明本发明基因能提高植物抗旱性，发明人还分析了干旱胁迫后转基因家系的结实率(每个家系考查16个株，每株考查所有有效穗)。从表1的数据(仅列出有转基因表达的家系)可以看出，80％以上的转基因植株的结实率(T1家系的平均值)比相邻对照的结实率要高出6.3％-29％，而分蘖数和千粒重并没有明显差异，从另一面说明转基因水稻植株的抗旱性增强确实与转入的OsPR4-1基因有关。比较三个启动子的转基因植株的抗旱效果发现这三个启动子不存在明显差异。

表1-1  干旱胁迫后转基因家系(诱导型启动子)和对照的结实率比较

家系	T-DNA拷贝数	转基因干旱诱导表达量(Northern分析)	T1家系的单株平均结实率(％)	与相邻对照的结实率差值(％)
					S10-11S10-12S10-13S10-14S10-15S10-18S10-20S10-21S10-22S10-23S10-24S10-25S10-26S10-27S10-28S10-29S10-80S10-81S10-85S10-89S10-91S10-93	231412131214212223113-	高中高低高中中中高高高低高中中高中低高高低中	51.445.161.238.445.739.442.748.657.456.254.649.358.654.648.361.534.734.842.151.352.748.5	19.212.929.06.213.5-1.61.17.015.814.613.07.722.418.412.125.31.61.79.018.219.615.4

表1-2  干旱胁迫后转基因家系(35S启动子)和对照的结实率比较

家系	T-DNA拷贝数	转基因表达量(Northern分析)	T1家系的单株平均结实率(％)	与相邻对照的结实率差值(％)
					S11-1S11-2S11-3S11-4S11-5S11-6S11-7S11-8S11-9S11-10S11-11S11-12S11-13S11-14S11-15S11-16S11-17S11-18S11-19S11-24	11321353121122213234	高高中高高中低高中高高低中高高高高中低中	68.772.460.470.165.456.552.763.158.660.778.569.463.871.265.471.562.556.358.467.1	16.420.18.117.813.14.20.410.86.38.422.213.17.514.99.115.214.48.210.319

表1-3  干旱胁迫后转基因家系(Actin1启动子)和对照的结实率比较

家系	T-DNA拷贝数	转基因表达量(Northern分析)	T1家系的单株平均结实率(％)	与相邻对照的结实率差值(％)
					S12-1S12-2S12-3S12-4S12-5S12-6S12-7S12-9S12-10S12-11S12-20S12-21S12-23S12-24S12-25S12-26S12-27S12-29S12-30S12-32S12-33S12-34	2122512343214321123442	高高高高中高高高中高中高低中高高高高中中低高	75.481.276.374.575.675.269.474.556.367.361.068.562.265.474.178.276.475.170.859.756.465.4	17.323.118.216.417.520.915.120.22132.610.13.8715.719.81817.913.62.5-0.88.2

实施例5：OsPR4-1基因转基因T1家系在PVC管中种植条件的耐旱表现

大田条件下干旱试验得到的是植株抗旱的综合表现，而对于抗旱的两种重要机制却无法区分，即耐旱性(Drought tolerance)和避旱性(Drought avoidance)。为了验证转基因水稻植株的抗旱性是否是由于耐旱性增强还是由于避旱性增强引起，本发明进一步利用PVC管进行了盆栽干旱处理试验。具体步骤如下：T1代各家系的种子在含有潮霉素的水溶液(50mg/ml)浸种，去除不发芽种子，将发芽后1-2cm幼苗小心地直接种在PVC管中；PVC管高1米，直径20cm，置于地面的一端封口不漏水，管侧有三个小孔，离封口端的距离分别为10cm，40cm和70cm；不放水时用橡皮塞塞住；管内用与管径相同大小的塑料袋装满混合均匀的沙性土(河沙与细粘土按1∶1混合)；每管种植一株水稻植株，每T1家系种植16个单株。在离抽穗大约10天时断水(拔出橡皮塞并戳破塑料袋)，图6是断水5天后代表性转基因植株和对照在的抗旱表现，转基因植株的抗旱性明显高于对照植株。每个植株都被胁迫到肉眼观察得到的相同程度(即在下午5-6点观察，单株所有叶片完全卷拢)后，次日早上复水让其生长至成熟后考察结实率。由于转基因植株和对照的抽穗期相同，按单株进行相同程度的干旱胁迫实验可以把避旱性(受植株大小，根的深度，生育期长短等影响)对抗旱的贡献排除掉而较准确地估计耐旱性的贡献。成熟后考查转基因家系的结实率(考查方法同实施例4)、分蘖数和最大根长。数据表明，86％转基因植株的结实率比对照高出6.1％到25.9％(表2)，而分蘖数和最大根长并没有显著差异，说明转基因水稻植株的抗旱性增强主要是由于超量表达OsPR4-1基因后耐旱能力增强引起的。

表2-1  PVC管种植转基因家系(诱导型启动子)和对照的耐旱性比较

家系	T1家系的单株平均结实率(％)	与对照的结实率差值(％)	有效分蘖数	最大根长(cm)
					CKS10-11S10-12S10-13S10-14S10-15S10-18S10-20S10-21S10-22S10-23S10-24S10-25S10-26S10-27S10-28S10-29S10-80S10-81S10-85S10-89S10-91S10-93	56.665.448.171.252.148.550.149.448.668.476.278.356.178.674.168.281.554.746.354.259.272.758.4	08.8-8.514.6-4.5-8.1-6.5-7.2-811.819.621.7-0.52217.511.624.9-1.9-10.3-2.42.616.11.8	16.415.215.514.717.318.214.715.817.218.614.815.315.716.516.016.818.220.119.818.217.416.315.8	72.475.865.869.267.465.266.762.868.565.466.170.170.372.165.467.469.566.862.759.764.265.268.4

表2-2  PVC管种植转基因家系(35S启动子)和对照的耐旱性比较

家系	T1家系的单株平均结实率(％)	与对照的结实率差值(％)	有效分蘖数	最大根长(cm)
					CKS11-1S11-2S11-3S11-4S11-5S11-6S11-7S11-8S11-9S11-10S11-11S11-12S11-13S11-14S11-15S11-16S11-17S11-18S11-19S11-24	56.669.776.452.768.565.955.244.753.259.270.276.868.448.761.865.481.582.566.348.477.5	013.119.8-3.911.99.3-1.4-11.9-3.42.613.620.211.8-7.95.28.824.925.99.7-8.220.9	16.415.814.916.517.218.219.419.8.121.018.618.418.618.217.116.918.415.716.717.618.215.9	72.474.271.270.874.172.768.566.964.874.168.265.465.369.368.970.873.766.873.270.974.8

表2-3  PVC管种植转基因家系(Actin1启动子)和对照的耐旱性比较

家系	T1家系的单株平均结实率(％)	与对照的结实率差值(％)	有效分蘖数	最大根长(cm)
					CKS12-1S12-2S12-3S12-4S12-5S12-6S12-7S12-9S12-10S12-11S12-20S12-21S12-23S12-24S12-25S12-26S12-27S12-29S12-30S12-32S12-33S12-34	56.681.078.368.267.579.175.468.174.058.462.758.265.853.856.972.881.277.368.772.654.548.972.6	024.421.711.610.922.518.811.517.41.86.11.69.2-2.80.316.224.620.712.116-2.1-7.716	16.418.514.816.318.217.216.916.514.916.216.516.718.318.216.715.916.818.017.614.816.517.616.3	72.470.670.576.274.273.768.566.868.468.169.368.670.672.374.170.869.573.268.774.270.868.472.8

                         序列表

                   SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学

<120>利用水稻病程相关基因OsPR4-1提高植物抗旱能力

<130>

<141>2005-10-14

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>870

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(870)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(495)..(579)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(81)..(209)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(580)..(747)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(222)..(494)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(580)..(870)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(210)..(494)

<223>

<400>1

gcccatctgc aacagagaaa gattgtgcca cagtacaaac tacctcattc tccatcaggt    60

gcacaataga agaaactaag gtaagcacta cattggcacc cattcaccca agatccctat    120

ttctctcttc caaatcttcc tctagcatga agataagatt gtacttatga taacgaatta    180

tctttttatt tatacacatg aatatttag att ctc aag gtg atg gcg ggg atc      233

                                                Met Ala Gly Ile

                                                 1

acc gga tct cga gca ctc atg gtg gtg gcg ctc ctc tgc gct gcc gtg      281

Thr Gly Ser Arg Ala Leu Met Val Val Ala Leu Leu Cys Ala Ala Val

 5                  10                  15                  20

gcc atg act gct gca caa gaa gca tcc tac gtg cga gcc aca tat cat      329

Ala Met Thr Ala Ala Gln Glu Ala Ser Tyr Val Arg Ala Thr Tyr His

                25                  30                  35

tac tac aac cca caa cag aac aat tgg gac ctg aac aaa gtg agc gca      377

Tyr Tyr Asn Pro Gln Gln Asn Asn Trp Asp Leu Asn Lys Val Ser Ala

            40                  45                  50

tat tgt gcc aca tgg gat gcc aac aaa cca ttg tct tgg cgc cag aag      425

Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ala Asn Lys Pro Leu Ser Trp Arg Gln Lys

        55                  60                  65

tat gga tgg acc gcc ttc tgt gga cct gct ggt cct agg ggc cga gac      473

Tyr Gly Trp Thr Ala Phe Cys Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Arg Asp

    70                  75                  80

tcg tgt ggc aag tgt atc cag gtattaaaat tttcttcaca ttgacaaccg         524

Ser Cys Gly Lys Cys Ile Gln

 85                 90

atttgtactt caacattaaa ctgagtcgct taaggatggt gtgctaaatt tgtag gtg     582

                                                             Val

aag aac cgg gga aca ggt gcg aca ata att gcg agg att gtt gac caa      630

Lys Asn Arg Gly Thr Gly Ala Thr Ile Ile Ala Arg Ile Val Asp Gln

        95                  100                 105

tgc agc aat ggt ggg ttg gat ctg gac tac gag acc atc ttc aag aag    678

Cys Ser Asn Gly Gly Leu Asp Leu Asp Tyr Glu Thr Ile Phe Lys Lys

    110                 115                 120

atc gac aca gat ggt cgt ggc tac cag atg ggt cac ctc cag gtc gat    726

Ile Asp Thr Asp Gly Arg Gly Tyr Gln Met Gly His Leu Gln Val Asp

125                 130                 135                 140

tac aag ttc gtc aat tgt tga ttt ggt cat gcc tct ttg cat gat cat    774

Tyr Lys Phe Val Asn Cys

                    146

ata ctg gaa taa gaa ata tat ggt gtt ata caa taa gat gga aga ggt    822

tgg cac tct gta atc atg ctg aat aat gaa taa acg aaa tta cag ttc    870

<210>2

<211>146

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ala Gly Ile Thr Gly Ser Arg Ala Leu Met Val Val Ala Leu Leu Cys Ala Ala Val

 1               5                  10                15                  20

Ala Met Thr Ala Ala Gln Glu Ala Ser Tyr Val Arg Ala Thr Tyr His Tyr Tyr Asn Pro

                 25                 30                35                  40

Gln Gln Asn Asn Trp Asp Leu Asn Lys Val Ser Ala Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ala Asn

                 45                 50                55                  60

Lys Pro Leu Ser Trp Arg Gln Lys Tyr Gly Trp Thr Ala Phe Cys Gly Pro Ala Gly Pro

                  65                 70                 75                80

Arg Gly Arg Asp Ser Cys Gly Lys Cys Ile Gln Val Lys Asn Arg Gly Thr Gly Ala Thr

                85                 90                  95                100

Ile Ile Ala Arg Ile Val Asp Gln Cys Ser Asn Gly Gly Leu Asp Leu Asp Tyr Glu Thr

                105                110                115                120

Ile Phe Lys Lys Ile Asp Thr Asp Gly Arg Gly Tyr Gln Met Gly His Leu Gln Val Asp

               125         130           135            140

Tyr Lys Phe Val Asn Cys

                    146

Claims (5)

1、OsPR4-1基因介导的赋予植物对干旱胁迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO：1中第1-870位所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

2、合适启动子连接的权利要求1所述的DNA序列。

3、权利要求2所述的DNA序列，它是SEQID NO：1所示的DNA序列

4、赋予植物对干旱胁迫耐受能力的DNA序列，它是与SEQ ID NO：1中第1-870位所示DNA序列相似性在95％以上的同源DNA序列。

5、权利要求1-4任一项所述的DNA序列在增加水稻对干旱胁迫耐受能力中的应用。

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