CN102732526A - OsSRO1c基因在控制水稻抗旱性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高干旱耐受能力的水稻OsSRO1c基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用筛选T-DNA插入水稻突变体库的方法，克隆到控制水稻抗旱基因OsSRO1c，通过表达量检测和干旱胁迫表型鉴定表明该突变体与干旱敏感表型是共分离的。超量表达OsSRO1c基因能提高转基因水稻抗干旱的能力，证实了该基因的功能及应用途径。

Description

OsSRO1c基因在控制水稻抗旱性中的应用
技术领域
本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高干旱耐受能力的水稻OsSRO1c基因在水稻抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用候选基因筛选方法，克隆到控制水稻抗旱基因OsSRO1c，通过共分离检测表明OsSRO1c突变体与干旱敏感表型是紧密关联的，超量表达OsSRO1c基因，可以提高转基因水稻抗干旱的能力，证实了该基因的功能及应用途径。
背景技术
植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、冷害和高温会导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。培育耐逆性的作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了抵抗或适应这些不利的因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong等，Cell signaling during cold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到了调控因子的精细调节。转录因子作为一种调控基因，当生物体感受逆境胁迫时，能调控一系列下游基因的表达，从而增强植物体对逆境的耐受能力，达到抵抗不良环境条件胁迫的效果。大多数类型的转录因子都参与了植物的非生物逆境应答反应，包括AP2/EREBP，bZip、HD-ZIP、MYB、MYC、NAC和Zinc finger类转录因子(Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.Transcriptional regulatory networks in cellularresponses and tolerance to dehydration and cold stresses.Annu Rev Plant Biol，2006，57：781-803)。通过基因工程，部分逆境应答转录因子已经成功应用于水稻抗逆遗传育种。利用SNAC1培育的转基因水稻植株在大田干旱环境下能提高结实率30％左右，而在正常条件下产量不受影响且没有其他表型变化。转基因植株在营养生长期对干旱和高盐的抗性也显著提高(Hu等.Overexpressing aNAM，ATAF，and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerancein rice.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103：12987-12992)。这些抗逆转录因子是通过调控大量下游基因的表达来体现其功能。这些下游基因中往往含有参与信号转导和基因表达的调控蛋白，它们又进一步形成次级的调控网络。这些下游基因同样可以用于作物抗逆境的遗传改良。拟南芥中抗高温转录因子DREB2A的下游基因HsfA3同样可以提高转基因超表达植株对高温的抗性(Yoshida等.Functional analysis of an Arabidopsis heat-shock transcription factor HsfA3 in thetranscriptional cascade downstream of the DREB2A stress-regulatory system.Biochem BiophysRes Commun，2008，368：515-21)。
SRO(SIMILAR-TO-RCD-ONE)蛋白家族是最近鉴定的一类植物特有的蛋白，所有家族成员都含有多聚ADP核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase catalytic domain，PARP)结构域和RST(RCD1-SRO-TAF4)结构域。对拟南芥SRO蛋白RCD1的研究表明，该家族成员参与了氧化胁迫和高盐胁迫应答，参与了脱落酸，茉莉酸和乙烯的信号转导，同时也影响叶形和开花期等发育相关表型(Ahlfors R等.Arabidopsis RADICAL-INDUCED CELL DEATH1 belongs to the WWE protein-proteininteraction domain protein family and modulates abscisic acid，ethylene，and methyl jasmonateresponses.Plant Cell，2004，16：1925-1937)。RCD1与众多的转录因子相互作用，影响了众多转录因子下游基因的表达，从而产生了丰富的表型(Jaspers等.Unequally redundant RCD1 and SRO1mediate stress and developmental responses and interact with transcription factors.PlantJ，2009，60：268-279)。SRO家族在水稻中有5个成员，目前没有相关功能研究的报导。本发明涉及的OsSRO1c基因是水稻中SRO家族成员之一，而且也是受SNAC1调控的下游靶基因。
水稻是重要的粮食作物和模式植物，在极端气候条件频发的今天，培育抗逆性增强的水稻具有重要的意义。鉴于OsSRO1c基因是抗旱转录因子SNAC1的下游基因，是否能提高水稻的抗逆性目前尚无相关报道。因此，从水稻中分离出OsSRO1c基因，并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的涉及一个SRO蛋白家族成员OsSRO1c基因在控制水稻抗旱性改良中的应用。在SNAC1超表达植株上升表达的基因中挑选候选基因中，因为其中一个基因属于SRO蛋白家族，申请人将该基因命名为OsSRO1c。本发明分离和应用一种包含OsSRO1c基因的DNA片段，该片段赋予水稻在干旱条件下抗旱性增强的能力。其中，所述的含有OsSRO1c基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示，序列长度为1550bp，它对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列为463个。它的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。
携带有本发明OsSRO1c基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant MolecularBiology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，PlantMolecular Biology(2nd Edition)。
可使用包括本发明的OsSRO1c基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱植物品种。
本发明基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导表达基因，提高植物抗旱性。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的包含有OsSRO1c基因编码区的核苷酸序列，序列长度为1550bp，它对应的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列为463个。
图1.OsSRO1c基因在多种逆境和激素处理下的表达情况。各处理样品为：干旱(drought)处理0d，3d，5d，7d；高盐(salt)处理0h，3h，6h，12h；低温(cold)处理0h，6h，12h，24h；高温(heat)处理0min，10min，30min，2h；紫外线(UV-C)处理0h，3h，6h，12h；伤害(wound)处理0h，1h，3h，6h；氧化胁迫(H2O2)处理0h，2h，6h，12h；淹水胁迫(submerge)处理0h，6h，24h，72h。激素处理：脱落酸(ABA)，油菜素内酯(BR)，吲哚乙酸(IAA)，细胞分裂素(KT)，赤霉素(GA)，茉莉酸(JA)，水杨酸(SA)和乙烯利(ETH)处理0h，2h，6h，12h。
图2.OsSRO1c突变体中OsSRO1c基因的表达情况。两个短红色线(a，b)表示2个是位于T-DNA插入位点的两侧的引物所对应的位点。WT为转基因家系分离出的阴性对照，osrso1为T-DNA插入突变体。
图3.水稻ossro1c突变体苗期干旱胁迫表型。ossro1c#1，#2，#3为3个T-DNA插入突变体家系。WT#1，#2，#3为杂合突变体分离出的3个阴性家系。
图4.水稻ossro1c突变体苗期干旱胁迫后存活率的统计结果。ossro1c#1，#2，#3为3个突变体家系。WT#1，#2，#3为杂合突变体分离出的3个阴性家系。
图5.水稻ossro1c突变体成株期大田干旱胁迫表型。ossro1c为纯合突变体，WT为分离出的阴性家系。
图6.水稻ossro1c突变体成株期大田干旱胁迫后生物量统计结果。ossro1c为纯合突变体，WT为分离出的阴性家系。
图7.OsSRO1c-OX超表达植株中OsSRO1c基因的表达情况。中花11(ZH11)为野生型家系。
图8.OsSRO1c-OX超表达植株渗透胁迫表型。OsSRO1c-OX-1，-11，-14为3个独立超量表达转基因T1代家系，中花11(ZH11)为野生型家系。
图9.OsSRO1c-OX超表达植株渗透胁迫后株高的统计结果。OsSRO1c-OX-1，-11，-14为3个独立超量表达转基因T1代家系，中花11(ZH11)为野生型家系。
具体实施方式
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离OsSRO1c T-DNA插入突变体，克隆包含有OsSRO1c基因完整编码区段的DNA片段，以及验证OsSRO1c基因功能的方法。根据以下的描述的全部或部分实施步骤，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
1、检测水稻内源OsSRO1c基因受逆境诱导水平
为初步判断OsSRO1c基因是否与抗逆相关，本发明首先检测了水稻内源基因OsSRO1c是否受逆境诱导。申请人选用籼稻品种“中花11号”(简称ZH11，来自中国农业科学院作物研究所商业品种)作为表达谱分析的材料。生长至4叶期幼苗进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是不浇水让其自然干燥，0d，3d，5d，7d后取样；高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200mM NaCl的溶液，0h，3h，6h，12h后取样；低温胁迫是将幼苗放入4℃人工气候室，0h，6h，12h，24h后取样。高温胁迫是将幼苗放入42℃人工气候室，0min，10min，30min，2h后取样。紫外线处理是将幼苗置于紫外灯下，0h，3h，6h，12b后取样。伤害处理是用镊子对幼苗进行机械损伤，0h，1h，3h，6h后取样。氧化胁迫是将幼苗根部浸泡在1％H2O2溶液中，0h，2h，6h，12h后取样。淹水胁迫是将幼苗置于装满水的四面透光容器内，0h，6h，24h，72h后取样。激素处理是用100μM的脱落酸(ABA)，油菜素内酯(BR)，吲哚乙酸(IAA)，细胞分裂素(KT)，赤霉素(GA)，茉莉酸(JA)，水杨酸(SA)和200μM乙烯利(ETH)分别均匀的喷洒水稻植株表面后并加到幼苗根部，0h，2h，6h，12h后取样。总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSIII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃5min，50℃120min，70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(OsSRO1c-2F：5’-CTCCCACATCGGCGACA-3’和OsSRO1c-2R：5’-ACCTTGCACTAGTACCCTCGGA-3’)对OsSRO1c基因进行特异的PCR扩增。同时用引物(AF：5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和AR：5’-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actin1基因(登录号：X16280)做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：95℃10sec；95℃5sec，60℃34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明，OsSRO1c基因(SEQ NO：1)在干旱，高盐，低温，高温，紫外线，伤害，氧化胁迫后诱导上升表达，在涝害胁迫中下降表达。OsSRO1c基因受ABA，BR，IAA，KT，GA和JA多种激素诱导上升表达。
2、分离OsSRO1c基因突变体
为了鉴定OsSRO1c基因是否具有抗逆功能，获得该突变体是关键的一步。从水稻突变体库RiceT-DNA Insertion Sequence Database(RISD)中挑取OsSRO1c基因位点相应的T-DNA插入突变体3A-05508(本发明的起始材料即突变体3A-05508，检索地址：http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE，韩国POSTECH植物功能基因组实验室(Plant FunctionalGenomics Laboratory)。产生这个突变体株系的载体的构建和遗传转化方法可参照相关文献(Jeong等.Generation of a flanking sequence-tag database for activation-tagging lines in japonicarice.Plant J.2006，45：123-32.)，限于篇幅本说明书不再展开描述。其中在上述网站突变体库中所登录的OsSRO1c T-DNA突变体3A-05508的侧翼序列(该序列长度为901bp)如下：NATCNNNGAGGGNNANANCGGGACNGCATATNACCTGCATATACCTGTNAGAATTTAGCACCCCAGGTTAGCCNTGTANTTGGCCACATAGCNGAAAAAATAGCACCGCGGNANTAAGAATGGNNCTCACCTGGTACCTGGTACCTCGGATCCGTGTTTGAGAGTTGTTTGTTTCTCTGGATTATTAGAGGCATCTAAGGGTAGTGGGTCTTTAGCTACTCAATAATCTAGAAAAAGCTTCTCTNGAGGAGATTATTAGATTATAGTAATCTAAGCTCCTCTNGAGGAGATTATTATATTATAGTAATCTGGCTTATAAATTATAATAATCTAACATAATAATCTACTTATTTGTTTCAGCTTAATCCTAATAATCCAGATTATAATAATCCTAAGCTGAATTAAACAGGGCCTAAATTCACCTAGCAGATCAGCAGTTGTGNTTCAGCCCATTGTTTCGCTTTTACTTATCCAAACAATTTATTAACCAAAAAAAGGTATAGTAAAACCTTTTTTATACGTGTTCATGCGGTAAAATAAACNACTAANAAAACCACAAAATCAACTCTTATATTAAATTTTGACTTACAGGCATGATCATANGCGCGAAGGGGTTGTTTTGTGTAAGCCAGCGCAAGATTCTNATCAATCATCTNTCTNGAATGAAATGCTCAGCAAGAAGTACCGTTTACCTTGAAGCAGTTGTNCNTCCTCTGCAAAGTCTGCNGCCGGTNGCGGGGCCATGGAAAGNCAANANACNGCCGNCTGNTTGAAACCCCAACCAACGTTCTNTGAAACCCCANCCAANTTTTNTNNAANCCCAACCACTTCNGGNGGNNCCNGTTCNNTNNACGGGGGGGNNGANNCATTAAGAGGGGGNNGGGNNTTNAAGGGGGGGGGN(注：N表示测序不确定核苷酸)。
根据T-DNA插入位点，分别在插入位点两侧设计引物，对突变体中OsSRO1c基因的表达量进行检测。用引物(OsSRO1c-1F：5’-TCCCTATGCTTCTGACGGAGAT-3’和OsSRO1c-1R：5’-CAGTTGTACGTCCTCTGCAAAGTC-3’)及(OsSRO1c-2F：5′-CTCCCACATCGGCGACA-3’和OsSRO1c-2R：5’-ACCTTGCACTAGTACCCTCGGA-3’)对OsSRO1c基因进行特异的PCR扩增。同时用引物(AF：5’-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’和AR：5’-TGCACAAT GGATGGGTCAGA-3’)对水稻Actin1基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：95℃10sec；95℃5sec，60℃34sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。对插入位点两侧的表达量检测结果显示，在OsSRO1c T-DNA插入纯合突变体中，OsSRO1c基因的表达显著低于分离出的阴性对照(图2)，说明突变体中OsSRO1c基因被显著抑制。
3、鉴定突变体干旱胁迫表型
将已鉴定好基因型的纯合突变体(OsSRO1c)和野生型家系(WT)催芽后直播到小圆桶中。试验用的土壤为中国南方水稻土与粗沙按体积比为2∶3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致，试验设3次重复。对健康生长的4叶期的植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复5-7天，拍照并调查植株的存活率。与野生型对照相比，T-DNA纯合植株表现为干旱敏感表型，
为了验证该突变体与干旱表型共分离情况，将T1代杂合单株收获的种子播种得到T2代纯合和阴性种子繁殖成家系。随机选取3个纯合突变体家系(OsSRO1c#1，#2，#3)和3个分离出的野生型家系(WT#1，#2，#3)，同样进行上述胁迫实验，结果纯合突变体较阴性对照对干旱敏感(图3)。复水后，纯合家系存活率低于30％，而野生型家系仍有60％以上的存活率(图4)。该试验设3次生物学重复，结果一致。说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。
为了鉴定突变体成株期的表型将突变体及其对照种植于上面有可移动遮雨棚的沙土大田中南方水稻土与粗沙按体积比为1∶2混合而成，每行10株每家系种植2行，试验设3次生物学重复做严重干旱胁迫实验。干旱胁迫是对健康生长的成株期植株进行断水15-20天(具体根据天气情况而定，雨天有可移动遮雨棚覆盖)。再复水生长。与杂合家系分离出的阴型对照相比，纯合突变体植株卷叶更快表现为干旱敏感表型(图5)，收割地上部分称量地上部分生物量，发现成株期突变体干旱胁迫条件下地上部分生物量(图6)显著低于对照。
4、OsSRO1c基因超量表达载体的构建和遗传转化
为了能更好的确认OsSRO1c基因的抗逆功能，申请人将其在水稻中超量表达，期望从转基因植株的表型来研究该基因的功能。
超量表达载体构建方法如下：首先通过查找在水稻基因组注释网站RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)OsSRO1c基因注释号：LOC_OsO3g12820，与KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)OsSRO1c注释号：AK102303，预测为一个SRO家族基因(该基因的完整核苷酸序列见SEQ ID NO：1所示，其编码区核苷酸长度为1392bp，核苷酸序列对应的氨基酸序列为463个)，以此为参考设计引物。在籼稻全长cDNA文库数据库(http://www.ncgr.ac.cn/ricd)中检索到一个含有OsSRO1c基因编码区5’部分序列的cDNA克隆(登录号：CT857428)。以此克隆为模板，用引物OSSRO1CFLF(5’-CAGGGTACCGGGAGGGGTGATGGAC-3’，序列特异引物外加接头KpnI位点)和OSSRO1CFLR(5’-CAGGGTACCACTATGACCGAACTCAAGAAT-3’，序列特异引物外加接头KpnI位点)，扩增出包含OsSRO1c基因完整编码区的cDNA片断，本扩增产物就是本发明的序列1-1550bp。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃90sec，33个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，见《遗传资源来源披露登记表》)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆命名为PGEM-OsSRO1c。阳性克隆PGEM-OsSRO1c质粒用KpnI酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pCAMBIA1301U(pCAMBIA1301U是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体)，酶切完毕，用氯仿：异戊醇(体积比为24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含OsSRO1c基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA1301U载体做连接反应，其后转化大肠杆菌DH10β(该大肠杆菌DH10β菌株购自Promega公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为OsSRO1c-OX-p1301U(载体上的OsSRO1c基因序列就是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，序列长度为1550bp)。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述超表达载体OsSRO1c-OX-p1301U转入到水稻品种“中花11”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻(中花11)遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativaL.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，PlantJ，6：271-282，1994)基础上改良进行。
本实施例的具体遗传转化步骤如下：
(1)电转化：将最终超表达目标载体OsSRO1c-OX-p1301U，用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。
(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的水稻品种)去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的超表达载体OsSRO1c-OX-p1301U)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28℃摇床上培养2-3小时。
(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20℃。
(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm)。
(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照(3500lux)下培养，温度26℃。
(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
(10)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
培养基组分及其配方：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-苄基腺嘌呤)；CN(羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方：
1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：
Figure BSA00000465987900071
逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。
2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(I00X)]的配制
Figure BSA00000465987900072
Figure BSA00000465987900081
室温下溶解并定容至1000ml。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制
准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素贮存液(100X)配制
Figure BSA00000465987900082
加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制
Figure BSA00000465987900083
室温下溶解并定容至1000ml。
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
Figure BSA00000465987900084
室温下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml。
8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。
9)AS贮存液的配制：称取AS 0.392g，DMSO 10ml。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)愈伤组织诱导培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
Figure BSA00000465987900092
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基
Figure BSA00000465987900093
Figure BSA00000465987900101
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
Figure BSA00000465987900102
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基
Figure BSA00000465987900103
加蒸馏水至100ml，调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
Figure BSA00000465987900112
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
Figure BSA00000465987900113
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
Figure BSA00000465987900121
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
5、OsSRO1c超量表达转基因水稻耐渗透胁迫下的生长状况
本发明采用荧光检测实时定量的方法对对上述第4步获得的转基因水稻植株中OsSRO1c基因的表达进行检测。RNA的提取，反转录和荧光实时定量PCR的具体步骤同实施实例第1部分。图7为表达量检测结果。结果显示，大部分转基因植株中OsSRO1c基因的表达量相对于野生型显著提高。
本实施例选取了转OsSRO1c基因(序列见序列表SEQ NO：1)的超量表达的3个T1家系(编号为OsSRO1c-OX-1，-11，-14)，用甘露醇处理模拟干旱产生的渗透胁迫测定转基因水稻的抗旱能力。具体步骤如下：将超量表达转基因家系(OsSRO1c-OX-1，-11，-14)种子去壳消毒(浓度为70％酒精处理1min，0.15％氯化汞处理10min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，中花11(ZH11)家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有或不含200mM甘露醇的1/2MS培养基中继续生长。10天后拍照并调查植株的株高(图8)。因为在不含甘露醇培养基上超量表达植株与对照的长势不一致，用相对株高(甘露醇培养基上生长植株的株高除以正常培养基上生长植株的株高)来衡量植株对渗透胁迫的抗性。超量表达植株的相对株高约为野生型的2倍(图9)，该试验每个家系设3次生物学重复，结果一致。说明超表达OsSRO1c基因的确提高了转基因植株抗干旱的能力。
Figure ISA00000465988100011
Figure ISA00000465988100021
Figure ISA00000465988100031
Figure ISA00000465988100041
Figure ISA00000465988100051

Claims (2)

1.一种控制水稻抗旱性的基因OsSRO1c在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.一种控制水稻抗旱性的基因OsSRO1c在水稻抗旱性遗传改良中的应用，其特征在于该基因的编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
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