CN102719433B - osa-MIR167a基因在调控水稻株型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种调控水稻株型基因osa-MIR167a的应用。osa-MIR167a基因在水稻基因组中有多个同源基因，与拟南芥ath-MIR167基因属于同一基因家族MIR167。osa-MIR167a基因具有调控水稻株型的功能，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，转录剪切后形成的核心序列如序列表SEQ ID NO：3所示。通过基因工程技术改变osa-MIR167a基因或osa-MIR167基因家族其他成员的表达模式，调控植物分蘖角度、株高以及有效分蘖数，从而形成理想株型，达到增产的目的。本发明揭示了该基因在调控水稻株型方面的应用。

Description

osa-MIR167a基因在调控水稻株型中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种调控水稻株型的基因osa-MIR167a，同时涉及该基因在转基因水稻和转基因水稻种子中的应用。本发明通过超量表达osa-MIR167a基因，使正常水稻出现分蘖角度增大、矮化、有效分蘖数减少的株型变化，证实了该基因的功能。还涉及通过改变该基因或其同源基因表达模式，调控水稻植株株型，从而提高水稻的产量。

背景技术

水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人以其为主食。同时，由于水稻具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物的共线性，而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。因此水稻功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍是人们面临的挑战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育是水稻增产的两次革命，但近几年来水稻的增产开始徘徊，如今正面临着第三次重大飞跃：理想株型和优势利用结合的超高产育种，即实现形态与机能兼顾利用。我国的“水稻超高产育种计划”实质也离不开株型问题。产量构成因素穗数、穗粒数和粒重，这三者部分程度上均受制于分蘖情况，因而分蘖是影响水稻与小麦等主要农作物单产的重要农艺性状之一。

分蘖是单子叶植物在生长发育过程中形成的一种特殊的分枝。通常在每个节的叶腋都有一个分蘖芽，分蘖芽的分化发生较早，在叶原基长成帽状时，其基部的一些细胞加速分裂形成隆起的分蘖原基。这些分蘖原基继续分化生长成为分蘖芽。但只有位于茎秆基部不伸长节间上的分蘖芽才能够伸长生长为分蘖；而茎杆上部伸长节间上的分蘖芽一般不伸长而处于休眠状态。若环境条件适宜，从稻茎的下部节开始自下而上分蘖芽都可发育成分蘖。在主茎上形成的分蘖称为一级分蘖，一级分蘖上可形成二级分蘖，依次类推。因此，一株水稻的最高分蘖数是全部蘖次、蘖位上的分蘖长成的总和。在正常(野生型)水稻中，以一级与二级分蘖为主，更高级别的分蘖则很少形成。稻秧生长至4个叶片时进入分蘖期。分蘖并非越多越好，后期分蘖一般是不能成穗的无效分蘖。(李学勇等，水稻分蘖的分子机理研究。中国科学院院刊，2003：274-276；任翔等，水稻分蘖能力QTL的定位。武汉大学学报(理学版)，2003，49：533-537)。

分蘖角度对于水稻的株型构成具有重要意义，与植物的形态、群体的栽培密度、光能利用率和风速等众多水稻生理生态特性有重大的关系。理想的群体结构必须是空间内茎叶排布合理，既有利于充分利用光能，又利于通风减少病虫害的发生。分蘖角度依其长相可分为束集型、紧凑型、松散型三类。张龙步等研究认为，分蘖旺盛期时分蘖角度小于20°为束集型，分蘖角度在21°～32°为紧凑型，分蘖角度大于33°为松散型(张龙步等，水稻田间试验方法与测定技术。辽宁科学技术出版社，1992，36-37)。

水稻分蘖是一个复杂的发育性状，分蘖是由侧生分生组织分化发育而来。一般认为，分蘖的产生分为两阶段，第一阶段是侧生分生组织的形成，第二阶段是侧生分生组织的生长和发育，其中由以第一阶段最为关键，而第二阶段受环境因素影响非常大。已有研究结果显示，植物体内各种激素包括生长素、细胞分裂素、脱落酸均在分蘖的形成过程中起到重要作用(Wang等，Molecular Basis of Plant Architecture.Annu.Rev.Plant Biol.，2008.59：253-279.)。

目前，已经克隆到的与分蘖角度密切相关的重要基因有：TAC1、PRGO1和LAZY1。TAC1是2007年被克隆的控制分蘖角度这一数量性状的主效基因，该基因在分蘖基部以及茎节处特异性表达。其第四个内含子中3’端剪切位点处的突变，使得TAC1表达水平下降，与野生型相比其侧芽基部呈更明显的不对称生长模式，从而产生分蘖角度接近0°的突变表型(Baisheng等，TAC1，a major quantitative trait locus controlling tillerangle in rice.The Plant Journal，2007，52：891-898)。2008年克隆的PRGO1基因编码一个C2H2类型锌指蛋白，该基因特异性的在侧生分生组织及顶端分生组织中表达。其开放阅读框内一个碱基的颠换造成编码蛋白序列的改变，从而产生分蘖角度增大的表型。组织切片观察显示，在该突变体中，侧芽基部的近地面和背地面呈对称生长模式，使得侧芽无法弯曲向上生长而呈现伏地生长模式(Lubin等，Control of a key transitionfrom prostrate to erect growth in rice domestication.Nature Genetics，2008，40：1360-1364；Jian等，Geneticcontrol of rice plant architecture under domestication.Nature Genetics，2008，40：1356-1369)。2007年克隆的LAZY1基因在茎和胚芽鞘中特异表达，其缺失型突变体侧芽处生长素的极性运输受到破坏，造成内源性生长素分布异常，从而出现分蘖角度增大的突变表型(Li等，LAZY1 controls rice shoot gravitropism throughregulating polar auxin transport.Cell Res，2007，17：402-410.)。

本发明所涉及的osa-MIR167a基因转录后形成一种特殊的小RNA分子miRNA167。miRNA是20世纪末期新发现的、生物体内源性的、约21nt长、不编码蛋白质的小RNA分子，它广泛存在于各个物种中并在进化上高度保守。miRNA通过碱基互补配对与下游靶基因mRNA结合，实现在转录后水平或翻译水平上的调控。已有研究表明，miRNA参与生物体发育的时空调控、细胞分化、信号转导、疾病、逆境应答等多种生物过程(Zhang等，MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants.J Cell Physiol，2007，210：279-289.)。拟南芥中的研究结果显示，miRNA167通过调控靶基因ARF6和ARF8保证花粉管的正常伸长和花粉囊的裂解，维持植株育性(Wu等，Arabidopsis microRNA167 controls patterns of ARF6 and ARF8expression，and regulates both female and male reproduction.Development，2006，133：4211-4218)，该过程还涉及茉莉酸合成酶DAD1的活性调节(Tabata等，Arabidopsis auxin response factor6 and 8 regulate jasmonic acidbiosynthesis and floral organ development via repression of class 1 KNOX genes.Plant Cell Physiol，51：164-175)。在水稻中，仅有报道表明存在miRNA167-ARF-GH3这一调控路径(Yang等，Evidence of anauxin signal pathway，microRNA 167-ARF8-GH3，and its response to exogenous auxin in cultured rice cells.Nucleic Acids Res，2006，34：1892-1899)，并无osa-MIR167a基因对株型调控的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，克隆和鉴定一种调控水稻株型的基因osa-MIR167a，通过控制osa-MIR167a基因或其同源基因在水稻中的表达模式来塑造水稻理想株型，达到增产的目的。

本发明鉴定的osa-MIR167a基因茎环结构DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其转录后形成的茎环结构前体RNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示，经转录及切割后形成的成熟osa-miR167a核心区域序列如序列表SEQ ID NO：3所示，同一基因家族具有相同功能另一核心序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

本发明鉴定的osa-MIR167a基因超量表达突变体表现为分蘖角度增大、矮化、有效分蘖数目减少等株型变化(见实施例5)。通过该基因表达谱分析，以及DNA、RNA水平鉴定，确定株型突变表型是由该基因的超量表达引起(见实施例3)。

本基因的鉴定对阐明水稻osa-MIR167基因家族的生物学功能有重要意义，有利于深入了解水稻株型调节的分子基础。

更详细的技术发明细节将由下述实施例给出。

本发明的优点和效果：

1.拟南芥基因家族ath-MIR167中的大部分基因虽已被克隆，其中部分成员被证实参与拟南芥生殖器官发育并与育性密切相关(Wu等，Arabidopsis microRNA167 controls patterns of ARF6 and ARF8 expression，and regulates both female and male reproduction.Development，2006，133：4211-4218；Peng等，Plant fertilitydefects induced by the enhanced expression ofmicroRNA167.Cell Res，2006，16：457-465.)。但在水稻品种几乎没有相关报道。本发明鉴定的osa-MIR167a基因对水稻株型有显著的影响，这对阐明osa-MIR167基因家族的生物学功能有重要意义。

2.虽然目前已克隆到了一些控制植物分蘖角度的基因，但对植物分蘖角度的分子机理仍不清楚。而本发明鉴定的osa-MIR167a基因能够控制水稻的分蘖角度，有利于深入了解水稻分蘖角度调控的分子基础，便于培育合理株型的水稻品种。

3.osa-MIR167a基因不仅影响分蘖角度，同时调控植株的株高、有效分蘖数和育性，该基因的功能研究对于植物重要农艺性状的遗传改良意义深远。

4.osa-MIR167a基因超量表达突变体使水稻分蘖角度大大地提高、株高明显变矮，说明osa-MIR167a基因对改变分蘖角度及株高效果明显，通过基因工程技术改变osa-MIR167a基因的表达模式能够调控水稻分蘖的形态建成及茎的生长，从而遗传改良水稻株型，达到增产的目的。

附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

SEQ.ID.NO：1是本发明鉴定的osa-MIR167a基因茎环结构DNA序列。

SEQ.ID.NO：2是本发明鉴定的osa-MIR167a基因转录形成的RNA茎环结构序列。

SEQ.ID.NO：3是本发明鉴定的osa-MIR167a基因转录剪切形成的成熟osa-miR167a核心序列。

SEQ.ID.NO：4是本发明鉴定的osa-MIR167a基因同一基因家族中具有相同功能的另一核心序列。

图1.水稻osa-MIR167a超量表达植株分蘖角度鉴定。图1A：苗期植株照片。左：osa-MIR167a基因超量表达阴性对照植株；右：osa-MIR167a基因超量表达阳性植株。图1B：成熟期分蘖角度统计。黑色柱代表osa-MIR167a基因超量表达阴性对照植株(167-)，灰色柱代表osa-MIR167a基因超量表达阳性植株(167+)。数值表示30株的分蘖角度平均值，误差为它们的标准误。结果显示，从苗期开始，osa-MIR167a基因超量表达阳性植株的分蘖角度就明显增大，至成熟期，分蘖角度平均增加21.0°。

图2.水稻osa-MIR167a超量表达植株成熟期地上部穗及节间长鉴定。图2A：左：osa-MIR167a基因超量表达阴性对照植株(167-)；右：osa-MIR167a基因超量表达阳性植株(167+)，图中白色箭头指示节所处位置。图2B：穗(P)及地上四节间(I为最上第一节间)长统计。黑色柱代表osa-MIR167a基因超量表达阴性对照植株(167-)，灰色柱代表osa-MIR167a基因超量表达阳性植株(167+)。数值表示30株的分蘖角度平均值，误差为它们的标准误。结果显示，osa-MIR167a基因超量表达阳性植株地上各部分不同程度的变短，积累造成植株变矮。

图3.水稻osa-MIR167a超量表达植株拷贝数检测。使用λ-EcoT14I digest DNA Marker，图中所示数字表示植株编号，黑色箭头表示选择的后续研究材料单拷贝植株2-8。

图4.水稻osa-MIR167a超量表达植株2-8家系基因组DNA的PCR阳性检测。所用引物为Hyg-L和Hyg-R，使用DL2000 Plus DNA Marker，图中所示数字表示植株编号，ZH11为水稻粳稻品种中花11号阴性对照。

图5.水稻粳稻品种中花11号osa-MIR167a相对表达量检测。横坐标表示根(R)、茎(S)、叶(L)、叶鞘(SH)、侧芽(TB)及幼穗(P)六个组织部位。

图6.水稻osa-MIR167a超量表达植株osa-MIR167a相对表达量检测。黑色柱代表osa-MIR167a基因超量表达阴性对照植株(167-)，灰色柱代表osa-MIR167a基因超量表达阳性植株(167+)。横坐标表示根(R)、茎(S)、叶(L)、叶鞘(SH)、侧芽(TB)及幼穗(P)六个组织部位。结果显示，osa-MIR167a基因超量表达阳性植株各个组织部位中osa-MIR167a基因表达量均得到不同程度提高，说明确实实现了超量表达的目的。

图7.构建osa-MIR167a超表达载体所用pU1301空载体图谱。

具体实施方式

实施例1osa-MIR167基因家族成员分析

根据miRBase(Release 16)(http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl？org＝osa)数据显示，osa-MIR167基因家族一共有10个成员，依次命名为osa-MIR167a至osa-MIR167j。已证实，osa-MIR167a和osa-MIR167h串联形成同一个cluster，而其他基因是单独零星分布于各个染色体。osa-MIR167基因家族各成员茎环结构长度及序列各异，但是经过剪切形成的核心osa-miR167序列只有两种，如SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示。osa-MIR167a至osa-MIR167c核心序列为SEQ ID NO：3，osa-MIR167d至osa-MIR167j核心序列为SEQ ID NO：4。两种核心序列仅在3’最后一位置上存在碱基的转换，已有研究证实，核心区域一至两个碱基的变换并不会造成功能上的差异。

表1osa-MIR167基因家族各成员分析

实施例2osa-MIR167a基因的表达分析

以20cm×25cm(长×宽)的密度将水稻粳稻品种中花11号种植于大田中。插秧后30天即处于分蘖旺盛期，抽提其根(R)、茎(S)、叶(L)、叶鞘(SH)、侧芽(TB)、幼穗(P)这六个组织部位的RNA样品，通过miRNA stem-loop RT-PCR(Chen等，Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.NucleicAcids Res，2005，33：e179)的方法检测osa-MIR167a基因的表达量，设置3次生物学重复、2次技术重复。所用引物为：MIR167a ST-RT primer：

5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGATC3’，MIR167a Forward：

5’CTAATGAAGCTGCCAGCATG3’，ST-R：5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’。以U6为内参，对应引物为

U6-L：3’TACAGATAAGATTAGCATGGCCCC5’，U6-R：3’GGACCATTTCTCGATTTGTACGTG5’。反转录采用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，体系为5.3μl：20ng/μl RNA模版2μl，2×TSReaction Mix 2.5μl，Trans Enzyme 0.25μl，MIR167a ST-RT primer/U6-R 0.25μl，DEPC 0.3μl。于ABI 9700上进行反应，程序为：16℃ 15min，42℃ 50min，72℃ 15min。在上述反转录产物中直接进行real-time PCR，real-time PCR采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)试剂盒，反应体系为25.3μl：反转录产物5.3μl，SYBRPremixEx Taq 12.5μl，ROXReferenceDyeII0.5μl，MIR167aForward/U6-L 1μl，ST-R/U6-R 1μl，ddH₂O 7μl。于ABI 7500上进行反应，程序为：95℃10s；95℃5s，60℃34s，共反应40个循环。结果如图5所示，在粳稻品种中花11号中，osa-MIR167a基因在叶片中的表达水平最高，往下依次为叶鞘、茎、幼穗、侧芽和根。

实施例3超量表达osa-MIR167a基因验证其功能

1.osa-MIR167a基因超表达载体的构建

所用载体是本实验室构建的pU1301。pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRRreceptor kinase-like protein.Plant Journal.37：517-527)基础上改造的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(见图7)。pCAMBIA1301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。采用PCR方法，直接从水稻基因组上对osa-MIR167a茎环结构序列进行扩增，为保证茎环结构能在体内正确转录并切割，扩增序列包含茎环结构前170bp和茎环结构后185bp。所用引物为

osa-miRNA 167aS：5’CTTGGTACCTTCTTCCATCAAGCTCACTCA3’，

osa-miRNA 167aA：5’CTTGGATCCTGCAACAACTTACCCTGTACC3’(下划线表示添加的酶切位点Kpn1、BamH1)。扩增序列如下：

TATCATGAGCACAAAAACTCTTCTGCTTCCCATGTATGTAGCTGTAGCTTCTTCAGTATACTTTGCTCTT

GTTTCAGTAGTGTGCATCTCTCTAGTTATTGCTAGCTAGTACTCCAAAGAGTGAGATGAAATTAGTGGA

TGAATTATAAGTGAGATGATGATGATGGTGCTAGTGTGAATGAGTGAAGCTGCCAGCATGATCTAGCTC

TGATTAATCGGCACTGTTGGCGTACAGTCGATTGACTAATCGTCAGATCTGTGTGTGTAAATCACTGTT

AGATCATGCATGACAGCCTCATTTCTTCACACTGTTGGGCATGTGTTAAACTTGATTAGCTGTGCACAG

TACTGCAAGAGGGTACAGACAGGATAAGGTGATGCATCTATGATTTATCTCTGCATGTTTGATGTTTTG

ATTACTTTGTACAAGCTTGATTAGTTGTACAATACTGCAGAAAGAGTACAAGGTACAGGGTAAGTTGT

TGCAGGATCCAAG(下划线表示osa-MIR167a形成茎环结构序列)。PCR反应体系的总体积为20μl，水稻基因组DNA模板1μl(约50ng)、10×PCR Buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl，10μm引物各0.3μl，rTaq(TaKaRa)0.3μl，dd H₂O 14.6μl。反应程序为：94℃5min，94℃45s、55℃45s、72℃1min、35cycles，72℃5min，扩增10管，收集PCR产物于1.5ml离心管纯化，加等体积24∶1氯仿异戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，-20℃放置30分钟，12000rpm离心20分钟，弃上清，加500μl 75％乙醇放置5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，加75μl ddH₂O溶解。把纯化的PCR产物及pU1301载体酶切，体系：总体积100μl，PCR产物或载体质粒75μl，限制性内切酶BamH130U，限制性内切酶Kapn130U，10×K Buffer 5μl，ddH₂O 16μl，37℃酶切5小时。纯化酶切产物，方法同上，最后加10μl ddH₂O溶解。连接反应：10μl PCR产物全部用于连接反应，载体0.5μl，2U T4 Ligase，5×Ligase Buffer 3μl，总15μl体积，连接24小时。取1μl连接产物，电压18000V，电转到大肠杆菌DH10β(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，加800μlLB培养基，复苏45分钟，取200μl涂于含卡那霉素的LA平板，37℃，过夜。挑单克隆，扩大培养抽质粒，酶切验证，酶切方法同上。PCR验证，体系程序与从水稻基因组扩目标基因相同。挑阳性克隆，把构建好的载体电转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(购自MBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)抽质粒，PCR验证，取750μl含构建好载体的农杆菌菌液加等体积的50％甘油混匀，-70℃保存。将含有载体pU1301-MIR167a的农杆菌菌株命名为EHA105-pU1301-MIR167a。

2.遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation ofrice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)将超量表达菌株EHA105-pU1301-MIR167a导入水稻粳稻品种中花11号(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Zhonghua 11)愈伤中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方见申请人已经公开的专利，专利名称为：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5；公开号：CN1995346)。

实施例4超表达osa-MIR167a基因的转基因植株分子分析

1.转基因植株拷贝数检测

将超量表达菌株EHA105-pU1301-MIR167a导入水稻粳稻品种中花11号的愈伤中，共获得转化苗40株，利用Southern杂交(具体操作参考：Wu等，Development of enhancertrap lines for functional analysis ofthe rice genome.2003，Plant J，35：418-427)分析了这些超表达转基因植株的拷贝数(见图3)。结果显示，在获得的40株转基因植株中，5株阴性植株，35株阳性植株，阳性植株中单拷贝植株共有12株。选取2-8号单拷贝植株分离后代为后续研究材料。

2.转基因植株突变表型与osa-MIR167a在DNA和RNA水平共的分离检测

以pU1301载体上潮霉素片段为筛选标记，对2-8号单拷贝植株分离后代进行阳性检测。所用引物为：Hyg-L：5’ATTTGTGTACGCCCGACAGT3’，Hyg-R：5’ATTCCGGAAGTGCTTGACAT3’。PCR反应体系为20μl：模版DNA1μl，10×PCR Buffer 2μl，2mmol/L dNTP 1.5μl，10μm Hyg-L 0.3μl，10μm Hyg-R 0.3μl，rTaq(TaKaRa)0.3μl，dd H₂O 14.6μl；反应程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，共反应30个循环；72℃7min，25℃1min。PCR部分胶图见图4。PCR结果为阳性的植株(167+)均出现分蘖角度增大、矮化的表型，而结果为阴性的植株(167-)则为正常野生型的表型，说明其在DNA水平上是共分离的。

采用与实施例2同样的方法，分别检测阳性植株(167+)、阴性植株(167-)在分蘖旺盛期根(R)、茎(S)、叶(L)、叶鞘(SH)、侧芽(TB)、幼穗(P)这六个组织部位osa-MIR167a基因的表达水平。结果显示(图6)，阴性植株(167-)中osa-MIR167a基因的表达水平与粳稻品种中花11号趋势类似，说明转基因操作并未产生其他效应。另外，与阴性植株(167-)相比，阳性植株(167+)各组织中osa-MIR167a的表达量均出现了不同程度的提高，说明实现了osa-MIR167a基因在植株体内的超量表达。并且osa-MIR167a基因表达水平与表型能一一对应，表达量高的植株均出现分蘖角度增大、矮化的表型，而表达量无明显变化的植株为正常野生型的表型，说明其在RNA水平上也是共分离的。

在DNA及RNA水平验证共分离的osa-MIR167a超量表达阳性水稻植株上收获种子，申请人将所收获的种子命名为“水稻突变体种子pU1301-MIR167a+”，该种子于2011年3月29日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号CCTCC NO：P201106。

实施例5超表达osa-MIR167a基因的转基因植株表型考察

1.分蘖角度测量

本发明分蘖角度定义为水稻成熟期最左侧、最右侧有效分蘖之间夹角。分别对30株osa-MIR167a超表达阴性对照植株(167-)和阳性植株(167+)进行测量，结果显示，与超表达阴性对照植株相比，阳性植株分蘖角度明显增大，增幅达76.1％。参见图1及表2。

表2osa-MIR167a超表达阴性对照植株(167-)和阳性植株(167+)分蘖角度、株高、有效分蘖数及结实率统计

2.株高、穗部和各节间长度测量

分别对30株osa-MIR167a超表达阴性对照植株(167-)和阳性植株(167+)植株株高进行测量，结果显示，与超表达阴性对照植株相比，阳性植株株高平均下降34.2cm，减幅达36.0％。参见表2。

为了进一步判断造成株高下降的原因，分别测量30株osa-MIR167a超表达阴性对照植株(167-)和阳性植株(167+)植株地上部分穗部和各节间长度(从穗往下为第一节间)。结果显示(图2及表3)，超表达阳性植株穗及各节间长度均出现了不同程度的减少，其中以第二、三、四节间长减幅最大均超过50.0％。

表3osa-MIR167a超表达阴性对照植株(167-)和阳性植株(167+)植株穗部及节间长测量结果

3.有效分蘖数统计

完全成熟后，分别统计30株osa-MIR167a超表达阴性对照植株(167-)和阳性植株(167+)植株有效分蘖数，结果显示(见表2)，超表达阳性植株有效分蘖数明显减少，减幅为44.9％。

4.结实率统计

分别对30株osa-MIR167a超表达阴性对照植株(167-)和阳性植株(167+)植株主穗结实率进行统计，结果显示(见表2)，与超表达阴性植株相比，阳性植株结实率明显下降，仅为阴性植株的21.1％。

实施例6osa-MIR167a基因的功能分析

osa-MIR167a超量表达植株均出现分蘖角度增大、矮化、育性降低的突变表型。说明osa-MIR167a基因具有调控水稻分蘖角度的功能，同时还具有调控水稻株高和育性的功能。

通过遗传操作改变osa-MIR167a基因在水稻中的表达量，来实现人为调控水稻分蘖角度大小及株高的目的，形成理想株型。根据不同水稻品种的要求，增大或减小水稻的分蘖角度，提高或者降低株高，形成理想的水稻株型，从而达到增产的目的。控制水稻株型基因osa-MIR167a可以在转基因水稻中应用也可以在转基因水稻种子中应用，培育具有优良株型的水稻品种。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

3)Fe₂EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)

2，4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA  100mg.

1ml1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖  125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS    0.392g

DMSO  10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值至5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值至6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的G-418(Sulfate)和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值至5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)15分钟；

(2)灭菌水洗种子4-5次；

(3)将种子放在诱导培养基上；

(4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度26±1℃。

农杆菌培养

(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温度28℃；

(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

农杆菌侵染

(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；

(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度19-20℃。

愈伤洗涤和选择培养

(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；

(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

分化

(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；

(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5-7周。

生根

(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的儿天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载大田。

以上所述仅为本发明的若干个具体实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应当认为是本发明的保护范围。

名词解释：

osa-MIR167：水稻MIR167基因家族；

osa-MIR167a：水稻MIR167基因家族成员之一；

osa-miR167a：osa-MIR167a基因转录剪切后形成的21碱基长核心RNA片段；

miRNA167：全称为microRNA167，水稻体内osa-MIR167a基因转录剪切而来具有生物学功能的RNA片段，其序列同osa-miR167a。

Claims (1)

1.osa-MIR167a基因在调控水稻分蘖角度增大、矮化、有效分蘖数减少和结实率下降的株型改良中的应用，其特征在于，所述的osa-MIR167a基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，转录剪切后形成的核心序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

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